使用探针法 qPCR，快速、灵敏、精准的对目标 RNA 进行检测和定量

 Luna 通用探针一步法 RT-qPCR 试剂盒（无 ROX）经过优化，适用于水解探针法的 RNA 实时定量。一步法 RT-qPCR 为 RNA 检测和定量提供了一种便捷、强大的方法。在同一管中，RNA 首先由反转录酶转化为 cDNA，然后使用 DNA 依赖型 DNA 聚合酶扩增 cDNA，从而可以进行 qPCR 定量。基于探针法的 qPCR / RT-qPCR 原理是利用聚合酶的 5´ → 3´ 外切酶活性，将淬灭的目标特异性探针切断发出荧光，并实时监测荧光值的增加，以测量 PCR 每个循环中的 DNA 扩增。在荧光信号显著超过背景荧光的位置，可以确定 Cq 值。Cq 值可用于评估两个或多个样品的靶基因相对丰度，通过已知稀释浓度样品的标准曲线，可对靶基因进行绝对定量。

 

使用 Luna 通用探针一步法 RT-qPCR 产品检测人 GAPDH 基因，模板为 8 个 10 倍梯度稀释的

Jurkat 总 RNA（1 μg– 0.1 pg），每个浓度的样品做 8 个重复。实验按照试剂盒建议的操作流程进行，反应中包含一个 55℃ 温育 10 分钟的反转录步骤以便于 Luna WarmStart 反转录酶发挥作用。NTC = 无模板对照。

图 2：NEB 的 Luna RT-qPCR 产品在多重检测中功效强大

 使用 Luna Universal Probe One-Step RT-qPCR Kit 分别检测 GAPDH 基因、核糖体蛋白 L32g 和 PI-3 激酶相关的 SMG1 基因的表达情况。模板为 7 个分别 10 倍稀释的 Jurkat 总 RNA （1 μg – 1 pg），每个浓度的样品做 4 个重复。实验结果如上图所示，左边是叠加的结果，右边是每个基因单独的检测结果。无论是单重还是多重 qPCR，低拷贝的模板（SMG1）使用的引物浓度为 0.4 μM，高拷贝的模板（L32G 和 GAPDH）使用的引物浓度为 0.2 μM。单重 qPCR 可以直接比较，多重 qPCR 可以比较拷贝数的差异。NTC = 阴性对照

图 3：通过与市场上探针法 RT-qPCR 试剂相比，Luna 产品展现出更好的稳定性和特异性

使用市售的 RT-qPCR 试剂对 7 个靶标（丰度、长度和 GC 含量不同）进行测试。测试均根据产品说明书进行，数据来源于两个实验人员。实验结果对扩增效率、低起始量和缺乏无模板对照的扩增进行了评估（ΔCq = 无模板对照的平均 Cq – 最低起始量的平均 Cq）。此外，还评估了稳定性、可重复性、所有扩增曲线质量（质量分数）。柱状图展示了达到可接受的性能标准的目标百分比。图中展示了 NEB 和其它供应商的结果：Quanta，qScript™ XLT 1-Step RT-qPCR ToughMix®；ABI，TaqMan® RNA-to-Ct 1-Step Kit；QIAGEN，QuantiFast® Probe RT-PCR Kit；Bio-Rad，iTaq™ Universal Probes One-Step Kit；Promega®，GoTaq® Probe 1-Step RT-qPCR System。NEB 的 Luna 通用探针一步法 RT-qPCR 试剂盒*性能优于其它测试试剂。

 

 

*数据来源于 Luna 通用探针一步法 RT-qPCR 试剂盒（NEB #E3006）。Luna 通用探针一步法 RT-qPCR 试剂盒（无 ROX）（NEB #E3007）的性能与之相同

