标签： 96 孔聚苯乙烯

酶联免疫吸附试验 (ELISA)

ELISA 或酶联免疫吸附测定是一种基于板的免疫测定，用于检测和量化抗体、蛋白质、激素或肽等生物分子，以及表征蛋白质-蛋白质和蛋白质-核酸相互作用。在 ELISA 中，感兴趣的靶标，通常是抗原，被固定在固体表面上，随后用与酶如辣根过氧化物酶 (HRP)或碱性磷酸酶 (AP)缀合的抗体进行探测。量化是通过与底物孵育来实现的，底物由酶催化，产生可测量的副产物。

ELISA（酶联免疫吸附试验）概述
ELISA 测定传统上在 96 孔聚苯乙烯微量滴定板中进行。这些板被设计成被动结合和固定抗原，通常通过直接吸附到微量滴定板表面或间接通过预包被的“捕获”抗体。固定后，将一抗引入样品，与抗原形成免疫复合物。一抗可以与酶共价标记，例如 HRP，或者如果一抗用生物素标记，则可以使用酶标记的二抗或链霉亲和素偶联物间接检测一抗。检测是通过与合适的底物孵育来评估结合酶的活性来实现的，这会产生可测量的副产物。基材的灵敏度和与成像设备的兼容性不同，

表示使用目标特异性抗体的直接和间接抗原检测。

实验方案：比色直接 ELISA
用测试抗原包被 ELISA 板，密封板并在 4°C 下孵育过夜
用所需的缓冲液去除涂层溶液并洗涤板 2 次
在 4°C 下用所需的封闭溶液封闭板 1 小时
用缓冲液洗板 3 次
与 HRP 标记的一抗在室温下孵育 1 小时
用缓冲液洗板 4 次
用 ReadiUse™ TMB 底物溶液（货号11012）在室温下孵育板 15-30 分钟。
使用 ELISA 酶标仪测量 650 nm 处的吸光度信号

直接 ELISA 概览
应用	用于评估抗体亲和力和特异性 用于检查阻断/抑制相互作用
好处	简单快速，需要更少的试剂和更少的步骤 消除了二抗的交叉反应
缺点	抗原固定不是特异性的，导致潜在的高背景干扰 一抗必须单独标记，既费时又昂贵 一抗偶联物的免疫反应性可能会受到酶的不利影响 由于必须偶联一抗，灵活性低 无信号放大

实验方案：比色间接 ELISA
用测试抗原包被 ELISA 板，密封板并在 4°C 下孵育过夜
用所需的缓冲液去除涂层溶液并洗涤板 2 次
在 4°C 下用所需的封闭溶液封闭板 1 小时
用缓冲液洗板 2 次
与未偶联的一抗在室温下孵育 1 小时
用缓冲液洗板 4 次
与 HRP 标记的二抗（在封闭缓冲液中）在室温下孵育 1 小时
用缓冲液洗板 4 次
用 ReadiUse™ TMB 底物溶液（货号11012）在室温下孵育板 15-30 分钟。
使用 ELISA 酶标仪测量 650 nm 处的吸光度信号

间接 ELISA 概览
应用	用于测量内源性抗体
好处	可访问 – 多种预标记二抗可供选择 经济 – 需要更少的标记抗体 高灵敏度 – 一抗包含多种表位，用于结合多种标记的二抗，从而导致信号放大 非常灵活 – 一种二抗可用于检测不同的一抗 保留一抗的最大免疫反应性 不同的可视化标记可用于相同的一抗（例如生物素/链霉亲和素）
缺点	来自二抗的潜在交叉反应，导致非特异性染色 与直接 ELISA 格式相比，程序更长，因为程序中需要额外的孵育步骤

实验方案：比色夹心 ELISA
用捕获抗体包被 PCV 微量滴定板的孔，密封板并在 4°C 下孵育过夜
用所需的缓冲液去除涂层溶液并洗涤板 2 次
在 4°C 下用所需的封闭溶液封闭板 1 小时
用所需的缓冲液洗板 2 次
将样品添加到每个孔中，在 37°C 下孵育 2 小时
取出样品并用所需的缓冲液清洗板 2 次
与未偶联的检测抗体在室温下孵育 1 小时
用所需的缓冲液清洗板 4 次
与 HRP 标记的二抗（在封闭缓冲液中）在室温下孵育 1 小时
用所需的缓冲液清洗板 4 次
用 ReadiUse™ TMB 底物溶液（货号11012）在室温下孵育板 15-30 分钟。
使用 ELISA 酶标仪测量 650 nm 处的吸光度信号

夹心 ELISA 概览
应用	用于测量生物样品中的分析物浓度
好处	高度灵敏 – 比直接或间接 ELISA 形式灵敏 2 到 5 倍 非常灵活 – 可以使用直接和间接检测 高特异性 – 由于使用匹配的抗体对，抗原被特异性捕获和检测 适用于复杂、粗制或不纯的样品 – 抗原在测量前不需要纯化
缺点	匹配抗体对的优化可能很困难 – 捕获和检测抗体可能会发生交叉反应