关联产品
特点：
● 荧光素标记的产品可以在大约2小时内制备。
● 可以标记分子量为50,000或更高的蛋白质。
● 可以标记50至200μg的蛋白质。
● 可以通过使用过滤管的分离操作以高回收率获得标记物质。
● 荧光素标记的物体可以与所附的存储溶液一起存储。
试剂盒内含
产品概述
NH2-reactive HiLyte FluorTM 647是试剂盒的成分之一，它有一个琥珀酰亚胺基（NHS），能与蛋白质或者其它分子的氨基反应。该试剂盒中包含了标记所需的全部试剂。每一管NH2-reactive HiLyte FluorTM 647最多能够标记200 μg的IgG，每个IgG分子可与4-6个HiLyte FluorTM 647分子共价结合。标记过程十分简单，只需要在特制的过滤膜上将NH2-reactive HiLyte FluorTM 647加入到IgG溶液中，然后在37℃下培养10分钟。过量的HiLyte FluorTM 647能够用过滤管除去。被HiLyte FluorTM 647标记后的IgG的激发和发射波长分别为652 nm和673 nm。
* HiLyte FluorTM为AnaSpec,Inc公司的商标
原理
荧光特性
操作步骤
使用注意事项:
1. 用该试剂盒标记的蛋白质的分子量要>50,000。
2. 在标记过程中，IgG或者HiLyte FluorTM 647-IgG标记物始终在Filtration tube的滤膜上。
3. 如果IgG溶液中含有分子量>10,000的其他蛋白质，如BSA或明胶时，在使用该试剂盒标记前，先要纯化IgG溶液。IgG溶液能够用IgG Purification Kits（不包含于本试剂盒 中）来纯化。
4. 如果IgG溶液含有小的不溶物，离心后取上清液来进行标记。
5. 如果长时间不使用，建议您把试剂盒中的标记试剂NH2-reactive HiLyte FluorTM 647放在-20℃冰箱中保存，不需要充氮气，可以更好地保持标记试剂的活性，但请不要把其它试剂和过滤管放到-20℃冰箱中，仍请放在0-5℃冰箱中保存。
标记IgG操作步骤
（1）将100μl WS buffer以及含有100μg IgG的样品溶液加入到过滤管中。a）
（2）8,000-10,000g离心10分钟。b）
（3）将10μl DMSO加入到NH2-reactive HiLyte FluorTM647中并用移液器吹打使其溶解。c）
（4）将100μl Reaction buffer以及8μl NH2-reactive HiLyte FluorTM647溶液加入到过滤管中，吹打使其混合。d）
（5）将过滤管放入培养箱中，37℃培养10分钟。
（6）将100μl WS buffer加入到过滤管中，8,000-10,000g离心10分钟，b）除去滤液。
（7）将200μl WS buffer加入到过滤管中，8,000g离心10分钟，b）重复该步骤一次。
（8）将200μl WS buffer加入到过滤管中吹打10-15次来回收标记产物。e）将该溶液转移到0.5ml试管中，在0-5℃下保存。
a）样品溶液的体积不应超过100μl。如果抗体浓度低于1mg/ml，重复步骤1和2直至总的IgG聚积量达到100μg。如果聚积过程中滤液的体积超过400μl，则在进行后续的离心操作前应除去滤液。
b）如果溶液在离心后仍然残留在膜上，可以再离心5分钟或者适当增加转速。
c）NH2-reactive HiLyte FluorTM647在管子的底部，向管底加入10μl DMSO，吹打数次使其溶解。
d）如果IgG的量为200μg，加入所有的NH2-reactive HiLyte FluorTM647溶液。
e）并不一定要使用WS buffer来回收标记产物，可以选择任何适合于该实验的缓冲液来替代。
产品优势
1）荧光素标记的产品可以在大约2小时内制备。
2）可以标记分子量为50,000或更高的蛋白质。
3）可以标记50至200μg的蛋白质。
4）可以通过使用过滤管的分离操作以高回收率获得标记物质。
5）荧光素标记的物体可以与所附的存储溶液一起存储。
常见问题Q&A
| Q1:能够用这个试剂盒标记其他蛋白质吗？ |
| A:可以。只要标记分子的分子量>50,000。 |
| Q2:标记蛋白之前是否必须使用过滤管？ |
| A:如果蛋白溶液中不含有带有活性氨基的小分子且蛋白浓度在10 mg/ml或者70 μM左右时，可以不使用过滤管来过滤，只需要将10 μl 样品溶液和90 μl Reaction Buffer以及8 μl NH2-reactive HiLyte FluorTM 555（由步骤3所得）混合并按照操作说明上的方法做从步骤4开始的后续试验。 |
| Q3:能够使用这个试剂盒标记寡核苷酸或者寡肽吗？ |
| A:不行。寡核苷酸或者寡肽可能因为分子量太小而不能存在于滤膜上。 |
| Q4:用该试剂盒所能标记的IgG的最小量是多少？ |
| A:IgG的最小量为10 μg。IgG的量在10 μg-100 μg之间时，标记比率是相同的。 |
| Q5:标记产物能保存多久？ |
| A:在4℃下能够保存2个月。如果需要保存更久，可以添加等量的丙三醇，并在-20℃下存放。但是，还要注意样品自身是否稳定。 |
特点：
● 荧光素标记的产品可以在大约2小时内制备。
● 可以标记分子量为50,000或更高的蛋白质。
● 可以标记50至200μg的蛋白质。
● 可以通过使用过滤管的分离操作以高回收率获得标记物质。
● 荧光素标记的物体可以与所附的存储溶液一起存储。
试剂盒内含
产品概述
该试剂盒主要用于制备红色荧光标记的蛋白质，如免疫转染中的IgG和示踪用胞内蛋白。用NH2-reactive HiLyte FluorTM 555是试剂盒的成分之一，它有一个琥珀酰亚胺基（NHS），能与蛋白质或者其它分子的氨基反应。该试剂盒中包含了标记所需的全部试剂。每一管NH2-reactive HiLyte FluorTM 555最多能够标记200μg的IgG，每个IgG分子与4-6个HiLyte FluorTM 555分子共价结合。标记过程十分简单，只需要在特制的过滤膜上将NH2-reactive HiLyte FluorTM 555加入到IgG溶液中，然后在37℃下培养10分钟。过量的HiLyte FluorTM 555能够用过滤管除去。被HiLyte FluorTM 555标记后的IgG的激发和发射波长分别为555nm和570nm。
* HiLyte FluorTM 为AnaSpec,Inc公司的商标
原理
荧光特性
操作步骤
使用注意事项:
1. 用该试剂盒标记的蛋白质的分子量要>50,000。
2. 在标记过程中，IgG或者HiLyte FluorTM 555-IgG标记物始终在Filtration tube的滤膜上。。
3. 如果IgG溶液中含有分子量>10,000的其他蛋白质，如BSA或明胶时，在使用该试剂盒标记前，先要纯化IgG溶液。IgG溶液能够用IgG Purification Kits（不包含于本试剂盒 中）来纯化。
4. 如果IgG溶液含有小的不溶物，离心后取上清液来进行标记。
5. 如果长时间不使用，建议您把试剂盒中的标记试剂NH2-reactive HiLyte FluorTM 555放在-20℃冰箱中保存，不需要充氮气，可以更好地保持标记试剂的活性，但请不要把其它试剂和过滤管放到-20℃冰箱中，仍请放在0-5℃冰箱中保存。
标记IgG操作步骤：
（1）将100μl WS buffer以及含有100μg IgG的样品溶液加入到过滤管中。a）
（2）8,000-10,000g离心10分钟。 b）
（3）将10μl DMSO加入到NH2-reactive HiLyte FluorTM 555中并用移液器吹打使其溶解。c）
（4）将100μl Reaction buffer以及8μl NH2-reactive HiLyte FluorTM 555溶液加入到过滤管中，吹打使其混合。d）
（5）将过滤管放入培养箱中，37℃培养10分钟。
（6）将100μl WS buffer加入到过滤管中，8,000-10,000g离心10分钟，b）除去滤液。
（7）将200μl WS buffer加入到过滤管中，8,000g离心10分钟，b）重复该步骤一次。
（8）将200μl WS buffer加入到过滤管中吹打10-15次来回收标记产物。e）将该溶液转移到0.5ml试管中，在0-5℃下保存。
a）样品溶液的体积不应超过100μl。如果抗体浓度低于1mg/ml，重复步骤1和2直至总的IgG聚积量达到100μg。如果聚积过程中滤液的体积超过400μl，则在进行后续的离心操作前应除去滤液。
b）如果溶液在离心后仍然残留在膜上，可以再离心5分钟或者适当增加转速。
c）NH2-reactive HiLyte FluorTM 555在管子的底部，向管底加入10μl DMSO，吹打数次使其溶解。
d）如果IgG的量为200μg，加入所有的NH2-reactive HiLyte FluorTM 555溶液。
e）并不一定要使用WS buffer来回收标记产物，可以选择任何适合于该实验的缓冲液来替代。
产品优势
1）荧光素标记的产品可以在大约2小时内制备。
2）可以标记分子量为50,000或更高的蛋白质。
3）可以标记50至200μg的蛋白质。
4）可以通过使用过滤管的分离操作以高回收率获得标记物质。
5）荧光素标记的物体可以与所附的存储溶液一起存储。
常见问题Q&A
| Q1:能够用这个试剂盒标记其他蛋白质吗？ |
| A:可以。只要标记分子的分子量>50,000。 |
| Q2:标记蛋白之前是否必须使用过滤管？ |
| A:如果蛋白溶液中不含有带有活性氨基的小分子且蛋白浓度在10 mg/ml或者70 μM左右时，可以不使用过滤管来过滤，只需要将10 μl 样品溶液和90 μl Reaction Buffer以及8 μl NH2-reactive HiLyte FluorTM 555（由步骤3所得）混合并按照操作说明上的方法做从步骤4开始的后续试验。 |
| Q3:能够使用这个试剂盒标记寡核苷酸或者寡肽吗？ |
| A:不行。寡核苷酸或者寡肽可能因为分子量太小而不能存在于滤膜上。 |
| Q4:用该试剂盒所能标记的IgG的最小量是多少？ |
| A:IgG的最小量为10 μg。IgG的量在10 μg-100 μg之间时，标记比率是相同的。 |
| Q5:标记产物能保存多久？ |
| A:在4℃下能够保存2个月。如果需要保存更久，可以添加等量的丙三醇，并在-20℃下存放。但是，还要注意样品自身是否稳定。 |
特点：
● 荧光素标记的产品可以在大约2小时内制备。
● 可以标记分子量为50,000或更高的蛋白质。
● 可以标记50至200μg的蛋白质。
● 可以通过使用过滤管的分离操作以高回收率获得标记物质。
● 荧光素标记的物体可以与所附的存储溶液一起存储。
凑单关联产品TOP5
NO.1. Biotin Labeling Kit – NH2 生物素抗体标记试剂盒-氨基
NO.2. Peroxidase Labeling Kit – NH2 过氧化物酶标记试剂盒-氨基
NO.3. Cell Counting Kit-8 细胞增殖毒性检测
NO.4. Annexin V, FITC Apoptosis Detection Kit 细胞凋亡检测
NO.5. Cytotoxicity LDH Assay Kit-WST 乳酸脱氢酶(LDH)检测
试剂盒内含
产品概述
