D-荧光素是流行和多功能的生物发光底物。萤火虫荧光素酶/荧光素生物发光系统存在于萤火虫（Photinus pyralis）和其他几种甲虫中。荧光素酶通过二氧杂环丁酮中间体氧化ATP活化的荧光素。萤火虫荧光素酶通过荧光素的ATP依赖性氧化产生光。来自该反应的560nm化学发光在数秒内达到峰值，当荧光素和ATP过量存在时，光输出与荧光素酶活性成比例。萤火虫荧光素酶长期以来与抗体结合，并在荧光素作为检测底物的免疫测定中用作标记物。与HRP和碱性磷酸酶相比，荧光素酶对化学修饰的耐受性较差。该酶的一个特别优点是除了其高灵敏度之外，在哺乳动物组织中存在低内源荧光素酶活性。荧光素酶的另一个重要用途是卫生监测领域。荧光素酶/荧光素系统可用于检测污染，因为存在于所有生物体中的ATP需要产生发光。这种ATP生物发光的主要应用是通过测试食品加工厂中的表面来确定质量，以确定是否存在设备或产品的污染。D-荧光素 游离酸 D-Luciferin 是美国AAT Bioquest 的产品。