 以下试剂随产品提供

 -20°C

Luna^® SARS-CoV-2 多重 RT-qPCR 检测试剂盒用于 SARS-CoV-2 的实时 RT-PCR 检测

Ÿ   对 2019-nCoV_N1 和 2019-nCoV_N2 靶标以及人源 RNase P 基因进行多重检测，支持高通量检测流程

Ÿ   通过将 RNase P 内标的反向引物设计为跨外显子序列，降低基因组 DNA 的扩增背景

Ÿ   4X 浓度的 RT-qPCR 预混液支持更大的上样量，提高检测灵敏度

Ÿ   Luna 温启动反转录酶和热启动 Taq 酶共同提升反应特异性和功效，可在室温条件下建立体系

Ÿ   预混液中包含热敏 UDG 和 dUTP，防止残留污染

Ÿ   支持混合样品池检测，且不影响灵敏度

Ÿ   欲了解 NEB 如何支持 COVID-19 研究，请点击 COVID-19 research，其中详述了多种 RT-qPCR 病毒检测方案

使用 Luna SARS-CoV-2 多重 RT-qPCR 检测试剂盒，在 96 孔板上检测 94 个不同的样本。结果通过荧光通道显示。 

Luna^® SARS-CoV-2 多重 RT-qPCR 检测试剂盒经过优化，适用于水解探针法的 SARS-CoV-2 实时 RT-PCR 检测。在同一管中，RNA 首先由反转录酶转化为 cDNA，然后使用 DNA 依赖型 DNA 聚合酶扩增 cDNA，从而可以进行 qPCR 定量。基于探针法的 qPCR / RT-qPCR 原理是利用聚合酶的 5´ → 3´ 外切酶活性，将淬灭的目标特异性探针切断发出荧光，并实时监测荧光值的增加，以测量 PCR 每个循环中的 DNA 扩增。在荧光信号显著超过背景荧光的位置，可以确定 Cq 值。Cq 值可用于评估两个或多个样品的靶基因相对丰度。

图 1：Luna^® SARS-CoV-2 多重 RT-qPCR 检测试剂盒组分

图 2：Luna SARS-CoV-2 多重 RT-qPCR 检测试剂盒可在一个反应中同时检测两个 N 基因位点和人源 RNase P 基因

A. SARS-CoV-2 的两组引物探针序列源于 CDC 提供，其中探针改为两种荧光标记（N1: HEX, N2: FAM）。

B. RNase P 内标包含 Cy5 标记的探针和重新设计的反向引物。该引物的跨外显子设计，避免了人基因组 DNA（含有 2.4 kb 内含子）的扩增干扰。

SARS-CoV-2 引物/探针混合物包含 SARS-CoV-2 病毒中 N 基因两个区域的引物和探针 [基于美国疾病控制与预防中心（CDC）提供的序列]。两条探针带有不同的荧光标记（N1: HEX;N2: FAM），可在 qPCR 仪器的两个不同通道中同时观测。为了确保检测样品的完整性和无抑制物，还包含一套用于扩增人源 RNase P 基因的内标（IC）引物和探针。该靶基因的反向引物与 CDC 的设计不同，修改为跨外显子序列，以降低残留基因组 DNA 的扩增背景。IC 的扩增可在 Cy5 通道观测。产品同时还提供阳性对照（PC）（含有 SARS-CoV-2 N 基因的质粒）。

该试剂盒包含 Luna 通用探针一步法 RT-qPCR 4X 预混液，含 UDG（NEB #M3019），支持更大的上样量和混合样品池检测，对灵敏度和特异性的影响极小。该预混液包含一步法 RT-qPCR 的所有组分，和独特校对参比染料，可与多种 qPCR 仪器兼容，包括需要高 ROX 或低 ROX 参比信号的仪器。独具特色的是：预混液还包含防止残留污染的热敏 UDG 和 dUTP，以及有助于体系建立的无荧光可见示踪染料。该示踪染料与 qPCR 常用荧光基团的光谱没有重叠，因此不会干扰实时检测。

