近年来，以细胞表面抗原为目标的癌症治疗和诊断的相关研究引起了科研人员的广泛关注。目前较为常用的方法是利用荧光标记的抗体来检测细胞表面抗原(免疫荧光法)，但是由于许多细胞表面蛋白的表达水平不高，往往造成检测结果灵敏度低、适用范围小的问题。针对这些问题，同仁化学研究所专门开发了一种高灵敏度的荧光染色方法，即CLAMP法(quinone methide-based catalyzed signal amplification)。

*本产品是在日本九州大学片山佳树教授的指导下研制而成。

通过利用一抗、β-Galactosidase(β-Gal)标记的二抗、β-Gal的荧光底物CLAMP F405进行荧光染色。CLAMP F405自身没有荧光也无法通过细胞膜，在与β-Gal反应后会形成具有细胞膜透过能力的Quinone methide，在进入细胞后可以与细胞内氨基和巯基结合并发出荧光。因为该荧光强度经过β-Gal的酶反应而得到增强，因此可以高灵敏的检测细胞膜上蛋白质。

CLAMP法的操作步骤与一般的二抗法相同。依次加入目的蛋白对应的一抗、β-gal标记的二抗、染色液，简单的三步操作后即可开始检测。

PD-1L1性能比较表

同时准备PD-L1诱导表达的HepG2细胞以及作为对照组的CFSE染色的细胞。将这两个细胞样品混合后，用CLAMP检测PD-L1表达的细胞。从结果可以看出，在CFSE染色细胞中，没有任何CLAMP法阳性细胞出现，PD-L1表达的细胞被清楚地标记区分出来。说明CLAMP可以用于检测一般的二次抗体法很难检测出来的PD-L1表达的HepG2细胞。

*CFSE: 5- or 6-(N-Succinimidyloxycarbonyl)fluorescein 3‘,6’-diacetate。(同仁货号：C375)

<检测结果>

<检测条件>

Blue:    Ex = 340-380 nm, Em = 435-485 nm

Green: Ex = 450-490 nm, Em = 500-550 nm

FFPE组织切片-人小肠组织

分别用CLAMP法和酪酰胺信号放大法(TSA, Tyramide signal amplification)检测人小肠FFPE组织切片上的α 平滑肌肌动蛋白(αSMA, α-smooth muscle actin)和角蛋白。结果显示CLAMP法的灵敏度更高，并且清晰的呈现了组织的免疫荧光共染色。

*数据提供：日本京都大学医学部附属医院病理诊断科 平田胜启老师

① Protocol 1 (实验例：荧光显微镜检测HeLa细胞的表面抗原CD44)

参照操作说明书的Protocol 1，用CLAMP法检测HeLa细胞上的表面抗原CD44。

<检测条件>

1. 将HeLa细胞(1 x 105 cell/ml)播种于96孔板(100 μl/well)，37℃，5% CO2培养箱内过夜培养。

2. 去除上清，用100 µl MEM (10% FBS) 培养基清洗2次。

3. 去除上清，加入100 µl μg/ml 抗CD44抗体 (ab189524, abcam) /MEM (10% FBS) ，37℃，5% CO2培养箱内培养1 h。

4. 去除上清，用100 µl MEM (10% FBS)培养基清洗2次。

5. 加入100 µl x500 β-Galactosidase标记的抗体（ab136774, abcam）/MEM (10% FBS)，37℃，5% CO2培养箱内培养1 h。

6. 去除上清，用100 µl HBSS清洗细胞2次。

7. 加入100 µl Staining Solution，37℃，5% CO2培养箱内培养30 min。

8. 去除上清，用100 µl HBSS清洗细胞3次。

9. 用荧光显微镜观察荧光。（DAPI filter: Ex = 320-360 nm, Em = 435-480 nm）

② Protocol 2 (实验例：流式细胞仪检测HeLa细胞的表面抗原CD44)