该试剂盒主要用于制备用荧光素标记的蛋白质，如免疫转染中的IgG和胞内蛋白示踪。氨基反应型荧光素是试剂盒的成分之一，它含有琥珀酰亚胺基（NHS），能与蛋白质或者其它分子的氨基反应。该试剂盒中包含了标记所需的全部试剂，包括Storage buffer。每一管荧光素最多能够标记200μg的IgG，每个IgG分子可与4-6个荧光素分子共价结合。该试剂盒还包含一个缓冲液交换系统，因此含有氨基缓冲液的样品也能用此试剂盒来标记。虽然用膜来过滤有时会导致IgG聚集，但是试剂盒中的缓冲液交换系统能够防止标记过程中聚集现象的发生。用该试剂盒标记的抗体在4℃下能够保存至少2个月。被荧光素标记后的IgG的激发和发射波长分别为495nm和520nm。
原理
产品优势
1）荧光素标记的产品可以在大约2小时内制备。
2）可以标记分子量为50,000或更高的蛋白质。
3）可以标记50至200μg的蛋白质。
4）可以通过使用过滤管的分离操作以高回收率获得标记物质。
5）荧光素标记的物体可以与所附的存储溶液一起存储。
荧光特性
操作步骤
使用注意事项:
1. 用该试剂盒标记的蛋白质的分子量要>50,000。
2. 在标记过程中，IgG或者Fluorescein -IgG标记物始终存在于Filtration tube的滤膜上。
3. 如果IgG溶液中含有分子量>10,000的其他蛋白质，如BSA或明胶时，在使用该试剂盒标记前，先要纯化IgG溶液。IgG溶液能够用IgG Purification Kits（不包含于本试剂盒 中）来纯化。
4. 如果IgG溶液含有小的不溶物，离心后取上清液来进行标记。
5. 如果长时间不使用，建议您把试剂盒中的标记试剂NH2-reactive fluorescein放在-20℃冰箱中保存，不需要充氮气，可以更好地保持标记试剂的活性，但请不要把其它试剂和过滤管放到-20℃冰箱中，仍请放在0-5℃冰箱中保存。
a) 样品溶液的体积不应超过100μl。如果抗体浓度低于1mg/ml，重复步骤1和2直至总的IgG聚积量达到100 μg。如果聚积过程中滤液的体积超过400μl，则在进行后续的离心操作前应除去滤液。
b) 如果溶液在离心后仍然残留在膜上，可以再离心5 min或者适当增加转速直至膜上没有残留液体。
c) NH2-Reactive Fluorescein Dye在管子的底部，向管底加入10μl DMSO，吹打数次使其溶解，如果没有DMSO的话，可以用乙醇来替代。
d) 如果IgG的量为200μg，在步骤4时加入所有的NH2-Reactive Fluorescein Dye溶液。
e) 并不一定要使用WS Buffer来回收标记产物，可以选择任何适合于该实验的缓冲液来替代。
标记率计算
计算标记率：
1分子蛋白质上结合的荧光素的数量 (标记率) 的计算方法：将标记的蛋白质溶液用5倍的中性缓冲液稀释，分别测定在280nm和各个荧光染料的最大吸收波长处的吸光度，采用以下公式计算。
* 如果是IgG，摩尔吸光系数ε=216,000。
* 荧光染料在WS缓冲液中的摩尔吸光系数参见下表：
常见问题Q&A
| Q1:能够用这个试剂盒标记其他蛋白质吗？ |
| A:可以。只要标记分子的分子量>50,000。 |
| Q2:标记蛋白之前是否必须使用过滤管？ |
| A:如果蛋白溶液中不含有带有活性氨基的小分子且蛋白浓度在10mg/ml或者70μM左右时，可以不使用过滤管来过滤，只需要将10μl 样品溶液和90μl Reaction Buffer以及8μl NH2-reactive Fluorescein（由步骤3所得）混合并按照操作说明上的方法做从步骤4开始的后续试验。 |
| Q3:能够使用这个试剂盒标记寡核苷酸或者寡肽吗？ |
| A:不行。寡核苷酸或者寡肽可能因为分子量太小而不能存在于滤膜上。 |
| Q4:用该试剂盒所能标记的IgG的最小量是多少？ |
| A:IgG的最小量为10μg。IgG的量在10μg-100μg之间时，标记比率是相同的。 |
| Q5:标记产物能保存多久？ |
| A:在4℃下能够保存2个月。如果需要保存更久，可以添加等量的丙三醇，并在-20℃下存放。但是，还要注意样品自身是否稳定。 |
C12H21N5O4S
331.39
实验工具稀释计算器摩尔浓度计算器
C20H29N5O4S
435.54
关联产品
关联产品
特点：
● 整个标记过程仅需3个小时
● 整个标记过程在1支过滤管中进行
● 荧光标记抗体回收率高
● 适用于50-200 μg的IgG
试剂盒内含
产品概述
生物素标记试剂盒-SH是用于在具有SH基团的蛋白质（尤其是抗体）上标记生物素的试剂盒。由于试剂盒中包含的SH反应性生物素分子中具有马来酰亚胺基团，因此仅通过与具有SH基团的分子混合即可形成稳定的共价键。如果蛋白质具有S-S键，则可以使用连接的还原剂制备游离的SH基团。（但是，由于SS键的断裂，蛋白质的活性可能会丢失。）当用生物素标记高分子量蛋白质（例如免疫球蛋白G（IgG））时，可以使用所附的过滤管轻松进行预采样。如果可以进行处理并且将铰链区中的SH基团用于标记，则可以制备生物素标记的还原IgG，而不会损害抗体活性。另外，未反应的SH-反应性生物素可以在反应后通过使用滤管的纯化操作除去。
原理
操作步骤
使用注意事项:
1. 用该试剂盒标记的蛋白质的分子量要>50,000。
2. 在标记过程中，IgG或者Biotin-IgG标记物始终存在于过滤管的滤膜上。
3. 如果蛋白质溶液中含有分子量>10,000的其他蛋白质，如BSA或明胶时，在使用该试剂盒标记前，先要纯化IgG溶液。IgG溶液能够用IgG Purification Kits (不包含于本试剂盒中) 来纯化。
4. 如果蛋白质溶液含有小的不溶物，离心后取上清液来进行标记。
5. 1管SH-Reactive Biotin可以标记50-200ug蛋白质。
标记IgG操作步骤
（1）将100μl WS buffer以及含有100μg IgG的样品溶液加入到过滤管中。a）
（2）8,000-10,000g离心10分钟。b）
（3）将150μl WS buffer加入到Reducing agent管中，并用移液器吹打使其溶解。
（4）将100μl Reducing agent溶液转移到过滤管的滤膜上，吹打使IgG在膜上溶解。
（5）37℃培养30分钟。加入100μl Reaction buffer，8,000-10,000g离心10分钟。b）
（6）将10μl DMSO加入到SH-reactive biotin中，吹打使其溶解。c）
（7）将100μl Reaction buffer与8μl SH-reactive biotin溶液加入到过滤管中，吹打使其混合。d）
（8）37℃培养30分钟。将100μl WS buffer加入到过滤管中8,000-10,000g离心10分钟。 b）
（9）加入200μl WS buffer，8,000-10,000g离心10分钟。b）再重复该步骤一次。
（10）加入200μl WS buffer，吹打10-15次来回收标记产物。e）将该溶液转移到0.5ml试管中，在0-5℃下保存。
a) 样品溶液的体积不应超过100ul。如果蛋白质浓度<0.5mg/ml，重复操作步骤1和2直至总的IgG聚积量达到100ug。如果聚积过程中滤液的体积超过400 ul，则在进行后续的离心操作前应除去滤液。
b) 如果溶液在离心后仍然残留在膜上，可以再离心5min或者适当增加转速直至膜上没有残留液体。
c) NH2-Reactive Biotin/SH-Reactive Biotin在管子的底部，向管底加入10ul DMSO，吹打数次使其溶解。
d) 如果IgG的量为200ug，在步骤4时加入所有的NH2-ReactiveBiotin溶液。
e) 并不一定要使用WS Buffer来回收标记产物，可以选择任何适合于该实验的缓冲液来替代。
产品优势
1、整个标记过程仅需3个小时
2、整个标记过程在1支过滤管中进行
3、荧光标记抗体回收率高
4、适用于50-200 μg的IgG
常见问题Q&A
| Q1:样品溶液中的共存会影响反应吗？ |
| A:它可能会受到共存类型的影响。确认溶液中包含哪种物质后，根据情况纯化用于标记的蛋白质，并将其用于标记反应。<聚合物：分子量10,000以上>它可能会影响。即使使用Filtration Tube，也无法去除具有氨基的高分子量化合物，例如BSA和明胶。因此，它被标记并充当荧光杂质。 在反应中使用之前，请执行单独的清除操作。另一方面，如果存在许多高分子杂质，即使没有氨基的化合物也可能导致过滤器堵塞。它可能会干扰标记/纯化操作。 *不仅对于生物素标记试剂盒-SH，而且对于其他标记试剂盒，都需要采取相同的预防措施。 |
| Q2:标记小分子蛋白质（分子量50,000或以下）的方法。 |
| A:由于该试剂盒中包含的过滤管是分子量截断值为30K的超滤过滤器，因此我们建议使用50,000或分子量更大的蛋白质，并留有余量。当标记分子量为50,000或更小的蛋白质时，可以通过更换为分子量分数较小的超滤过滤器来标记甚至很小的蛋白质，如下所示。
—————————————— PALL Nanocep 3K产品编号OD003C33 PALL Nanocep 10K产品编号OD010C33 —————————————— 离心所需的时间可能比试剂盒中随附的过滤器要长，因此请注意离心时间。 |
| Q3:标记后，离心过滤管，液体仍会留在膜上怎么处理？ |
| A:（1）目视检查隔膜时，如果液体稍微残留在隔膜杯的边缘，请继续执行下面操作。如果倾斜和旋转膜杯时液体残留在膜上或滴下，请以8,000 g离心约15至30分钟。 （2）即使在1）中的离心操作之后，如果液体仍留在膜上，请检查标记物质是否聚集。
根据抗体或蛋白质本身的特性，用小分子标记剂进行标记可能会增加抗体或蛋白质的疏水性并使其聚集。如果在标记的物质上观察到团聚，将其转移到另一个微管中一次，离心并使用上清液。 （回收的抗体/蛋白质的量将减少。）如果上述方法没有帮助，请与公司技术支持联系。 *如果您怀疑过滤器堵塞，可以通过更换新的膜过滤器来解决。 替代品：PALL Nanocep 30K（制造商代码：OD030C33） |
| Q4:该试剂盒可以标记什么？ |
| A:可以标记分子量为“50,000或更高”并且具有[S-S]或[SH]的任何化合物（抗体，蛋白质等）。量为“50-200μg”。 *由于试剂盒中包含的过滤管尺寸为30K，因此无法纯化低分子量化合物。 |
特点：
● 生物素标记的产品可以在大约2小时内制备。
● 只需将NH2反应性生物素与目标蛋白混合即可形成稳定的共价键。
● 可以标记分子量为50,000或更高的蛋白质。
● 可以标记50-200μg的蛋白质。
● 可以通过使用过滤管的分离操作以高回收率获得标记物质。
● 生物素标记的产品可以与试剂盒中包含的存储溶液一起存储。
凑单关联产品TOP5
NO.1. Cell Counting Kit-8 细胞增殖毒性检测
NO.2. Cytotoxicity LDH Assay Kit-WST 乳酸脱氢酶(LDH)检测
NO.3. Fluorescein Labeling Kit – NH2 荧光素标记试剂盒-氨基
NO.4. Peroxidase Labeling Kit – NH2 过氧化物酶标记试剂盒-氨基
NO.5. Biotin Labeling Kit – NH2 (for 1mg) 生物素标记试剂盒-氨基
试剂盒内含
产品概述