图 3：Luna SARS-CoV-2 多重 RT-qPCR 检测试剂盒的检测下限比 TaqPath™1-Step RT-qPCR Master Mix, CG 更低

将下述两种试剂盒进行检测下限（LOD）比较：使用 Luna SARS-CoV-2 多重 RT-qPCR 检测试剂盒对 2019-nCoV_N1（HEX）和 2019-nCoV_N2（FAM）进行多重 RT-qPCR 检测，实验设置参照 E3019 产品说明书；使用 TaqPath 1-Step RT-qPCR Master Mix, CG 对 2019-nCoV_ N1（FAM）和 2019-nCoV_N2（FAM）进行单重 RT-qPCR 检测，实验设置参照美国疾控中心 2019-nCoV 实时 RT-PCR 诊断指南。实验样品：将 Twist 公司合成的 SARS-CoV-2 RNA 对照 2 掺入到 10 ng Jurkat 总 RNA 中。实验仪器为 Applied Biosystems^® 7500 Fast 实时荧光定量仪 （96 孔板，20 µl 反应体系）。结果显示 Luna 试剂盒对两个靶标的检测下限为 5 拷贝/反应，而 TaqPath 为 10 拷贝/反应。

图 4：Luna SARS-CoV-2 多重 RT-qPCR 检测试剂盒适用于纯化 RNA 的混合样品池检测

通过将一份 2 µl 的模拟阳性样品（10 拷贝的 Twist 合成 SARS-CoV-2 RNA 对照 2 掺入到 10 ng Jurkat 总 RNA）与四份 2 µl 的模拟阴性样品（仅含 10 ng Jurkat 总 RNA）混合，制备出包含五份样品的混合样品池。将混合样品池（10 µl）与单独样品（2 µl，含 10 拷贝 N 基因和 10 ng Jurkat 总 RNA）进行性能比较。实验仪器为 Applied Biosystems^® 7500 Fast 实时荧光定量仪（96 孔板，20 µl 反应体系）。N1 和 N2 靶标的扩增曲线显示，单独和掺入混合样品池的阳性样品 Cq 值相似。由于混合样品池中人源总 RNA 量是单独样品的 5 倍，因此正如预期，混合样品池 RNase P 基因的 Cq 值更小。

图 5：Luna SARS-CoV-2 多重 RT-qPCR 检测试剂盒的检测下限（LOD）

 通过 Luna SARS-CoV-2 多重 RT-qPCR 检测试剂盒对多种 SARS-CoV-2 RNA 对照样品中的 2019-nCoV_N1（HEX）和 2019-nCoV_N2（FAM）靶标进行多重 RT-qPCR 检测，获得该试剂盒的检测下限（LOD）。实验样品：将 Twist 公司合成的 SARS-CoV-2 RNA 对照 2 掺入到 10 ng Jurkat 总 RNA 中（图 A）。两位实验人员同时使用三种仪器进行平行测试（96 孔板，20 µl 反应体系）：Applied Biosystems（ABI）7500 Fast Real-Time instrument、ABI QuantStudio™ 6 Flex Real-Time PCR system，以及 Bio-Rad CFX instrument。结果显示：Twist RNA 的检测下限均为 5 拷贝/反应。此外还测试了其它样品类型（图 B）：SARS-CoV-2 基因组 RNA 源自 ATCC（ATCC® VR-1986D™）、NIST（Fragment 1 – Includes SARS-CoV-2 sequence: 25949-29698 of isolate USA-WA1/2020），以及 SeraCare AccuPlex™ SARS-CoV-2 Verification Panel V2（0505-0132）。上述 RNA 均由 Monarch 总 RNA 小量提取试剂盒（NEB# T2010）提取。所有 RNA 样品均掺入到 10 ng Jurkat 总 RNA，使用 ABI 7500 Fast Real-Time instrument 检测。假设 RNA 提取的回收率为 100%，则各样品检测下限为：ATCC 的 SARS-CoV-2 基因组 RNA 为 2.5 GE（genomic copy equivalent）、NIST SARS-CoV-2 测试样品为 1×107 倍稀释、SeraCare AccuPlex 样品为 15 拷贝。

