Monarch基因组 DNA 提取试剂盒是NGS实验中NEBNext建库产品的完美补充。提取的长片段DNA，是长读长测序平台的上游纯化的首选。

 Monarch基因组 DNA提取试剂盒提取出的高质量基因组DNA适用于长片段PCR 和 qPCR 等灵敏下游实验。

Ÿ 用于从细胞和血液中提取高分子量 DNA

Ÿ 提取纯化的 DNA 片段大小达到 Mb 范围

Ÿ 通过改变裂解过程中的离心速度，可轻松调节提取 DNA 的片段大小

Ÿ 操作流程简单、便捷（细胞样品 30 分钟，血液样品 60 分钟）

Ÿ  获得的 DNA 产量、纯度和完整性极佳

Ÿ 高效去除 RNA

Ÿ 快速、高效的洗脱

Ÿ 包含 RNase A 和蛋白酶 K

Ÿ 是长片段测序的理想选择

图 2：使用 Monarch 高分子量 DNA 提取试剂盒从血液中提取纯化 HMW DNA 的操作流程

图 3：Monarch 高分子量 DNA 提取试剂盒从血液和细胞中提取 HMW DNA 的重复性好

使用 Monarch^® 高分子量 DNA 提取试剂盒（细胞和血液）提取 DNA。提取样品为 1 x 10⁶ 新鲜 HEK293 细胞和 500 µl 新鲜人血样，按照试剂盒说明使用电泳图上方标注的离心速度进行制备。从平行试验样本中分别取 500 ng DNA 产物通过 PFGE 分离（在 BioRad^® CHEF-DR® III 系统上，使用 1％ 琼脂糖凝胶，6 V / cm，13℃ 电泳 20 小时，切换时间为 0.5-94 秒）。各样品的产量和纯度见下表标注。分子量标准为 Lambda PFG Ladder（NEB＃N0341）。

 

图 4：在从细胞和血液中提取 HMW 基因组 DNA 的裂解过程中，使用不同的离心速度可调节提取片段长度

 

将 1 x 10⁶ HEK 293细胞和 500 μl 新鲜人血样一式两份提取 HMW DNA。在裂解步骤中，按照图中标注的速度离心样品，以控制 DNA 的片段化。从平行实验样本中取等量的 DNA 产物（细胞：500 ng；血液：650 ng）通过 PFGE 分离（在 BioRad^® CHEF-DR^® III 系统上，使用 1％ 琼脂糖凝胶，6 V / cm，13℃ 电泳 20 小时，切换时间为 0.5-94 秒）。各样品的产量、纯度和 DIN 值见下表标注。分子量标准为 Lambda PFG Ladder 和 Lambda DNA-Hind III 消化 (NEB #T3041 and #N3012) 。

 

图 5：细胞和血液样本上样量与 DNA 产量的线性相关性

 

 

 根据说明书操作方案，将 HEK293 培养细胞和来自不同供体的新鲜人血样作为样品提取 HMW DNA 并记录产量数据，裂解步骤中离心速度为 2,000 rpm。将原始样品稀释成 5 个不同的浓度，以覆盖建议上样量范围。细胞样品（≤5×10⁵）和血液样品（<500 µl）使用低样品量推荐的上样体积进行纯化。在测量范围内，上样量与产量呈高度线性相关。

·        用于从组织、细菌和其它样品（酵母、昆虫、两栖动物）中提取高分子量 DNA

·        从软组织和细菌中提取纯化的 DNA 片段大小达到 Mb 范围

·        对于一些样品，通过改变裂解过程中的离心速度，调节提取 DNA 的片段大小

·        操作流程简单、便捷（组织和细菌样品 90 分钟）

·        获得的 DNA 产量、纯度和完整性极佳

·        快速、高效的洗脱

·        是长片段测序的理想选择

       ·        包含 RNase A 和蛋白酶 K，以及微管研棒便于样品匀浆

 Monarch^® 高分子量 DNA 提取试剂盒（组织）为从组织、细菌及其它样品（包含酵母、昆虫和两栖动物）中提取完整的高分子量（HMW）gDNA 提供了快速的操作流程。针对于组织的提取方案为：首先使用研棒匀浆和蛋白酶 K 搅拌裂解样品，然后进行蛋白质去除，并将提取的 DNA 附着到大玻璃珠的表面。如果提取样品为细菌，则需要在蛋白酶 K 消化之前，使用溶菌酶对细菌细胞壁进行充分裂解。根据标准流程提取的 DNA 在 50-250 kb 之间，如果将离心速度降到最低，提取的 DNA 片段可达 Mb 范围。纯化后的 DNA 产量和纯度极高，且几乎完全不含 RNA。组织和细菌样品提取时间为 90 分钟。组织和细菌 A260 / A280 检测纯度为 1.8-1.9，组织 260/230 检测纯度为 2.1-2.5，细菌 260/230 检测纯度为 2.1-2.2。纯化后的 HMW DNA 适用于多种下游应用，包括长片段测序（Oxford NanoporeTechnologies®和 PacificBiosciences^®），光学图谱（BionanoGenomics^®）和 Linked-Reads 基因组组装。

图 1：使用 Monarch 高分子量 DNA 提取试剂盒从组织中提取纯化 HMW DNA 的操作流程

图 2：Monarch 高分子量 DNA 提取试剂盒（组织）可从多种样品中高效提取纯化高质量的 HMW DNA

使用 Monarch 高分子量 DNA 提取试剂盒（组织）提取 HMW 基因组 DNA。提取样品为：冻存大鼠肾脏 10 mg、新鲜小鼠肝脏 10 mg、冻存小鼠大脑 20 mg、新鲜小鼠肌肉 20 mg、冻存大肠杆菌 2 x 10⁹、蜡样芽孢杆菌 2 x 10⁸、新鲜非洲爪蟾 4 mg、新鲜酿酒酵母 3.8 x 10⁸ 和冻存埃及埃及斑蚊 15 mg。参照试剂盒说明书操作，离心速度为 2000 rpm。酿酒酵母使用经调整的操作流程。从平行实验样本中分别取 500 ng DNA 产物通过 PFGE 分离（在 BioRad^® CHEF-DR^® III 系统上，使用 1％ 琼脂糖凝胶，6 V / cm，13℃ 电泳 20 小时，切换时间为 0.5-94 秒）。各样品的产量和纯度见下表标注。分子量标准为 Lambda PFG Ladder（NEB＃N0341）。

图 3：在从组织和细菌中提取 HMW 基因组 DNA 的裂解过程中，使用不同的离心速度可调节提取片段长度

使用 Monarch 高分子量 DNA 提取试剂盒（组织）提取纯化 HMW 基因组，测试样品为小鼠肾脏（10 mg，图 3A）和大肠杆菌 NEB10 beta（1 x 10⁹ 细胞，图 3B）。在裂解步骤中，按照图中标注的速度离心样品，以控制 DNA 的片段化。从平行实验样本中取等量的 DNA 产物（小鼠肾脏：300 ng；大肠杆菌：500 ng）通过 PFGE 分离（在 BioRad^® CHEF-DR^® III 系统上，使用 1％ 琼脂糖凝胶，6 V / cm，13℃ 电泳 20 小时，切换时间为 0.5-94 秒）。分子量标准为 Lambda PFG Ladder（NEB＃N0341）。各样品的产量、纯度和 DIN 值见下表标注。