生物素标记试剂盒-NH2是用于用生物素标记带有氨基基团的蛋白质的试剂盒，尤其是抗体，由于该试剂盒中包含的NH2-反应性生物素分子中具有活性酯基，因此仅通过与生物素混合即可形成稳定的共价键。当生物素标记在蛋白质（例如免疫球蛋白G（IgG））上时，可以使用随附的过滤管轻松去除抑制标记反应和未反应的NH2-反应性生物素的低分子量化合物（例如Tris）。因此，没有必要进行诸如透析和凝胶过滤的处理，并且可以以高回收率获得高纯度的标记化合物。
原理
操作步骤
使用注意事项：
1. 用本试剂盒标记的蛋白质的分子量要>50,000。
2. 在标记过程中，IgG或者Biotin-IgG标记物始终存在于过滤管的滤膜上。
3. 如果IgG溶液中含有分子量>10,000的其他蛋白质，如BSA或明胶时，在使用该试剂盒标记前，先要纯化IgG溶液。IgG溶液能够用IgG Purification Kits (不包含于本试剂盒中) 来纯化。
4. 如果IgG溶液含有小的不溶物，离心后取上清液来进行标记。
5. 1管NH2-Reactive Biotin可以标记50-200 ug蛋白质。
标记IgG操作步骤
（1）将100μl WS buffer以及含有100μg IgG的样品溶液加入到过滤管中。a）
（2）8,000-10,000g离心10分钟。b）
（3）将10μl DMSO加入到NH2-reactive biotin中并用移液器吹打使其溶解。c）
（4）将100μl Reaction buffer以及8μl NH2-reactive biotin溶液加入到过滤管中，吹打使其混合。d）
（5）将过滤管放入培养箱中，37℃培养10分钟。
（6）将100μl WS buffer加入到过滤管中，8,000-10,000g离心10分钟，b）除去滤液。
（7）将200μl WS buffer加入到过滤管中，8,000-10,000g离心10分钟，b）重复该步骤一次。
（8）将200μl WS buffer加入到过滤管中吹打10-15次来回收标记产物。e）将该溶液转移到0.5ml试管中，在0-5℃下保存。
a) 样品溶液的体积不应超过100ul。如果蛋白质浓度低于0.5mg/ml，重复操作步骤1和2直至总的蛋白质聚积量达到50-200ug。如果聚积过程中滤液的体积超过400ul，则在进行后续的离心操作前应除去滤液。
b) 如果溶液在离心后仍然残留在膜上，可以再离心5min或者适当增加转速直至膜上没有残留液体。
c) NH2-Reactive Biotin在管子的底部，向管底加入10ul DMSO，吹打数次使其溶解。
d) 如果蛋白质的量为200ug，在操作步骤4时加入所有的NH2-Reactive Biotin-DMSO溶液。
e) 并不一定要使用WS Buffer来回收标记产物，可以选择任何适合于该实验的缓冲液来替代。
产品优势
1）生物素标记的产品可以在大约2小时内制备。
2）只需将NH2反应性生物素与目标蛋白混合即可形成稳定的共价键。
3）可以标记分子量为50,000或更高的蛋白质。
4）可以标记50-200μg的蛋白质。
5）可以通过使用过滤管的分离操作以高回收率获得标记物质。
6）生物素标记的产品可以与试剂盒中包含的存储溶液一起存储。
常见问题Q&A
| Q1:这个试剂盒可以用于标记其他蛋白质吗？ |
| A:可以。但是如果含有像血清白蛋白或者明胶的蛋白，标记反应可能会受到干扰。用这个试剂盒标记之前，有必要先纯化抗体溶液。如果您想进一步了解纯化过程可以联系我们。 |
| Q2:我只有少量的IgG，可以标记吗？ |
| A:在该试剂盒中，标记所需的IgG量为50至200μg。
在此范围内，性能没有太大差异。 可以用10μg IgG进行标记，但是可能会出现诸如背景升高的问题。 |
| Q3:样品溶液中的共存会影响反应吗？ |
| A:它可能会受到共存类型的影响。确认溶液中包含哪种物质后，根据情况纯化用于标记的蛋白质，并将其用于标记反应。
<聚合物：分子量10,000以上>它可能会影响。即使使用Filtration Tube，也无法去除具有氨基的高分子量化合物，例如BSA和明胶。因此，它被标记并充当荧光杂质。 在反应中使用之前，请执行单独的清除操作。另一方面，如果存在许多高分子杂质，即使没有氨基的化合物也可能导致过滤器堵塞。它可能会干扰标记/纯化操作。 *生物素标记试剂盒-不仅需要对NH2采取相同的预防措施，还需要对其他标记试剂盒采取相同的预防措施。 |
| Q4:标记小分子蛋白质（分子量50,000或以下）的方法。 |
| A:由于该试剂盒中包含的过滤管是分子量截断值为30K的超滤过滤器，因此我们建议使用50,000或分子量更大的蛋白质，并留有余量。
当标记分子量为50,000或更小的蛋白质时，可以通过更换为分子量分数较小的超滤过滤器来标记甚至很小的蛋白质，如下所示。 —————————————— PALL Nanocep 3K产品编号OD003C33 PALL Nanocep 10K产品编号OD010C33 —————————————— 离心所需的时间可能比试剂盒中随附的过滤器要长，因此请注意离心时间。 |
| Q5:标记后，离心过滤管，液体仍会留在膜上怎么处理？ |
| A:（1）目视检查隔膜时，如果液体稍微残留在隔膜杯的边缘，请继续执行下面操作。如果倾斜和旋转膜杯时液体残留在膜上或滴下，请以8,000 g离心约15至30分钟。
（2）即使在1）中的离心操作之后，如果液体仍留在膜上，请检查标记物质是否聚集。根据抗体或蛋白质本身的特性，用小分子标记剂进行标记可能会增加抗体或蛋白质的疏水性并使其聚集。如果在标记的物质上观察到团聚，将其转移到另一个微管中一次，离心并使用上清液。 （回收的抗体/蛋白质的量将减少。） *如果您怀疑过滤器堵塞，可以通过更换新的膜过滤器来解决。 替代品：PALL Nanocep 30K（制造商代码：OD030C33） |
| Q6:该试剂盒可以标记什么？ |
| A:可以标记分子量为“ 50,000或更高”和反应性氨基（NH2）的化合物（抗体，蛋白质等）。标记样品量为“50-200μg”。
*当考虑标记“ mg”的量时，也可以使用“生物素化试剂盒（Sulfo-OSu）；同仁产品货号：BK01”。 *由于试剂盒附带的过滤管为30K，因此无法纯化低分子量化合物。 |
| Q7:一个IgG分子能标记多少生物素？ |
| A:每个IgG分子平均能标记7至10个生物素。 |
| Q8:标记产物能保存多久？ |
| A:在0-5℃下能够保存2个月。如果需要保存更久，可以添加等量的丙三醇，并在-20℃下 (只要该蛋白可以冷冻) 存放。但是，还要注意样品自身是否稳定。 |
| Q9:能不能用这个试剂盒标记寡核苷酸和寡肽？ |
| A:不能，寡核苷酸和寡肽的分子量太小不能使其保留在过滤膜上。请参照Q4。 |
| Q10:含有生物素标记蛋白质的活细胞怎么处理？ |
| A:我们推荐使用PBS (含2-10% FBS) 制备细胞悬液，保持最佳细胞状态。 |
| Q11:回收缓冲液 (WS Buffer)对活细胞有危害吗？ |
| A:没有。WS Buffer含有表面活性剂，它的浓度控制在对细胞没有毒性的范围内。如果您担心WS Buffer中的添加剂，请您使用常用的缓冲液代替。 |
特点：
● pH敏感型荧光标记染料
● 试剂盒包括所有试剂
● 详细的标记手册
产品概述
本款试剂盒一套试剂盒就包含了全部所需材料，可以对目标物质的内吞作用进行可视化分析。
试剂盒中包含的NH2-反应性AcidSensor（荧光探针）具有分子内活性酯基，与含氨基的目标物质（蛋白质）混合后形成稳定的共价键。AcidSensor标记后可在633纳米处被激发，可满足同时与绿色或红色荧光进行多重染色。
AcidSensor标记后在中性条件下几乎没有荧光，而在细胞中受环境酸化影响后会发出荧光，并被内吞作用所吸收。
*注意：
・与内吞作用的检测染料ECGreen（产品代码：E296）不同，本试剂盒是对进入细胞的目标物质进行染色。
本试剂盒可以标记分子量超过50,000和含有活性氨基的样本。
・本试剂盒也会标记分子量在10,000以上的除标记样本以外的含氨基的共存物质，这些物质也会被标记和回收。请在使用前对样品溶液进行纯化。
原理
AcidSensor的反应原理与细胞内吞途径的示意图
与其他产品的比较
与内体染料共染
标记的IgG的细胞摄取量随时间变化
用本试剂盒的AcidSensor标记的小鼠IgG和Dojindo的内吞检测染料（货号E296, ECGreen -Endocytosis Detection）一同添加到HeLa细胞中。
染色后10分钟、20分钟和180分钟观察细胞，结果显示AcidSensor（深红色）和内体膜（绿色）在同一位置定位，表明小鼠IgG是通过内吞作用途径被细胞吸收的。
＜检测条件＞
绿：ECGreen
(Ex = 405 nm, Em= 500-550 nm)
紫：AcidSensor
(Ex = 633 nm, Em= 650-700 nm)
使用AcidSensor标记的BSA和小鼠IgG被HeLa细胞吸收的情况
使用该试剂盒将标记的BSA或小鼠IgG加入HeLa细胞中，2小时后观察HeLa细胞的吸收情况。
结果，在HeLa细胞中检测到了AcidSensor的荧光，证实两种标记的物体都被内吞途径吸收了。
＜检测条件＞
仪器:共聚焦显微镜
Ex = 633 nm, Em = 650-700 nm
常见问题Q&A
| Q1: 样品溶液中存在的物质是否会影响标记反应？ |
| A1:
取决于存在的物质种类。 在确认溶液中含有哪些物质后，对样品进行相应的纯化。 样品中共存的带有氨基的化合物和分子量超过10,000的化合物会降低标记效率，并且由于其分子量高，不能被过滤管去除。即使是没有氨基的化合物，高分子量的杂质也会造成过滤器的堵塞，从而影响标记和纯化。请在使用前对样品进行纯化。
|
| Q2:回收标记体所使用的WS buffer是否有细胞毒性？ |
| A2: WS buffer中含有几乎不会对细胞产生毒性的稳定剂（表面活性剂）。如果无论如何还是介意表面活性剂，可以根据自身习惯来选择合适的缓冲液来回收标记体。 |
| Q3:如果用含有血清的培养基回收标记体，是否会影响观察？ |
| A3: 血清中的成分虽然不会对AcidSensor的性能产生影响，但是由于血清中的蛋白质也会通过内吞途径进入细胞，可能会与标记的蛋白质的摄取产生竞争。请您根据自身实验目的进行判断。 |
| Q4:如何计算标记率？ |
| A4: A用WS buffer 5倍稀释标记体，然后检测500 nm和280 nm处的吸光度，按照下列公式进行计算，得出标记率。
A500： 500 nm 的吸光度 A280： 280 nm 的吸光度 εprotein： 蛋白质的280 nm处的摩尔吸光系数 NH2-Reactive AcidSensor 在WS buffer中的 A500 的摩尔吸光系数为[48400]。 NH2-Reactive AcidSensor 在280nm和500nm的吸光度、280nm/500nm的比值为[0.16]。 |
| Q5:每个蛋白质分子上会有多少个AcidSensors标记上？ |
| A5:对于小鼠IgG，我们已经确认每个分子平均有三个AcidSensors被标记。 |
特点：
● 特异性外泌体定位，细胞外不聚集
● 回收率高
● 多种颜色可供选择
试剂盒内含
概述