图 6：与 TaqPath 1-Step RT-qPCR Master Mix CG相比，Luna 通用探针一步法 RT-qPCR 4X 预混液，含 UDG 对 SARS-CoV-2 N2 靶标的检测性能更好

A. 使用 Luna 通用探针一步法 RT-qPCR 4X 预混液，含 UDG 对 2019-nCoV_1（HEX）和 2019-nCoV_N2（FAM）进行单重 RT-qPCR，实验设置参照 E3019 产品说明书。B. 使用 TaqPath 1-Step RT-qPCR Master Mix, CG 对 2019-nCoV_N1（FAM）和 2019-nCoV_N2（FAM）进行单重 RT-qPCR，实验设置参照美国疾控中心 2019-nCoV 实时 RT-PCR 诊断指南。实验样品：将 Twist 公司合成的 SARS-CoV-2 RNA 对照 2 掺入到 10 ng Jurkat 总 RNA 中，实验评估了样品 5-log 浓度范围扩增结果。实验仪器为 Applied Biosystems^® 7500 Fast 实时荧光定量仪（96 孔板，20 µl 反应体系）。在上述条件下，Luna 和 TaqPath 对 N1 靶标的扩增结果都很好。对于 N2 靶标，尽管 TaqPath 可检测 10 个拷贝样品，但线性度并不理想，而 Luna 线性度更好，且 Cq 值出现更早。

Luna 通用探针一步法 RT-qPCR 4X 预混液，含 UDG 结合了热启动 Taq DNA 聚合酶和具有新型温启动活性的反转录酶，可通过基于适配体的可逆抑制来双重控制酶的活性，这种温控活化机制可避免热循环前的非特异引物结合和扩增，从而让室温建立体系更安全。经改造的 Luna 温启动反转录酶具有更高的热稳定性，最佳反应温度为 55°C。

图 7：Luna RT-qPCR 预混液的室温稳定性让实验流程更灵活

使用 Luna 通用探针一步法 RT-qPCR 4X 预混液，含 UDG 对2019-nCoV_N1（HEX）和 2019-nCoV_N2（FAM）进行单重（SP）和多重（MP）RT-qPCR，实验设置参照 E3019 产品说明书。使用 TaqPath 1-Step RT-qPCR Master Mix, CG 对 2019-nCoV_N1（FAM）和 2019-nCoV_N2（FAM）进行单重 RT-qPCR，实验设置参照美国疾控中心 2019-nCoV 实时 RT-PCR 诊断指南。实验样品：将 Twist 公司合成的 SARS-CoV-2 RNA 对照 2 掺入到 10 ng Jurkat 总 RNA 中，实验评估了样品 5-log 浓度范围（100,000-10 拷贝）的扩增结果。上机前，将 RT-qPCR 反应体系分别室温孵育 0、2、5、24 小时。实验仪器为 Applied Biosystems® 7500 Fast 实时荧光定量仪（96 孔板，20 µl 反应体系）。结果显示 Luna 通用探针一步法 RT-qPCR 预混液孵育 0-24 小时的实验结果一致，而 TaqPath 孵育 2 小时后，Cq值延迟≥1，实验效果随孵育时间的延长而下降。