参照操作说明书的Protocol 2，用CLAMP法检测HeLa细胞上的表面抗原CD44。

<检测条件>

1. 在1.5 ml微管中用MEM培养基(10% FBS) 制成2 x 105 cells/tube HeLa细胞的细胞悬液。

2. 300×g离心5 min，去除上清。

3. 添加500 µl 2 μg/ml CD44抗体(ab189524, abcam)/MEM培养基(10% FBS)，吹打混匀。

4. 在37℃静置1 h。

5. 按下列步骤进行清洗。

Ⅰ. 300×g离心5 min，去除上清。 Ⅱ. 加入500 µl培养基吹打制成细胞悬液。

Ⅲ. 300×g离心5 min，去除上清。 Ⅳ. 再重复一次步骤Ⅱ和Ⅲ。

6. 加入500 µl x500 β-Galactosidase标记的抗体(ab16774, abcam) /MEM培养基(10% FBS)，吹打制成细胞悬液。

荧光二抗法使用Alexa Fluor405标记的抗体 (ab175652, abcam)

7. 在37℃静置1 h。

8. 用HBSS替代培养基，重复步骤5的清洗操作，

9. 加入500 µl用HBSS配制的Staining Solution(悬浮细胞用)，吹打制成细胞悬液。

10.在37℃下，用微管旋转器(Tube Rotator)搅拌30 min。注意：不搅拌的话会造成灵敏度降低。

11. 300×g离心5 min，去除上清。

12.加入500 µl HBSS吹打混匀。

13.上流式细胞仪检测(LSR Fortessa X-20, BD)。 *BV421 filter set (Ex:405 nm, Em:430-470 nm)

③ Protocol 3 (实验例：检测固定化HeLa细胞的表面抗原CD44)

参照操作说明书的Protocol 3，用CLAMP法检测固定化HeLa细胞上的表面抗原CD44。

<检测条件>

PFA固定细胞的准备

1. 将HeLa细胞 (1 x 105 cell/ml)播种于96孔板(100 μl/well)，37℃，5% CO2培养箱内过夜培养。

2. 去除上清，用100 µl PBS清洗2次。

3. 加入100 µl 4% PFA/PBS溶液，室温静置30 min。

4. 去除上清，加入100 µl 0.1% Triton X-100/PBS溶液，室温静置30 min。

5. 去除上清，每孔加入100 µl Blocking Buffer (10% Blocking One/PBS)，室温静置30 min。

染色步骤

1. 去除上清，加入100 2 μg/ml 抗CD44抗体 (ab189524, Abcam) /Blocking Buffer ，室温静置1 h。

2. 去除上清，用100 µl Blocking Buffer清洗2次。

3. 加入100 µl x500 β-Galactosidase 标记的抗体 (ab16774, abcam) /Blocking Buffer ，室温静置1 h。

4. 去除上清，用100 µl Blocking Buffer清洗2次。

5. 加入100 µl Staining Solution，37℃静置30 min 。

6. 去除上清，用100 µl PBS清洗细胞3次。

7. 用荧光显微镜观察荧光。(DAPI filter: Ex = 320-360 nm, Em = 435-480 nm)

④ Protocol 4 (实验例：检测固定化MOLT4细胞的表面抗原PD1)

参照操作说明书的Protocol 4，用CLAMP法检测固定化MOLT4细胞上的表面抗原PD1。

<检测条件>

PFA细胞固定的准备

1. 在1.5 ml微管中加入(2 x 105 cells/tube)MOLT4细胞制成细胞悬液。

2. 300×g离心5 min，去除上清。

3. 添加500 µl 4% PFA/PBS溶液，吹打混匀。

4. 室温静置30 min，300×g离心5 min。

5. 去除上清，加入500 µl 0.1% TritonX-100/PBS溶液，吹打混匀。

6. 室温静置30 min，300×g离心5 min。

7. 去除上清，加入500 µl Blocking Buffer (10% Blocking One/PBS)，吹打混匀。

8. 去除上清后用100 µl HBSS清洗3次。

9. 室温静置30 min，300×g离心5 min，去除上清后开始染色步骤。

染色步骤

1. 加入500 µl 1 μg/ml PD1抗体(ab52587, abcam)/Blocking Buffer，吹打混匀。(同型对照使用IgG1KAPPA, 401408, Biolegend)

2. 室温静置1 h。

3. 按下列步骤进行清洗。

Ⅰ. 300×g离心5 min，去除上清。 Ⅱ. 加入500 µl Blocking Buffer吹打制成细胞悬液。

Ⅲ. 300×g离心5 min，去除上清。 Ⅳ. 再重复一次步骤Ⅱ和Ⅲ。

4. 加入<span style=”font-size: 11px; font-family: Arial; color: blac