近年来研究发现，外泌体作为细胞外囊泡（Extracellular vesicle; EV）的一种，与癌症的恶化与转移密切相关， 外泌体相关的研究也逐渐成为了关注的热点。为了研究通过外泌体的细胞间通信，细胞摄入外泌体时的示踪技术非 常重要，然而目前广泛使用的磷脂双分子层的荧光染料存在明显的缺点（1. 染色后外泌体粒径增大。2. 荧光染料自身形成粒子，造成背景增高）。本产品是为了解决这些问题而开发的新型荧光染料，并且有 Green, Red, Deep Red 三种颜色，可满足多重染色在内的各种实验需求。
特点
特点1：外泌体的标记和纯化一步到位
ExoSparkler系列已经对外泌体标记的最佳条件进行摸索并做成了操作手册，试剂盒内包含纯化所需的过滤管，可以简单快捷的进行外泌体的标记和纯化。
纯化方法(未反应染料的去除)的比较
ExoSparklar系列中用于除去未反应染料的过滤管，与以往使用的相同用途的凝胶过滤法相比，能够以更高的回收率纯化外泌体。
| 回收率 | |||||
| 过滤管（本试剂盒） | 50% | ||||
| 凝胶过滤法 | 10% | ||||
| ※本公司的实施例：通过NTA技术（纳米颗粒跟踪分析）比较提取前后的外泌体粒子数 | |||||
关于使用过滤管进行纯化的有效性，常见问题是：标记后的纯化操作时，过滤膜上有颜色残留，能否确定未反应的染料彻底分离了？详见Q&A。
特点2：多种颜色选择
ExoSparkler系列包括膜 (Mem Dye)和蛋白质 (Protein Dye)荧光染色试剂，各三种颜色 (Green, Red, Deep Red)。
■实验条件
超速离心法纯化的外泌体(蛋白质的量为10 μg)经过各试剂染色后，与HeLa细胞(1.25×104 cells)一起培养24 h，清洗后进行荧光观察。
■观察条件
Green:
Ex： 488 nm / Em： 490-540 nm
Red:
Ex： 561 nm / Em： 570-640 nm
Deep Red:
Ex： 640 nm / Em： 640-760 nm
实验例
实验例：确认外泌体的局部存在
将用ExoSparkler Exosome Protein Labeling Kit-Deep Red(产品名称：EX06，Protein Dye-Deep Red)或ExoSparkler Exosome Membrane Labeling Kit-Red(产品名称：EX02，Mem Dye-Red)染色的外泌体添加到HeLa细胞中，通过与溶酶体染色试剂(绿色)共染确认了外泌体在细胞内的定位。结果证实，用蛋白质或膜染色的外泌体均位于溶酶体中。
观察条件
Protein Dye-Deep Red（紫）：Ex：640 nm / Em：640-760 nm
Mem Dye-Red（红色）：Ex：561 nm / Em：570-640 nm
溶酶体染色试剂（绿）：Ex：488 nm / Em：490-540 nm
实验条件
将用超速离心法提取的外泌体(蛋白质量为5 µg)用每个外泌体染色试剂盒染色，添加到HeLa细胞(0.75×104cells)中，孵育3.5小时后对溶酶体进行染色，观察洗涤后的荧光图像。
| 产品名称 | 容量 | 货号 | |||
| 外泌体膜荧光染色试剂盒 | |||||
| （绿色）ExoSparkler Exosome Membrane Labeling Kit-Green | 5 samples | EX01 | |||
| （红色）ExoSparkler Exosome Membrane Labeling Kit-Red | 5 samples | EX02 | |||
| （深红色）ExoSparkler Exosome Membrane Labeling Kit-Deep Red | 5 samples | EX03 | |||
| 外泌体蛋白荧光染色试剂盒 | |||||
| （绿色）ExoSparkler Exosome Protein Labeling Kit-Green | 5 samples | EX04 | |||
| （红色）ExoSparkler Exosome Protein Labeling Kit-Red | 5 samples | EX05 | |||
| （深红色）ExoSparkler Exosome Protein Labeling Kit-Deep Red | 5 samples | EX06 | |||
| *纯化的外泌体(超离心法)，蛋白质：1-10 µg/sample，粒子数：10-100×10^8个/sample | |||||
常见问题Q&A
| Q1：纯化外泌体建议用什么方法？ |
| A1：一般我们推荐使用超速离心法纯化外泌体。但是，免疫沉淀法和磁珠法纯化的外泌体也有过成功染色的实例。 目前，聚合物沉淀法纯化的外泌体由于有聚合物的残留会影响外泌体的染色，所以无法使用本试剂盒。 |
| Q2：细胞摄取外泌体时使用的是哪种培养基？ |
| A2：我们公司在做染色后外泌体进入细胞的实验时，使用过MEM（Minimum Essential Medium）和DMEM（Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium）。目前我们公司一直采用的含血清培养基进行外泌体实验，暂时无法推荐无血清培养基。 |
| Q3：染色后的外泌体可以长期保存吗？ |
| A3：染色后的外泌体不建议长期保存。染色后的外泌体最好尽快进行后续实验。 |
| Q4：标记后的纯化操作时，过滤膜上有颜色残留，能否确定未反应的染料彻底分离了？ |
| A5:虽然在过滤膜上可以观察到颜色的残留，但是我们公司通过下面的实验验证了过滤膜上的回收产物里不含未反应的染料。 <实验条件> 超速离心法纯化的①含有外泌体（蛋白质含量10 µg）的缓冲液和②单纯缓冲液，分别按照试剂盒说明书记载的步骤进行染色操作。染色后的产物加入到HeLa细胞中（1.25×104 cells），4小时后进行荧光观察。 结果显示，单纯缓冲液染色后的回收产物加入到细胞后，没有观察到荧光，进而可证明回收产物中没有残留的染料。 |
① Exosome + Buffer
② Only Buffer
Fluorescent images at 4 h incubation
Detection conditions
Green：Ex 488 nm / Em 490 – 540 nm
Red ：Ex 561 nm / Em 570 – 640 nm
Deep Red：Ex 640 nm / Em 640 – 760 nm
特点：
● 特异性外泌体定位，细胞外不聚集
● 回收率高
● 多种颜色可供选择
试剂盒内含
概述
近年来研究发现，外泌体作为细胞外囊泡（Extracellular vesicle; EV）的一种，与癌症的恶化与转移密切相关， 外泌体相关的研究也逐渐成为了关注的热点。为了研究通过外泌体的细胞间通信，细胞摄入外泌体时的示踪技术非 常重要，然而目前广泛使用的磷脂双分子层的荧光染料存在明显的缺点（1. 染色后外泌体粒径增大。2. 荧光染料自身形成粒子，造成背景增高）。本产品是为了解决这些问题而开发的新型荧光染料，并且有 Green, Red, Deep Red 三种颜色，可满足多重染色在内的各种实验需求。
特点
特点1：外泌体的标记和纯化一步到位
ExoSparkler系列已经对外泌体标记的最佳条件进行摸索并做成了操作手册，试剂盒内包含纯化所需的过滤管，可以简单快捷的进行外泌体的标记和纯化。
纯化方法(未反应染料的去除)的比较
ExoSparklar系列中用于除去未反应染料的过滤管，与以往使用的相同用途的凝胶过滤法相比，能够以更高的回收率纯化外泌体。
| 回收率 | |||||
| 过滤管（本试剂盒） | 50% | ||||
| 凝胶过滤法 | 10% | ||||
| ※本公司的实施例：通过NTA技术（纳米颗粒跟踪分析）比较提取前后的外泌体粒子数 | |||||
关于使用过滤管进行纯化的有效性，常见问题是：标记后的纯化操作时，过滤膜上有颜色残留，能否确定未反应的染料彻底分离了？详见Q&A。
特点2：多种颜色选择
ExoSparkler系列包括膜 (Mem Dye)和蛋白质 (Protein Dye)荧光染色试剂，各三种颜色 (Green, Red, Deep Red)。
■实验条件
超速离心法纯化的外泌体(蛋白质的量为10 μg)经过各试剂染色后，与HeLa细胞(1.25×104 cells)一起培养24 h，清洗后进行荧光观察。
■观察条件
Green:
Ex： 488 nm / Em： 490-540 nm
Red:
Ex： 561 nm / Em： 570-640 nm
Deep Red:
Ex： 640 nm / Em： 640-760 nm
实验例
实验例：确认外泌体的局部存在
将用ExoSparkler Exosome Protein Labeling Kit-Deep Red(产品名称：EX06，Protein Dye-Deep Red)或ExoSparkler Exosome Membrane Labeling Kit-Red(产品名称：EX02，Mem Dye-Red)染色的外泌体添加到HeLa细胞中，通过与溶酶体染色试剂(绿色)共染确认了外泌体在细胞内的定位。结果证实，用蛋白质或膜染色的外泌体均位于溶酶体中。
观察条件
Protein Dye-Deep Red（紫）：Ex：640 nm / Em：640-760 nm
Mem Dye-Red（红色）：Ex：561 nm / Em：570-640 nm
溶酶体染色试剂（绿）：Ex：488 nm / Em：490-540 nm
实验条件
将用超速离心法提取的外泌体(蛋白质量为5 µg)用每个外泌体染色试剂盒染色，添加到HeLa细胞(0.75×104cells)中，孵育3.5小时后对溶酶体进行染色，观察洗涤后的荧光图像。
| 产品名称 | 容量 | 货号 | |||
| 外泌体膜荧光染色试剂盒 | |||||
| （绿色）ExoSparkler Exosome Membrane Labeling Kit-Green | 5 samples | EX01 | |||
| （红色）ExoSparkler Exosome Membrane Labeling Kit-Red | 5 samples | EX02 | |||
| （深红色）ExoSparkler Exosome Membrane Labeling Kit-Deep Red | 5 samples | EX03 | |||
| 外泌体蛋白荧光染色试剂盒 | |||||
| （绿色）ExoSparkler Exosome Protein Labeling Kit-Green | 5 samples | EX04 | |||
| （红色）ExoSparkler Exosome Protein Labeling Kit-Red | 5 samples | EX05 | |||
| （深红色）ExoSparkler Exosome Protein Labeling Kit-Deep Red | 5 samples | EX06 | |||
| *纯化的外泌体(超离心法)，蛋白质：1-10 µg/sample，粒子数：10-100×10^8个/sample | |||||
常见问题Q&A
| Q1：纯化外泌体建议用什么方法？ |
| A1：一般我们推荐使用超速离心法纯化外泌体。但是，免疫沉淀法和磁珠法纯化的外泌体也有过成功染色的实例。 目前，聚合物沉淀法纯化的外泌体由于有聚合物的残留会影响外泌体的染色，所以无法使用本试剂盒。 |
| Q2：细胞摄取外泌体时使用的是哪种培养基？ |