无需纯化，直接从细胞到 RNA 定量

•  试剂盒包含 100 次裂解反应和 500 次染料一步法 RT-qPCR 反应

•   有效裂解多种细胞系的 10 至 10 万个细胞

•   仅需 15 分钟即可完成细胞裂解、RNA 释放和基因组 DNA 去除

•  联合使用 LunaWarmStart^® RT 和 Hot Start Taq，提高了热稳定性，且可在室温下建立反应体系

•   可单独购买裂解模块：Luna Cell Ready 裂解模块（NEB＃E3032）

 Luna Cell Ready 染料一步法 RT-qPCR 试剂盒为直接染料法 RNA 检测和定量提供了所有必要的组分，且无需进行 RNA 提取和纯化。Luna Cell Ready 染料一步法 RT-qPCR 试剂盒包括：1）Luna Cell Ready 裂解模块（NEB＃E3032S）和 2）Luna 通用一步法 RT-qPCR Kit（NEB＃E3005L）。

细胞培养常用于替代活体生物来分析基因表达或对治疗的反应。传统上使用柱提法或化学试剂法从处理过的细胞中提取和纯化 RNA。

Luna Cell Ready 裂解模块整合了 DNase I 和 Luna Cell Ready 蛋白酶的功能，仅需 15 分钟即可完成细胞裂解、RNA 释放和基因组 DNA 去除。裂解模块包含独特的 Luna Cell Ready RNA 保护试剂，可在细胞裂解过程中保持 RNA 完整性。50 µl 裂解体系下可对 10-10 万个细胞进行裂解反应。2 µl 裂解产物 （相当于 0.2–4000 个细胞的 RNA） 即可实现 20 µl 体系的 RT-qPCR 反应。与其它 Luna 产品一样，裂解缓冲液包含惰性蓝色示踪染料，使整个加样流程可视化。 

Luna 通用一步法 RT-qPCR 试剂盒可兼容大多数实时荧光定量仪器的 SYBR/FAM 荧光通道，进行目标 RNA 的实时定量分析。在该试剂盒中，联合使用热启动 Taq DNA 聚合酶与新型 Luna WarmStart 反转录酶，通过适配体可逆抑制来双重控制酶活性。Luna 通用一步法 RT-qPCR 试剂盒可以直接将 Luna Cell Ready 裂解模块制备的细胞裂解物中的 RNA 转录本进行检测和定量。 

下表列出的细胞系可使用 Luna Cell Ready 裂解模块裂解。这些细胞进行 5 log 梯度稀释（100000-10 细胞/50 µl 裂解反应），并取 1 ul 裂解产物进行 20 µl 体系的一步法 RT-qPCR 反应。每个细胞系的线性结果区域显示在最后一列。此外，经测试一些昆虫细胞系也能用上述裂解液裂解。

表一：经验证过的细胞系

图一：Luna Cell Ready 一步法 RT-qPCR 实验流程

Luna Cell Ready 一步法 RT-qPCR 试剂盒提供了直接从细胞（50 µl 体系可裂解高达 10 万个细胞）到 RNA 检测和定量的所有组分。Luna Cell Ready 裂解模块整合了 DNase I 和 Luna Cell Ready 蛋白酶的功能，仅需 15 分钟即可完成细胞裂解、RNA 释放和基因组 DNA 去除。2 µl 裂解产物（相当于 0.2–4000 个细胞中的 RNA）即可实现 20 µl 体系的 RT-qPCR 反应。

图二：Luna Cell Ready 染料一步法 RT-qPCR 试剂盒可直接对 5-log 梯度稀释细胞的裂解物进行灵敏精准的 RNA 定量

梯度稀释的 A549 细胞（100,000-10）使用标准反应条件（37°C 裂解 10 分钟，25°C 灭活 5 分钟），在 50 µl 的 Luna Cell Ready 裂解体系（NEB＃E3032）中裂解。使用 Luna 通用一步法 RT-qPCR 试剂盒（NEB＃E3005）加入 1 μl 细胞裂解物（相当于 20 μl RT-qPCR 反应体系中 0.2-2,000 个细胞）对目的基因（GOI）进行定量，每个浓度的样品都做了重复。结果展示了两个高频靶标（A）：β-actin 和一个低频靶标（B）：SMG1。右图展示了扩增效率（E）和线性关系（R²）。

