标签： NAD/NADH Assay Kit-WST试剂盒

烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(NAD)是参与糖酵解、电子转移系统和TCA循环等细胞主要代谢途径氧化还原反应的重要辅助因子。NAD以氧化型NAD⁺和还原型NADH的形式存在于细胞中。维持适当的NAD⁺和NADH水平对细胞功能至关重要。此外最近的研究表明NAD⁺水平的下降与衰老相关，NAD⁺的量被认为是衰老相关研究的一个标志。

NAD/NADH检测试剂盒可以定量细胞中NAD⁺/NADH、NADH和NAD⁺的量，并测量它们的比值。细胞内NADH水平可以通过试剂盒内含的Extraction Buffer裂解细胞并在加热后选择性地定量检测。而细胞内的NAD⁺水平则可以通过总的NAD⁺/NADH总量减去NADH量计算得到。

NAD⁺和NADH的分别检测

分别测定NAD⁺和NADH的操作步骤

*只有Dojindo的试剂盒中带有可以简单去除蛋白质的微量管

用试剂盒内的提取缓冲液及去除蛋白质用的微量管，能简便地制备细胞裂解液。通过加热细胞裂解液能单独检测细胞内的NADH量。而细胞内的NAD⁺量则可以通过总NAD⁺/NADH量减去NADH量的计算得到。

在本试剂盒中，当n=3时，可以测量12个样品和8个标准品。当使用超过12个样品时，您需要准备单独的微量管。

使用NAD⁺/NADH作为指标的研究

细胞中NAD⁺和NADH的量被评估为重要的代谢指标，用于了解受药物管理和基因重组影响的癌细胞和线粒体功能。最近已经明确了长寿相关的受体与NAD⁺的含量密切相关。越来越多的人将其评估为肥胖，糖尿病和细胞分化等生物学状况的标志物。

检索来源：Google Scholar

检索关键词：

NAD/NADH    :  “NAD/NADH”

线粒体             ：“NAD/NADH”Mitochondria

癌                    ：“NAD/NADH”Cancer

肥胖                 ：“NAD/NADH”Obesity

孔板检测中数据的可靠性

可以通过同时测量该试剂盒中包含的标准溶液来进行定量分析。如果样品中NAD⁺/NADH的总含量高于2 μmol/l，则可以通过稀释样品进行评估。在下面的实验中，使用细胞数相差2倍的HeLa细胞，来确定NAD⁺和NADH的数量和比率。

使用增殖培养的HeLa细胞（2.5×10⁵，5.0×10⁵个细胞），从标准曲线中得到细胞内NAD⁺和NADH的量。最终NAD⁺的量和NADH的量会随着细胞数而改变，但是即使细胞数改变，NAD⁺和NADH量的比率也不变。

经确认，将2-Deoxy-D-glucose加入到HeLa 细胞后，代谢活性发生了变化。

用乳酸检测试剂盒检测的实验例

向HeLa细胞（1×10⁶细胞）中加入2-Deoxy-D-glucose，终浓度为6 mmol/l，培养24小时后测定乳酸量和NAD⁺/NADH比。用Lactate Assay Kit-WST（货号：L256）测定上清液中乳酸含量，去除上清后用本试剂盒检测细胞中的NAD⁺/NADH比。

最终加入2-Deoxy-D-glucose抑制了细胞内糖酵解系统，并导致乳酸量的减少和NAD⁺/NADH比率的增加。

(1) 按照上图，在每孔中分别加入50 μl的标准液和样品溶液。

※为了获得准确的数据，建议每个样品做3个复孔。

(2) 在每孔中加入50 μl Working Solution。

※由于在加入Working Solution后酶会立刻反应，请用多通道移液器以减少由于加液时间延迟而导致的实验误差。

(3) 在37℃培养60 min。

※培养时请密封培养板，以防止液体蒸发。

(4) 用酶标仪在450 nm处检测吸光度。

(5) 用标准曲线测定样品中总NAD⁺/NADH和NADH的量。

※如果原样品在检测前已稀释，可用稀释倍率乘以检测的数值。

※NAD⁺的量可用总NAD⁺/NADH的量-NADH的量计算得到

NAD⁺= 总NAD⁺/NADH-NADH

                                                标准曲线

常见问题Q&A

Q1：试剂盒可以测量多少个样本？
A1：

*所有样品均测定3次（n=3）

上表中显示了当标准样品从2 μmol/l连续稀释，作出一条共计8个点（n=3）的标准曲线时可以检测的样品数量。如果分为2次检测，由于需要重复做一条标准曲线，因此样品检测的数量会更少。
Q2：是否可以使用450 nm以外的滤光片进行测量？
A2：也可以使用490 nm的滤光片，但是吸光度会低于在450 nm处的吸光度。当用不同滤光片检测时，校准曲线如下：

Q3：可以单独购买过滤管吗？
A3：不可以，我们不单独出售过滤管。如果需要其他耗材，可以使用市场上售卖的过滤管。
Q4：工作液稳定吗？
A4：工作液无法长期保存。请在使用前配制工作液，由于工作液对光敏感请注意避光。该工作液在室温下可避光保存4小时。
Q5：样品颜色没有变化，是什么原因？
A5：样品中的NAD含量可能低于使用此试剂盒可测定的检测限度，在这种情况下，请增加细胞数，或者如果检测样品被稀释，则在检测前降低稀释比例。

参考文献

No	检测对象	文献名
1	老年小鼠肠道 上皮组织器官	Epigenetic silencing of Lgr5 induces senescence of intestinal epithelial organoids during the process of aging, NPJ Aging Mech. Dis.,  2018,doi：10.1038/s41514-018-0031-5.
2	成人T细胞 白血病细胞株	High expression of   NAMPT in adult T-cell leukemia/lymphoma and anti-tumor activity of a NAMPT inhibitor, Eur. J. Pharmacol., 2019,865,172738.
3	Sirt 7敲除 成纤维细胞	SIRT7 regulates the nuclear export of NF-κB p65 by deacetylating Ran, Biochim. Biophys. Acta. Mol. Cell Res.,2019,1866(9),1355.
4	人iPS来源神经细胞	Kynurenine,3-OH-kynurenine, and anthranilate are nutrient metabolites that alter H3K4         trimethylation and H2AS40 O-GlcNAcylation at hypothalamus-related loci, Sci. Rep., 2019, 9(1), 19768.
5	HuH-7细胞	Contribution of GPD2/mGPDH to an alternative respiratory chain of the mitochondrial         energy metabolism and the stemness in CD133-positive HuH-7 cells, Genes Cells,2020, 25(2), 139.
6	HeLa细胞	Hypoxia promotes Chlamydia trachomatis L2/434/Bu growth in immortal human epithelial cells via activation of the PI3K-AKT pathway and maintenance of a balanced NAD+/NADH     ratio, Microbes Infect., 2020, DOI:10.1016/j.micinf.2020.04.010.