| A2：我们公司在做染色后外泌体进入细胞的实验时，使用过MEM（Minimum Essential Medium）和DMEM（Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium）。目前我们公司一直采用的含血清培养基进行外泌体实验，暂时无法推荐无血清培养基。 |
| Q3：染色后的外泌体可以长期保存吗？ |
| A3：染色后的外泌体不建议长期保存。染色后的外泌体最好尽快进行后续实验。 |
| Q4：标记后的纯化操作时，过滤膜上有颜色残留，能否确定未反应的染料彻底分离了？ |
| A5:虽然在过滤膜上可以观察到颜色的残留，但是我们公司通过下面的实验验证了过滤膜上的回收产物里不含未反应的染料。 <实验条件> 超速离心法纯化的①含有外泌体（蛋白质含量10 µg）的缓冲液和②单纯缓冲液，分别按照试剂盒说明书记载的步骤进行染色操作。染色后的产物加入到HeLa细胞中（1.25×104 cells），4小时后进行荧光观察。 结果显示，单纯缓冲液染色后的回收产物加入到细胞后，没有观察到荧光，进而可证明回收产物中没有残留的染料。 |
① Exosome + Buffer
② Only Buffer
Fluorescent images at 4 h incubation
Detection conditions
Green：Ex 488 nm / Em 490 – 540 nm
Red ：Ex 561 nm / Em 570 – 640 nm
Deep Red：Ex 640 nm / Em 640 – 760 nm
特点：
● 无需任何操作技巧
● 与超速离心法相当的回收率
● Filter Holder可重复利用
规格性状
产品概述
ExoIsolator Exosome Isolation Kit可以从细胞培养上清液中快速分离出外泌体， 其回收率与超速离心法相当。试剂盒中内含的 Isolation Filter可以将细胞培养上清液中的外泌体捕获分离，因此无需复杂的操作即可在短时间快速获取外泌体。
简单的操作：无需任何操作技巧
ExoIsolator Exosome Isolation Kit的操作过程极为简单。组装好Filter Holder和Isolation Filter进行减压过滤，再用PBS回收过滤膜表面上的外泌体即可。这种方法可以尽可能的减少外泌体的损失，而且不易产生人为操作因素上的差别。
回收效率高：与超速离心法相当
目前最常用的外泌体分离方法是超速离心法，使用超速离心法和ExoIsolator Exosome Isolation Kit同时回收HEK293S细胞培养液中的外泌体，通过外泌体粒度分布(图1)、粒子数(图2a)和外泌体marker的表达量(图2b)检测两种方法得到的外泌体并进行比较。结果可以看出，两种方法得到的外泌体的粒度分布和粒子数基本相同，而外泌体marker的表达量的结果显示，在相同蛋白量的情况下，ExoIsolator 的外泌体标志物更高，说明ExoIsolator 比超速离心法得到的外泌体纯度更高。(专利申请中)
图1. 提取得到的外泌体的粒度分布
图2. 粒子数(a)与外泌体标志物的表达量(b)
试剂盒的组成
本试剂盒包含Filter Holder和Isolation Filter，其中Filter Holder可以通过高压蒸汽锅灭菌后重复使用。
另外，作为消耗品的Isolation Filter 10枚装 单独销售。
具体请参考产品页面：货号EX11 产品名：ExoIsolator Isolation Filter。
FAQ
| Q：如果没有顺利的提取外泌体，可能的原因有哪些？ |
| A： 可能有以下三方面原因。 1. 过滤时减压的强度过高会使外泌体回收量显著降低。真空泵的推荐压强为-25 kPa，或比-25 kPa更弱。
2. Isolation Filter分为正反两面，安装时的如果方向错误会导致外泌体回收量显著降低。请务必将Isolation Filter的正面(光泽面)向上，具体请参考说明书或操作视频。 3. 为了完全回收Isolation Filter表面上的外泌体，请用PBS反复多次的流过过滤膜的全部表面，具体请参考说明书或操作视频。 |
| Q：分离得到的外泌体是否可以长期保存？ |
| A：4℃可以保存1个月~半年。长期保存时请-80 ℃保存并尽量避免反复冻融，建议分成小包装分开保存。
参考资料(日语)：吉冈祐亮、落谷孝広(2020)、エクソソーム実験ガイド ISBN: 978-4-7581-2246-7。 |
| Q：用含有血清的培养基培养的细胞培养上清液是否可以提取外泌体？ |
| A：不推荐使用含有血清的培养基。由于血清(FBS等)中也含有外泌体，分离得到的外泌体中也会含有血清中的外泌体，对结果产生干扰。 |
| Q：ExoIsolator的回收率是多少？ |
| A：不同检测样品的外泌体回收率也不同。 下面是从市面上销售的纯牛奶中提取的外泌体回收率供参考。
蛋白质回收率(%)粒子回收率(%)：34.6%(SD±3.9)38.3(SD±8.3) |
| Q：从细胞培养上清液中可以得到多少外泌体？ |
| A：细胞的种类和培养条件都会对外泌体的量有影响。下面是25 ml HEK293S细胞(振动培养)的培养上清中分离出来的外泌体的量。
回收的蛋白质的质量(μg)回收的粒子数(particles)：11.2(SD±2.09)6.0E+09(SD±1.0E+9) *蛋白质检测采用的BCA法， 粒子数通过NTA分析检测。 |
| Q： 可以回收的外泌体的尺寸是多少？ |
| A： 可以回收大约100-200nm的尺寸。
（参考） 从HEK293S细胞培养上清回收的外泌体的粒度分布
|
| Q： 一个filter可以处理的样本量是多少？ |
| A： 对于培养基上清液，我们建议使用25ml。
随着样品体积的增加，减压过滤时间也会增加。 例如，如果使用25ml HEK293S细胞培养上清液（11.2μg蛋白质），则减压过滤大约需要5-10分钟。 抽滤的时间不仅取决于样品的体积，还取决于样品中所含的外泌体和蛋白质的量。 |
| Q：如果不知道抽吸装置的吸气压力。我该怎么处理？ |
| A： 您可以通过单独准备一个显示吸入压力的压力表来检查吸入压力。 |
| Q： 减压过滤的时间过长。过滤器堵塞。可能的原因是什么？ |
| A： 请检查以下三种可能的原因。
1、如果样品体积太大或样品中的蛋白质浓度太高，抽滤时间可能需要更久。 处理HEK293S细胞上清液时的样品体积和过滤时间参照： 25毫升（11.2μg蛋白质）：5-10分钟 50毫升（22.4μg蛋白质）：30-60分钟 2、如果减压压力太低太低，过滤时间会更长。 处理25ml HEK293S细胞上清液时的抽滤压力和过滤时间参照： 抽滤压力-25千帕：5-10分钟。 抽滤压力-10千帕：10-20分钟 3、如果包含大量其他物质，而不是外泌体，则可能发生堵塞。 建议事先用0.22μm的 filter 处理样品。 |
关联产品
特点：
● 可用荧光酶标仪高通量筛选
产品概述
胱氨酸(Cystine)是抗氧化物质谷胱甘肽(GSH)的来源，在细胞内的氧化还原平衡中发挥着重要的作用。在癌症研究领域，Sulfasalazine、Erastin等xCT(胱氨酸/谷氨酸反向转运体)抑制剂可以改变细胞内的氧化应激平衡，进而引发细胞死之一的铁死亡。而在免疫研究领域，据报道，巨噬细胞和中性粒细胞在免疫刺激剂的作用下，xCT的表达会增高并增加细胞内的GSH水平，以平衡自身出于攻击癌细胞目的所释放的ROS。因此，无论是对癌细胞的研究还是免疫细胞的研究都离不开胱氨酸摄取能力这一重要指标。
检测原理
试剂盒内含的胱氨酸类似物(Cystine Analog, CA)与胱氨酸一样可以通过xCT的转运进入细胞内。细胞裂解后通过添加Reducing Agent还原CA并与检测试剂FOdA特异性反应，生成可产生荧光的物质。[专利申请中]
检测实例
xCT抑制剂Sulfasalazine, Erastin的抑制效果评价
使用本试剂盒对xCT抑制剂Sulfasalazine和Erastin的抑制效果进行评价。荧光结果显示，两种抑制剂均对胱氨酸的摄取有明显的抑制作用。
与传统方法比较
以往在胱氨酸摄取检测时一般采用同位素示踪法，下面是本试剂盒与同位素示踪法结果的比较。
常见问题Q&A
| Q1：氨基酸类似物(CA)具体是通过哪种转运体进入细胞内的？ |
| A1：Cystine Analog是通过胱氨酸/谷氨酸转运体(xCT)进入细胞内的。 |
| Q2：目前有检测实绩的细胞有哪些？ |
| A2：下列细胞都有检测实绩：人胶质母细胞瘤细胞, A172
人类肺泡基底上皮细胞, A549 人恶性黑色素瘤细胞, A375 人结肠癌细胞, HCT116 人肝癌细胞, HepG2 人早幼粒白血病, HL60 人纤维肉瘤细胞, HT1080 小鼠胚胎成纤维细胞, MEF 人小细胞肺癌细胞, SBC-5 人胶质瘤细胞, U-251 MG |
| Q3：氨基酸类似物(CA)进入细胞后会被分解、代谢掉吗？ |
| A3：氨基酸类似物(CA)的构造非常稳定，实验范围内的操作不会被分解或代谢。 |
| Q4：可以用这个试剂盒进行定量检测胱氨酸吗？ |
| A4：本试剂盒不是胱氨酸定量检测试剂盒。 |
| Q5：可以用这个试剂盒对进入细胞内的胱氨酸定量检测吗？ |
| A5：不能定量检测进入细胞内的胱氨酸，本试剂盒是针对细胞摄取胱氨酸能力的数值化检测试剂盒。 |
| Q6：观察不到荧光变化的时候，应该怎么办？ |
| A6：延长CA Uptake solution与细胞的共培养时间(0.5 ~ 1 h)。 |
| Q7：背景荧光较高时，应该怎么办？ |
| A7：环境中可能有未被细胞摄取的胱氨酸类似物残存，用PBS清洗后再进行检测。 |
| Q8：配制CA Uptake solution时，除了不含胱氨酸的无血清培养基以外，还可以使用哪些Buffer？ |
| A8：检测HeLa细胞时，有过使用HBSS或含有0.1% Glucose PBS（+）进行配制的成功实例。 |
| Q9：如何用细胞数对荧光强度进行补正？ |
| A9：可以通过细胞核染色试剂进行补正。也可以使用同仁化学研究所的 Cell Count Normalization Kit (货号C544)进行细胞数补正。 |
| Q10：一般使用哪种孔板比较好？ |
| A10：
下列厂家得孔板有过检测实绩： 公司名/ 产品名/ 货号 Ibidi/ μPlate 96 well ibiTreat black S 15/ Ib89626 AGC techno glass/ EZVIEW Glass Bottom Culture Plate LB 96well/ 5866-096 Thermo Fisher/ 96 Well Black/Clear Bottom Plate, TC Surface, Pack of 10/ 165305 |
| Q11：Cystine uptake solution可以长期保存吗？ |
| A11：CA Uptake solution无法长期保存，请提前计算好用量，务必现用现配。 |
关联产品
| 产品名 | 包装 | 价格 | 货号 |
| Glucose Uptake Assay Kit-Blue | 1 set | – | UP01 |
| Glucose Uptake Assay Kit-Green | 1 set | – | UP02 |
| Glucose Uptake Assay Kit-Red | 1 set | – | UP03 |