图三：Luna Cell Ready 染料一步法 RT-qPCR 试剂盒与提纯 RNA 均可对 5-logs 细胞梯度样品进行精准可信的 RNA 定量

梯度稀释的 A549 细胞（100,000-10）使用标准反应条件（37°C 裂解 10 分钟，25°C 灭活 5 分钟），在 50 µl 的 Luna Cell Ready 裂解体系（NEB＃E3032）中裂解，也可使用柱提法提纯 RNA。A.使用 Luna 通用一步法 RT-qPCR 试剂盒（NEB＃E3005）对目的基因（GOI）进行定量，加入 1 μl 细胞裂解物（实心圆）或纯化的 RNA（空心圆）（相当于 20 µl RT-qPCR 反应中有 0.2-2,000 个细胞），每个浓度的样品都做了重复。左图：在 5-logs 细胞梯度中检测高频靶标 β-actin和两个低频靶标 ARF3 和 Tubulin。每个靶标的扩增效率在图中左下方显示。B.在 A 图中 5-log 细胞梯度稀释样品的目标基因相对于 β-actin 的 Cq 值（ΔCq（GOI）），平均 Cqs 通过横线指示。

图四：Luna Cell Ready 染料一步法 RT-qPCR 试剂盒的扩增效率及灵敏度均优于其它市售的细胞裂解一步法 RT-qPCR 试剂盒。

梯度稀释的 A549 细胞（100,000-10）使用标准反应条件，在 50 µl 的 Luna Cell Ready 裂解体系（NEB＃E3032）中裂解。相同的样品使用 Bio-Rad（SingleShot SYBR Green One-Step Kit, #172-5095）、Qiagen（SingleShot SYBR Green One-Step Kit, #172-5095）和 Thermo Fisher（Cells-to-CT 1-Step PowerSYBR Green Kit, A25600）并分别按照厂家说明书进行裂解。然后使用每个试剂盒中的一步法 RT-qPCR 模块，加入 1 μl 细胞裂解物（相当于 20 μl RT-qPCR 反应体系中 0.2-2,000 个细胞），对目的基因进行定量，每个浓度的样品都做了重复。对于所有试剂盒，5-log 梯度稀释细胞均显示了 β-actin,（高频靶标）和 RPL32、Tubulin （低频靶标）的扩增。为了使结果标准化，将总荧光的 12％ 设置为阈值。图中显示了扩增效率（E）及最高与最低的 Cq 值。

图五：对 24 个靶标测试显示，Luna Cell Ready 染料一步法 RT-qPCR 试剂盒与其它市售的细胞裂解一步法 RT-qPCR 试剂盒相比，灵敏度最高。

2500 个 A549 细胞，使用标准反应条件，在 50 µl 的 Luna Cell Ready 裂解体系（NEB＃E3032）中裂解。或使用市售的 Bio-Rad（SingleShot SYBR Green One-Step Kit, #172-5095）、Qiagen（SingleShot SYBR Green One-Step Kit, #172-5095）和 Thermo Fisher（Cells-to-CT 1-Step PowerSYBR Green Kit, A25600）并分别按照厂家说明书进行裂解。每个试剂盒做两个生物重复。然后使用来自每个试剂盒的一步法 RT-qPCR 模块，加入 1 μl 细胞裂解物（相当于 20 µl RT-qPCR 反应中 50 个细胞），对 24 个目标基因进行定量，每个生物样品均做重复。结果显示了 NEB （实心橙色圆圈），BioRad（空心正方形），Qiagen（空心三角形）和 Thermo Fisher（十字形）的平均 Cqs。为了使结果标准化，将总荧光的 12％ 设置为阈值。Luna Cell Ready 染料一步法 RT-qPCR 试剂盒显示了不同表达水平下 23/24 的基因 Cq 值最早，平均比 Bio-Rad 快2.3 Cq，比 Qiagen 快 3.8 Cq，比 Thermo Fisher 快 3.6 Cq。

试剂盒组分

随该产品提供的试剂

实验需要但不提供的试剂耗材

•   磷酸盐缓冲液（PBS）

•   目标特异性引物

•   细胞

•   Eppendorf 管，PCR 联管

•   PCR 板

•   qPCR 仪器

•  移液器和枪头（为减少交叉污染，应使用带滤芯的枪头）

   储存温度

  -20℃

 无需纯化，直接从细胞到 RNA 定量

•   试剂盒包含 100 次裂解反应和 500 次探针一步法 RT-qPCR 反应

•   有效裂解多种细胞系的 10 至 10 万个细胞

•  仅需 15 分钟即可完成细胞裂解、RNA 释放和基因组 DNA 去除

•   配合使用 LunaWarmStart^® RT 和 Hot Start Taq，提高了热稳定性且可在室温下建立反应体系

•   可单独购买裂解模块：Luna Cell Ready 裂解模块（NEB＃E3032）

 Luna Cell Ready 探针一步法 RT-qPCR 试剂盒为直接探针法 RNA 检测和定量提供了所有必要的组分，且无需进行 RNA 提取和纯化。Luna Cell Ready 探针一步法 RT-qPCR 试剂盒包含两个模块：1）Luna Cell Ready 裂解模块（NEB＃E3032S）和 2）Luna 通用探针一步法 RT-qPCR Kit（NEB＃E3006L）。

细胞培养常用于替代活体生物来分析基因表达或对治疗的反应。传统上使用柱提法或化学试剂法从处理过的细胞中提取和纯化 RNA。

Luna Cell Ready 裂解模块整合了 DNase I 和 Luna Cell Ready 蛋白酶的功能，仅需 15 分钟即可完成细胞裂解、RNA 释放和基因组 DNA 去除。裂解模块包含独特的 Luna Cell Ready RNA 保护试剂，可在细胞裂解过程中保持 RNA 完整性。50 µl 裂解体系下可对 10-10 万个细胞进行裂解反应。2 µl 裂解产物 （相当于 0.2–4000 个细胞的 RNA） 即可实现 20 µl 体系的 RT-qPCR 反应。与其它 Luna 产品一样，裂解缓冲液包含惰性蓝色示踪染料，使整个加样流程可视化。 

Luna 通用探针一步法 RT-qPCR 试剂盒可兼容大多数实时荧光定量仪器的各个通道，进行目标 RNA 的实时定量分析。在该试剂盒中，联合使用热启动 Taq DNA 聚合酶与新型 Luna WarmStart 反转录酶，通过适配体可逆抑制来双重控制酶活性。Luna 通用探针一步法 RT-qPCR 试剂盒可以直接将 Luna Cell Ready 裂解模块制备的细胞裂解物中的 RNA 转录本进行检测和定量（单重或多重）。

下表列出的细胞系可使用 Luna Cell Ready 裂解模块裂解。这些细胞进行 5 log 梯度稀释（100000-10 细胞/50 µl 裂解反应），并取 1 ul 裂解产物进行 20 µl 体系的一步法 RT-qPCR 反应。每个细胞系的线性结果区域显示在最后一列。此外，经测试一些昆虫细胞系也能用上述裂解液裂解。

表一：经验证过的细胞系

 图一：Luna Cell Ready 一步法 RT-qPCR 实验流程

Luna Cell Ready 一步法 RT-qPCR 试剂盒提供了直接从细胞（50 µl 体系可裂解高达 10 万个细胞）到 RNA 检测和定量的所有组分。Luna Cell Ready 裂解模块整合了 DNase I 和 Luna Cell Ready 蛋白酶的功能，仅需 15 分钟即可完成细胞裂解、RNA 释放和基因组 DNA 去除。2 µl 裂解产物（相当于 0.2–4000 个细胞中的 RNA）即可实现 20 µl 体系的 RT-qPCR 反应。 