特点：
● 使用荧光显微镜、荧光酶标仪或流式细胞仪即可快速检测
● 添加探针后无需清洗操作，可直接检测
规格性状
产品概述
氨基酸是合成蛋白质和核酸的重要来源，对于增殖活性异常活跃的癌细胞来说尤其重要。不仅如此，癌细胞由于其自身糖酵解途径的亢进，造成乙酰辅酶A(Acetoacetyl-CoA)供应的减少，更加剧了对TCA循环来源之一的氨基酸的需求。基于此方面的研究发现，癌细胞中氨基酸转运体LAT1(L-type amino acid transporter 1)的表达明显增高，说明氨基酸的大量摄取是癌细胞的普遍特征之一。这一发现也有望成为癌症药物研发的新靶点。
在癌症免疫治疗领域，治疗效果不仅与癌细胞的代谢变化有关，免疫细胞的代谢调控也至关重要。例如，随着免疫细胞的衰老，代谢平衡的改变会导致免疫细胞对癌细胞的杀伤能力减弱。因此，通过调控免疫细胞的代谢来改善免疫治疗效果的研究也十分盛行。
氨基酸类似物(BPA)通过氨基酸转运体吸收到细胞后，探针穿透细胞膜并与氨基酸类似物结合，发出荧光(λex=360 nm，λem=460 nm)。本试剂盒可使用荧光显微镜、荧光酶标仪和流式细胞仪检测，通过可视化和数值化的检测评价细胞摄取氨基酸的能力，以及氨基酸转运体抑制剂的筛选。
本试剂盒是在日本大阪府立大学切畑光统(Kirihata Mitsunori)教授提供情报和指导下开发的产品。
运用领域
抑制氨基酸的吸收是癌症药物开发和筛选的靶点之一。此外，通过比较正常细胞和癌细胞的氨基酸吸收能力，还可以了解癌细胞的恶性程度及其细胞特征。
操作步骤
实验例
使用本试剂盒检测BCH(氨基酸转运体抑制剂)对HeLa细胞摄取氨基酸能力的阻碍作用。
＜检测条件＞
细胞：HeLa cells
培养基：MEM （5.5 mmol/l Glucose）
培养条件：1 mmol/l BCH/HBSS (Hanks’ Balanced Salt Solution), 37℃, 30 min
检测仪器：荧光酶标仪 (Ex=340-380 nm, Em: 435-485 nm)
检测仪器：荧光酶标仪 (Ex=360 nm, Em: 460 nm)
<检测条件>
检测仪器：流式细胞仪 (Ex=405 nm, Em: 425-475 nm)
与传统方法比较
与传统的同位素示踪法和代谢组学检测法相比，操作时间大幅减少。
关联产品
| 产品名 | 包装 | 价格 | 货号 |
| Glucose Uptake Assay Kit-Blue | 1 set | 3,980 | UP01 |
| Glucose Uptake Assay Kit-Green | 1 set | 3,980 | UP02 |
| Glucose Uptake Assay Kit-Red | 1 set | 3,980 | UP03 |
常见问题Q&A
| Q：BPA是通过哪种转运蛋白进入细胞内的？ |
| A：有文献报道BPA是通过LAT1, LAT2, ATB0,+转运进入细胞的(Wongthai P et al., “Boronophenylalanine, a boron delivery agent for boron neutron capture therapy, is transported by ATB0,+, LAT1 and LAT2”, Cancer Sci., 2015, Mar;106(3):279-86)。此外，同仁化学也通过实验验证了BCH等LAT1的抑制剂、leucine等LAT1的底物对BPA摄取的抑制作用。 |
| Q：已经有检测实例的细胞系有哪些？ |
| A：贴壁细胞有HeLa, A549, HepG2, MCF-7, C2C12, MEF, U251；悬浮细胞有MOLT4。 |
| Q：BPA被细胞摄入后，是否会被分解或代谢掉？ |
| A：BPA的构造非常稳定，实验操作范围的过程中不会被分解。 |
| Q：BPA被细胞摄入后，能否进行固定化操作？ |
| A：由于探针会从细胞内向细胞外泄漏，所以无法进行染色后的固定化操作。 |
| Q：BPA被细胞摄入后，是否会在特定部位积累？ |
| A：被细胞摄取的BPA均匀的分布在细胞内。 |
| Q：BPA uptake solution，Working solution能否长时间保存？ |
| A： BPA uptake solution，Working solution无法长期保存，请现配现用。 |
| Q：如果荧光信号没有变化，我该怎么办？ |
| A：主要可能的原因有以下两点： ①细胞本身对BPA solution的摄入能力较低。此时建议尝试提高BPA solution
的浓度。(5~50倍稀释) ②Working solution发生变质，请重新配置Working solution，保证现配现用。 |
| Q：如果荧光背景较高， 我该怎么办？ |
| A： 检测环境中可能含有未被细胞摄入的BPA。此时建议用HBSS清洗后再检测。 |
| Q：BPA是否可以定量检测？ |
| A：无法进行定量检测，本染料是评价细胞摄取氨基酸能力高低或增减的试剂。 |
| Q：检测荧光时使用什么样的微孔板比较合适？ |
| A： 有检测实例的微孔板如下： |
特点：
● 数据可靠，不会与NAD+及NADH反应
● 只有Dojindo的试剂盒中带有可以简单去除蛋白质的微量管
● 享有显色底物WST专利
凑单关联产品TOP5
NO.1. FerroOrange 细胞亚铁离子检测
NO.2. Glucose Assay Kit-WST 葡萄糖检测
NO.3. Liperfluo 细胞脂质过氧化物检测
NO.4. Lactate Assay Kit-WST 乳酸检测
NO.5. Lipi-Green 脂滴检测（绿色）
试剂盒内含
概述
烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(NADP) 是磷酸戊糖途径（一种细胞代谢途径）反应中一种重要的辅因子。NADP以氧化态NADP+和还原态NADPH的形式存在于细胞中。NADPH不光对脂肪酸、胆固醇而且对还原型谷胱甘肽的生成至关重要。另外最近的研究表明，NADP+/NADPH通过限制碳水化合物的摄入来延长寿命与NADP+/NADPH有很大关联。
NADP/NADPH Assay Kit-WST能定量检测细胞中总NADP+/NADPH、NADPH和NADP+的量，并计算它们的比值。细胞内NADPH水平可以用试剂盒内的Extraction Buffer裂解细胞后加热进行定量检测。而细胞内的NADP+水平则可以通过总NADP+/NADPH减去NADPH的量计算得到。
原理
技术资料
分别检测NADP+和NADPH
分别测定NADP+和NADPH的操作步骤
*只有Dojindo的试剂盒中带有可以简单去除蛋白质的微量管
用试剂盒内的提取缓冲液及去除蛋白质用的微量管，能简便地制备细胞裂解液。 通过加热细胞裂解液能单独检测细胞内NADPH量，而细胞内的NADP+量则可以通过总NADP+/NADPH量减去NADPH量的计算得到。
在本试剂盒中，当n=3时，可以测量12个样品和8个标准样品。使用超过12个样品时，您需要准备单独的超滤管。
使用NADP+/NADPH作为标记的研究
检索来源：Google Scholar
检索关键词：
NADP/NADPH：“NADP/NADPH”
线粒体：”NADP/NADPH”Mitochondria
癌：”NADP/NADPH”Cancer
氧化应激：”NADP/NADPH”Oxidative Stress
孔板检测中数据的可靠性
通过同时检测试剂盒内的标准溶液，可以对浓度在0.01-1 μmol/l的总NADP+/NADPH和NADPH进行定量。如果样品中的总NADP+/NADPH的浓度>1 μmol/l，可以通过稀释样品来调节。实验证实本试剂盒(NADP/NADPH Assay Kit-WST)不会与NAD+及NADH反应。
操作步骤
（1）按下图，在每孔中分别加入50 μl的标准液和样品溶液。
※为了获得准确的数据，建议每个样品做3个复孔。
（2）在每孔中加入50 μl Working Solution。
※由于在加入Working Solution后酶会立刻反应，请用多通道移液器以减少由于加液时间延迟而导致的实验误差。
（3）在37°C培养60 min。
※培养时请密封培养板，以防止液体蒸发。
（4）用酶标仪在450 nm处检测吸光度。
（5）用标准曲线测定样品中总NADP+/NADPH和NADPH的量。
※如果原样品在检测前已稀释，可用稀释倍率乘以检测的数值。
※NADP+的量可用下列计算公式计算：总NADP+/NADPH-NADPH的量计算得到。
NADP+=总NADP+/NADPH-NADPH
实验例
细胞样品检测实验例 (加入抗癌药物Doxorubicin)
向Jucket细胞中 (3×106 cells)加入终浓度为500 nmol/l的Doxorubicin (Dox)，在培养24 h后检测NADP+/NADPH 比值和还原型/氧化型谷胱甘肽的比值(GSH/GSSG)。用本试剂盒检测PBS清洗后的细胞的NADP+/NADPH比值，用 GSSG/GSH Quantification Kit II (货号：G263) 检测谷胱甘肽的比值。
在细胞内加入DOX后，产生的ROS(H2O2) 破坏了DNA、DNA修复酶 (PARP*) 被激活， 并且NADP+被其消耗。为了补充不足的NADP+，NADPH氧化酶被激活，结果在数据中则会表现为NADP+的增加。与此同时还原型谷胱甘肽 (GSH) 会被产生的ROS所消耗，因此GSH/GSSG的比值会下降。
常见问题Q&A
| Q1：该试剂盒可以检测多少个样本？ |
| A1：
*所有样品均测定3次（n=3） 上表中显示了当标准样品从2 μmol/l连续稀释，作出一条共计8个点（n=3）的标准曲线时可以检测的样品数量。如果分为2次检测，由于需要重复做一条标准曲线，因此样品检测的数量会更少。 |
| Q2：可以单独购买过滤管吗？ |
| A2：不可以，我们不单独出售过滤管。如果需要其他耗材，可以使用市场上售卖的过滤管。 |
| Q3：工作液稳定吗？ |
| A3：工作液无法长期保存。请在使用前配制工作液，由于工作液对光敏感请注意避光。该工作液在室温下可避光保存4小时。 |
| Q4：样品颜色没有变化，是什么原因？ |
| A4：样品中的NAD含量可能低于使用此试剂盒可测定的检测限度，在这种情况下，请增加细胞数，或者如果检测样品被稀释，则在检测前降低稀释比例。 |
特点：
● 适用于普通荧光酶标仪
● 不需要昂贵的仪器、特殊介质和孔板
● 带OCR计算表的一体式试剂盒
产品规格
OCR是线粒体功能的重要指标
由于氧主要在线粒体氧化磷酸化产生三磷酸腺苷（ATP）的过程中消耗，因此其耗氧率（OCR）是分析线粒体功能的指标。众所周知，癌细胞通过糖酵解途径产生ATP，其效率低于氧化磷酸化。在免疫细胞中，氧化磷酸化的优势是抑制抗肿瘤，而糖酵解途径的优势促进抗肿瘤作用。因此，细胞的OCR作为能量代谢的检测指标。
产品概述
细胞外氧消耗量试剂盒包括氧气探针，其具有随着介质中氧气浓度的降低而增加荧光强度的特性，矿物油阻止氧气从空气中流入。
在用荧光显微镜根据细胞外氧浓度测量荧光强度之后，根据Stern-Volmer方程计算细胞的OCR（自动计算表）。
*该产品在群马大学Toshitada Yoshihara博士的指导下实现了产品化。
与现有方法比较