图二：Luna Cell Ready 探针一步法 RT-qPCR 试剂盒可直接对 5-log 梯度稀释细胞的裂解物进行灵敏精准的 RNA 定量

梯度稀释的 A549 细胞（100,000-10）使用标准反应条件（37°C 裂解 10 分钟，25°C 灭活 5 分钟），在 50 µl 的 Luna Cell Ready 裂解体系（NEB＃E3032）中裂解。使用 Luna 通用探针一步法 RT-qPCR 试剂盒（NEB＃E3006），加入 1 μl 细胞裂解物（相当于 20 μl RT-qPCR 反应体系中 0.2-2,000 个细胞）对目的基因进行定量，每个浓度的样品都做了重复。结果展示了两个高频靶标：β-actin（Texas Red）和 GAPDH（FAM），一个低频靶标：RPL32（HEX），的多重结果（A）和单重结果（B），以及相应的扩增效率（E）和线性关系（R²）。（C）所有三个目标的多重和单重的 Cq 叠加证明了这些结果的一致性。

三：Luna Cell Ready 探针一步法 RT-qPCR 试剂盒与提纯 RNA 均可对 5-logs 细胞梯度样品进行精准可信的 RNA 定量

梯度稀释的 A549 细胞（100,000-10）使用标准反应条件（37°C 裂解 10 分钟，25°C 灭活 5 分钟），在 50 µl 的 Luna Cell Ready 裂解体系（NEB＃E3032）中裂解，也可使用柱提法提纯 RNA。A.使用 Luna 通用探针一步法 RT-qPCR 试剂盒（NEB＃E3006）对目的基因进行定量，加入 1 μl 细胞裂解物（实心圆，左）或纯化的 RNA（空心圆，右）（上样量相当于 20 µl RT-qPCR 反应中有 0.2-2,000 个细胞），每个浓度的样品都做了重复。在 5-logs 细胞梯度中检测高频靶标 β-actin 和两个低频靶标 ARF3 和 Tubulin。每个靶标的扩增效率在图中左下方显示。

图四：Luna Cell Ready 染料一步法 RT-qPCR 试剂盒的扩增效率及灵敏度均优于其它市售的细胞裂解一步法 RT-qPCR 试剂盒。

梯度稀释的 A549 细胞（100,000-10）使用标准反应条件，在 50 µl 的 Luna Cell Ready 裂解体系（NEB＃E3032）中裂解。相同的样品使用 Bio-Rad（SingleShot™ Probes One-Step Kit for Cell Lysis and RT-qPCR, #172-5070）、Qiagen（FastLane Cell Probe Kit, #216413）和 Thermo Fisher（Cells-to-CT 1-Step TaqMan Kit, A25603）并分别按照厂家说明书进行裂解。然后使用每个试剂盒中的一步法 RT-qPCR 模块，加入 1 μl 细胞裂解物（相当于 20 μl RT-qPCR 反应体系中 0.2-2,000 个细胞），对目的基因进行定量，每个浓度的样品都做了重复。5-log 梯度稀释的细胞通过多重实验测试了 β-actin （Tye）、GAPDH （FAM）和 RPL32 （Cy5）的扩增。为了使结果标准化，将每个试剂盒总荧光值的 10％（Tye）、5％（FAM）、15％（Cy5）设置为阈值。图中显示了扩增效率（E）及最高与最低的 Cq 值。

试剂盒组分

随该产品提供的试剂

 实验需要但不提供的试剂耗材

•  磷酸盐缓冲液（PBS）

•   目标特异性引物

•   细胞

•   Eppendorf 管

•   PCR联管

•   PCR 板

•   qPCR 仪器

•   移液器和枪头（为减少交叉污染，应使用带滤芯的枪头）

 储存温度

-20℃