到目前为止，OCR测量需要昂贵的设备，如通量分析仪，实时动态检测酶标仪，以及酶标仪的功能调节。该试剂盒推荐给初此使用的人，因为它可以与常规荧光酶标仪一起使用，并附带所有必要试剂的完整包装。
与石英分析仪对比
石英分析仪（XFe24）和本试剂盒在相同条件下（细胞类型、细胞数量和FCCP浓度）进行测量。
得到XFe24与本试剂盒相关氧消耗速度变化的数据。
细胞种类: HepG2
细胞数: 5×10⁴ cells/well
试剂: FCCP (Carbonyl cyanide 4-(trifluoromethoxy)phenylhydrazone)
FCCP 浓度: 2 μmol/l
实验例：细胞最大呼吸能力评估
在HepG2细胞中，通过FCCP刺激后OCR值的变化来评估细胞的最大呼吸。
在FCCP浓度分别2µmol/l和4µmol/l 测量OCR。与2µmol/l相比，在4µmol/l时观察到OCR降低，表明在2µmol/l FCCP时最大呼吸。
细胞: HepG2
细胞数: 5×104 cells/well
试剂: FCCP
FCCP 浓度 2, 4 μmol/l
实验例：抑制线粒体电子传输链
用抗霉素刺激大鼠细胞，评估线粒体电子运输链抑制后细胞状态的变化，检测多种指标。
结果表明，电子传输链的抑制导致（1）线粒体膜电位的降低和（2）OCR的降低。此外，观察到（3）整个糖酵解途径的NAD+/NADH比率降低，这是由于丙酮酸到乳酸的代谢增加，以维持糖酵解通路；（4）由于活性氧（ROS）增加，GSH耗竭；（6）由于谷胱甘肽生物合成所需NADH减少，NADP+/NADPH比率增加。
Q&A
| Q:本试剂盒可以检测多少样本？ |
| A:当测试一种细胞类型的相同数量的细胞时，可以测量24个样品。
*如果实验中使用了两种以上的细胞类型或多个细胞编号，则必须准备单独的空白和对照，并且可以测量的样本数量会有所不同。 有关详细信息，请参考手册中的板布局示例。 |
| Q:悬浮细胞有什么实验案例吗？ |
| A:我们准备了一个大鼠细胞实验的例子。＜说明＞
（1） 将大鼠细胞（3.0×106细胞/ml）悬浮于RPMI培养基中作为空白3，将大鼠细胞（3.0×106细胞/ml）悬于工作溶液中作为对照或样品。将细胞接种在100µl（300000个细胞/孔）的96孔黑色透明底部微孔板中。
（2） 向空白1中加入100µl RPMI培养基，向空白2中加入100μl工作溶液。
（3） 将微孔板放置在预先设定为37°C的读板器中，孵育30分钟。
（4） 向空白1、空白2、空白3和对照品中加入10µl RPMI培养基。
（5） 将用RPMI培养基稀释的样品溶液（抗霉素或FCCP溶液）分10µl加入样品中。
（6） 加入样品溶液后，立即向每个孔中加入一滴矿物油。
（7） 将微板放置在37°C的平板读数器中，孵育5分钟。
（8） 在一个时间过程中，用荧光板读取器每10分钟测量一次强度，持续200分钟（Ex:500nm，Em:650nm，底部读数）。 （9） OCR值通过将获得的强度值输入下载的专用Excel计算表来计算。 每孔所需的样品和试剂数量。
|
| Q:如何使用此试剂盒计算OCR？ |
| A:请使用Excel计算表并遵循以下说明
＜OCR计算程序概述＞ （1） 将OCR测量获得的强度值输入计算表，使用Stern-Volmer公式自动计算氧含量（nmol）。 （2） 根据时间（min）与氧含量（nmol）的关系图，检查所有测量条件下获得的线性范围。 （3） 计算步骤（2）中确认的时间（min）和氧含量（nmol）范围内的斜率。 （4） 根据步骤（3）中计算的斜率计算OCR（pmol/min）。 有关详细信息，请参阅手册中的“分析”。 *需要计算OCR的客户请至【网站首页】-【技术支持】-【实验工具】即可找到OCR计算器 |
| Q：矿物油对细胞有细胞毒性吗？ |
| A： 当通过Cell Counting Kit-8细胞毒性测定测定时，在用矿物油处理的细胞中未观察到毒性。 |
| Q：OCR检测后如何测量细胞数？ |
| A：使用核酸探针（代码：H342）Hoechst 33342测量每个孔的细胞数，这是该方案的一个示例。
＜说明＞ （1） 将细胞接种到孔中进行OCR测量（液体体积：100μl/孔）。 （2） 将制备校准曲线的细胞接种到孔中（液体体积：100μl/孔）。 （3） OCR根据说明书进行测量。 （4） 向孔中加入10µl/孔的介质进行校准（使介质体积与OCR测量孔的体积对齐至110µl/孔）。 （5） 将用培养基稀释的Hoechst 33342溶液（10µg/ml）以100µl/孔的速度添加到所有孔中。 *从油的顶部添加OCR测量孔。 （6） 在37°C下培养30分钟。 （7） 用荧光板读数器（Ex:350nm，Em:461nm）测量。 （8） 制备校准曲线（X轴：细胞数量，Y轴：荧光强度），并计算用于OCR测量的孔中的细胞数量。
|
| Q：可以长期存储工作液吗 |
| A 工作液不能储存，需要现配现用。 |
| Q：氧探针或矿物油的反复冷冻和解冻是否会影响测定？ |
| A 我们已经证实，氧气探针和矿物油的反复冻融循环对测定没有影响。 |
特点：
●可获得稳定的ADP/ATP比值
●溶液配制后可以保存
●冷藏保存(无需解冻操作)
产品概述
通常情况下，当细胞内ATP浓度降低时，会由二磷酸腺苷(ADP)重新合成为ATP，以维持细胞内一定的ATP浓度。当产生ATP的相关代谢发生紊乱时，ADP无法再合成为ATP，ATP却不断地分解成为ADP，导致ADP/ATP的比例上升。而ADP/ATP比率的变化与细胞凋亡、细胞自噬、能量代谢等诸多途径息息相关，因此经常被作为细胞活性的指标之一检测。
规格性状
检测原理
本试剂盒可以检测细胞中ADP与ATP的比率。首先用萤火虫荧光素酶法检测细胞内的ATP。
之后用酶将细胞内的ADP全部转化为ATP，再用相同的发光原理检测ATP，即可算出细胞内ADP/ATP的比率。
与其他公司产品比较
本试剂盒的检测结果，不受ATP和ADP的总量影响，比值的结果稳定。
实验例
使用Staurosporine诱导细胞凋亡后，用本试剂盒检测细胞中ADP/ATP的比值。另外，用激光共聚焦显微镜和流式细胞仪检测Annexin V-FITC/PI染料标记的Staurosporine诱导凋亡的细胞。
结果显示，Staurosporine诱导后的细胞中ADP/ATP的比例明显上升。相同条件的细胞中也观察到磷脂酰丝氨酸(PS)的外翻以及细胞膜破损。说明凋亡细胞中的ADP/ATP的比率上升。
＜ADP/ATP比的检测结果＞
常见问题Q&A
| Q：一个试剂盒可以检测多少个样品？ |
| A：按照每个样品3个复孔计算，可以检测32个样品，96孔板的孔板设置请参考说明书。 |
| Q：检测时是否可以用白色96孔板以外的孔板？ |
| A：黑色和透明孔板都会造成发光强度的降低，透明孔板还会导致背景升高。因此建议使用白色96孔板。 |
| Q：配制好的working solution是否可以保存？ |
| A：本试剂盒共包含4种working solution，ADP working solution无法保存，请现配现用。其他3种的保存条件及保存时间如下： |
| Q：确定最佳细胞数的方法是什么？ |
| A：配制梯度浓度的细胞悬液播种至孔板中，按照最终实验相同的条件进行培养。使用本试剂盒制作标准曲线(参照图1)，选择呈直线性的范围，并且ADP/ATP比率(参考图2)在相对稳定的范围内进行最终实验的检测。下图的情况，最细胞数的范围是2,000~4,000个。 |
| Q：发光法检测波长为多少？ |
| A：由于是通过萤光素检测，所以检测波长为556 nm。 |
特点：
● 灵敏度高，操作简便
● 操作简单三步即可完成实验
● 无需清洗细胞
试剂盒内含
产品概述
该试剂盒使用Fatty Acid Uptake Probe作为脂肪酸类似物，通过位于细胞膜表面的脂肪酸转运蛋白进入细胞，可以通过荧光显微镜、流式细胞仪和荧光酶标仪等荧光测量方法检测细胞的摄取能力。此外，该试剂盒配备了Quenching Buffer，可消除未进入细胞的Fatty Acid Uptake Probe的荧光，因此无需清洗细胞也可以检测。
检测产品优势
为什么脂肪酸摄取能力越来越受到关注？
脂肪酸是为生物体供应能量的重要物质。脂肪酸摄取能力不仅与肥胖和糖尿病等疾病有关，也是癌细胞的代谢指标之一（左下图）。细胞增殖活跃的癌细胞往往需要很多脂质，所以细胞内的脂肪酸合成和细胞外的脂肪酸摄取很活跃（右下图）。因此，以癌细胞的脂肪酸代谢途径为目标，开发了很多药物。
用单个试剂盒即可解决整个脂肪酸摄取实验！
本试剂盒所内含的脂肪酸类似物通过脂肪酸转运体被转运至细胞内，再通过荧光探针（荧光法）检测该类似物的摄入量【检测原理】。Quenching buffer可以省去清洗操作的麻烦和时间成本，进行检测【操作步骤】。
检测原理
操作步骤
检测仪器
HepG2细胞通过添加脂肪酸转运蛋白抑制剂CB-2，在不同仪器中检测其脂肪酸摄取能力的变化。
选择指南
Washing Buffer或Quenching Buffer的选择指南
请参考下表，根据细胞种类和实验系统（操作和测量装置）选择Washing Buffer或Quenching Buffer。
〇：可测量、×：不可测量、△：参考注释
| Washing Buffer (10×) | Quenching Buffer | ||||
| 贴壁细胞 | 悬浮细胞 | 贴壁细胞 | 悬浮细胞 | ||
| 清洗操作 | 必要 | 不需要 | |||
| 荧光酶标仪 | 底部读数（透明底） | 〇 | 〇 | △※1 | |
| 顶部读数 | 〇 | × | |||
| 荧光显微镜 | 〇 | 〇 | |||
| 激光共聚焦显微镜 | 〇 | △※2 | |||
| 流式细胞仪 | 〇 | × | |||
※1接种的细胞需要覆盖板底（大约：3x105cells/well），使之静置一段时间，从而可检测在板底的贴壁细胞。
※2使用激光共聚焦显微镜时，请将Quenching Buffer用Washing Buffer稀释10倍后使用,如果不能使用ex:488nm,请使用ex:640nm进行检测。
实验例
确认细胞中脂肪酸代谢状态
在A549细胞中添加不含葡萄糖或含有25mmol/l葡萄糖的DMEM培养基，制备了正常状态（control）和饥饿状态（Starved）的两组细胞。使用本试剂盒对两组细胞进行染色，并使用荧光显微镜观察。
结果显示，在对照组细胞中，荧光素大多聚集在脂肪滴中，而在饥饿状态的细胞中荧光素主要集中在线粒体和内质网上。由此可看出在饥饿状态下的细胞脂肪酸代谢的变化。
对照组细胞和饥饿组细胞的荧光图
*供参考的可检测数：35 mm dish 10块、 96孔板 1 块
产品Q&A
| Q: 可用于哪些种类的细胞 |
| A：在下述细胞中有使用实例。 |
| 细胞 | 由来 |
| A549 | 人肺泡基底上皮腺癌细胞 |
| HepG2 | 人肝癌细胞 |
| HeLa | 人宫颈癌细胞 |
| Jurkat | 人白血病T细胞 |
| MOLT-4 | 人急性淋巴白血病细胞 |
| 3T3-L1 (preadipocyte) | 前脂肪細胞 |
| 3T3-L1 (adipocyte) | 脂肪細胞 |
| Q: 将Fatty Acid Uptake Probe孵育进活细胞后，可以固定细胞吗？ |
| A：<实验例>使用4%PFA固定染色后的细胞实验案例
Protocol:贴壁细胞 1. 将制备好的细胞接种在培养皿或96孔板上； 2. 用无血清培养基洗涤两次； 3. 加入无血清培养基，在培养箱（37℃，5%CO2存在下）中静置孵育15 min; 4. 去除上清液，添加Fatty Acid Uptake Probe working solution，在培养箱（37℃、5%CO2存在下）中静置15 min； 5. 去除上清液，用Washing Buffer solution清洗1次； 6. 向细胞中加入4%PFA/PBS并在室温下孵育5 min； 7. 用PBS洗涤细胞3次，用荧光显微镜检测，荧光酶标仪检测。
※固定会降低荧光强度 悬浮细胞 1. 取细胞样品至微管中； 2. 300×g离心5min，去除上清液; 3. 加入无血清培养基，300×g离心5min，去除上清液,重复两次; 4. 加入无血清培养基，混匀细胞，在培养箱（37℃，5%CO2）中静置15 min； 5. 300×g离心5 min，去除上清液; 6. 加入Fatty Acid Uptake Probe working solution，混匀细胞，在培养箱（37℃，5%CO2）中静置15 min ； 7. 300×g离心5min，去除上清液; 8. 用Washing Buffer solution清洗一次； 9. 加入4%PFA/PBS，混匀细胞，在室温下孵育5 min; 10. 300×g离心5 min，去除上清液; 11. 加入PBS，混匀细胞,300×g离心5 min，去除上清液；重复两次。 12. 用荧光显微镜或流式细胞仪检测。
|
| Q: 用荧光酶标仪检测时，应该用哪种板子？ |
| A: 检测荧光，请使用细胞培养用的黑色孔板。 |
〇：可使用、×：不可使用、△：参考注释
| 贴壁细胞 | 悬浮细胞 | ||||
| 不透明底 | 透明底 | 不透明底 | 透明底 | ||
| Washing Buffer (10×) | Top Reading | 〇 | 〇 | ||
| Bottom Reading | × | 〇 | × | 〇 | |
| Quenching Buffer | Top Reading | × | × | ||
| Bottom Reading | × | 〇 | × | △※ | |
※接种的细胞需要覆盖板底，使之静置一段时间，从而可检测在板底的贴壁细胞。
〈使用Quenching Buffer时，悬浮细胞的数据〉
实验案例使用孔板：
| 厂家 | 产品名 | Cat No. |
| ibidi | µPlate 96 well ibiTreat black S 15 | ib89626 |
| Thermo Fisher | 96 Well Black/Clear Bottom Plate, TC Surface, Pack of 10 | 165305 |
| Q: Fatty Acid Uptake Probe working solution可以保存吗？ |
| A：无法保存。 |
| Q：背景较高怎么办？ |
| A：样品中可能存在未进入细胞的Fatty Acid Uptake Probe。可重复使用Washing Buffer solution清洗，或者考虑使用Quenching Buffer。 |
| Q：试剂盒可检测的样品数量是多少？ |
| A：请参照下表。 |
| 贴壁细胞 | 悬浮细胞 | ||||
| 培养皿
（添加量） |
6 well
(1.5 ml/well) |
24-well
(0.3 ml/well)
|
96-well
(0.1 ml/well)
|
35-mm dish
(1.5 ml/well)
|
1.5-ml microtube
(0.5 ml/tube)
|
| 样本数 | 7 sample | 34 sample | 100 sample | 7 sample | 20 sample |
| Q：使用Quenching Buffer用激光共焦显微镜进行检测，应该怎么做？ |
| A：使用Quenching Buffer用激光共焦显微镜进行检测时，请将Quenching Buffer用Washing Buffer solution稀释10倍后使用，或者使用640nm激发光检测。
<用用激光共焦显微镜进行透射光观察时所看到的现象>
|
| Q：可以进行脂肪酸定量吗？ |
| A：不能使用本产品定量脂肪酸。 |
| Q：可以量化细胞内摄取的Fatty Acid Uptake Probe吗？ |
| A：无法定量细胞内摄取的Fatty Acid Uptake Probe。该试剂是为了确认脂肪酸摄取能力的增减的配合用试剂。 |
| Q：可以和其他荧光染料共染吗？ |
| A：Fatty Acid Uptake Probe是使用红色荧光观察。因此，请使用绿色或者红色荧光检测以外的试剂进行共染色。
与本公司线粒体染色试剂MitoBright LT Deep Red（MT12）共染色的实绩。 〈进入红色荧光〉
〈与MitoBright LT Deep Red共染色〉 1. 制备细胞样品接种到培养皿或者孔板中； 2.去除培养基，用无血清培养基洗涤两次； 3.加入无血清培养基，在培养箱（37℃，5%CO2）中静置15 min； 4.去除上清液后，添加Fatty Acid Uptake Probe working solution，在培养箱（37℃，5%CO2）中静置15 min； 5. 去除上清液后，添加0.1µmol/l MitoBright LT working solution，在培养箱（37℃，5%CO2）中静置30 min； 6. 去除上清液后，用HBSS洗涤两次； 7.加入HBSS并用荧光显微镜观察。
|
| Q: 荧光显微镜观察时有什么注意事项吗？ |
| A：荧光显微镜观察时，如果持续照射激发光，Fatty Acid Uptake Probe的荧光可能会淬灭。请控制连续的激发光的照射次数。
|
特点：
● 细胞上清液和细胞样品均适用
● 稳定性好
●可使用酶标仪高通量筛选
凑单关联产品TOP5
NO.1. Lactate Assay Kit-WST 乳酸检测
NO.2. Glucose Uptake Probe-Green 葡萄糖摄取检测
NO.3. Cell Counting Kit-8 细胞增殖毒性检测
NO.4. FerroOrange 细胞亚铁离子检测
NO.5. Liperfluo 细胞脂质过氧化物检测
试剂盒内含
| 50 tests | 200 tests | |
| Dye Mixture | ×1 | ×1 |
| 葡萄糖标准品（10 mmol/l）(红盖) | 150 μl×1 | 600 μl×1 |
| 酶(绿盖) | ×1 | ×1 |
| Assay Buffer | 3.5 ml×1 | 14 ml×1 |
| Reconstitution Buffer(蓝盖) | 350 μl×1 | 1.4 ml×1 |
概述
葡萄糖是一种提供体内能量来源的最重要的物质，也是一种主要能量代谢指标。它不仅是糖尿病和肥胖研究的糖代谢指标，在癌症研究中，也常和乳酸一起作为体内细胞代谢的检测指标。最新的研究表明，抑制与葡萄糖代谢和脂质代谢有关的酶的活性，可以抑制癌细胞的生长。
葡萄糖检测试剂盒（Glucose Assay Kit-WST）可以定量检测能量代谢的底物-葡萄糖，通过测定WST反应的吸光度来定量细胞培养基上清液中的葡萄糖。检测限可达浓度为0.02 mmol/l的葡萄糖，适合用96孔板检测，可以同时检测多个样品。
原理
*本试剂盒可以检测细胞上清液＊的葡萄糖的含量，通过检测WST甲赞的吸光度来测定。另外，试剂盒里有葡萄糖标准液，可以制作标准曲线，测定样品中的葡萄糖浓度。
*要测定细胞上清液以外的样品，请事先查看常见问题FAQ“是否有检测细胞上清液以外的实验例?”。
操作步骤
制作葡萄糖标准曲线
可以用试剂盒中的葡萄糖标准液制作出葡萄糖标准曲线，然后通过标准曲线求出样品中的葡萄糖浓度。当葡萄糖浓度在0.5 mmol/l以上时，可以通过稀释样品进行检测。
实验例
用Phloretin抑制葡萄糖的摄取
1. 制备所需浓度Phloretin的Jurkat细胞悬液 (5×105 cells/ml，在RPMI培养基中含有10%的胎牛血清和1%的青霉素-链霉素)。
2. 在6孔板中接种1×106 cells/孔的细胞悬液，在37℃，5% CO2培养箱中过夜培养。
3. 将细胞悬液转移到锥形管中，在1,500 rpm离心5 min。
4. 吸取100 µl上清液至1.5 ml微型管中，用超纯水稀释30倍。
5. 按照葡萄糖标准液的制备方法制备葡萄糖标准液。
6. 在96孔板中分别加入50 µl的样品或葡萄糖标准液。
7. 在每孔中加入50 µl工作液。
8. 在37℃培养箱中培养30 min。
9. 用酶标仪检测450 nm处的吸光度，根据葡萄糖的标准曲线计算样品的葡萄糖浓度。
Phloretin抑制葡萄糖的摄取
实验证实，细胞培养基上清液中的葡萄糖摄入量减少与Phloretin (一种葡萄糖转运抑制剂)浓度之间有依存关系。
常见问题Q&A
| Q1：是否可以检测2-Deoxy-D-glucose？ |
| A1：可以检测2-Deoxy-D-glucose。 |
| Q2：Working Solution的稳定性如何？ |
| A2：Working Solution无法保存，请现配现用。由于对光不稳定，因此配制后请避光，在室温和避光条件下可保存4小时（当Working Solution在曝光下，溶液颜色会由红色变为橙色，背景升高）。 |
| Q3：当有还原性物质存在时是否还可以用这个试剂盒检测？ |
| A3：如果样品中含有还原性的物质，则也会和WST染料发生显色，此时无法准确定量葡萄糖浓度。实验中如遇到以上情况，可以设定药物对照（不含细胞含药物的培养基+试剂）作为背景对照，并从标准曲线和样品的吸光度中减去它。 |
| Q4：是否有检测细胞上清液以外的实验例? |
| A4：有测定细胞内葡萄糖的实验例。操作详情，请参考常见问题FAQ“Q5”。其他的样品没有实验例。 |
| Q5：是否可以检测细胞内葡萄糖？ |
| A5：细胞内葡萄糖也可以检测，请参考下面的样品制备步骤。 请准备「0.1%Triton X-100水溶液」和「滤膜（分子量：10KD ）」 （1）将细胞*1悬液收于1.5 ml微量管中。 ※测定所需的细胞数，需要根据细胞种类进行调整。 |
| Q6:一个试剂盒可以检测样品的数量。 |
| A6：制备标准曲线和样品（n=3）时，可以检测的样品数量如下所示。
标准曲线：8个点(0, 0.0157, 0.0313, 0.0625, 0.125, 0.25, 0.5, 1 mmol/l)(n=3)
96孔板排列示意图（n=3） |
| Q7:可以测量L-Glucose吗？ |
| A7：本产品用于β-D-Glucose测量，不能测量L-Glucose。 |
参考文献
| No | 检测对象 | 文献 |
| 1 | 小鼠血清 | Increased levels of Aβ42 decrease the lifespan of ob/ob mice with dysregulation of microglia and astrocytes, FASEB J., 2019,DOI: 10.1096/fj.201901028RR |
| 2 | 链霉菌 | Enhancement of metabolic flux toward ε-poly-l-lysine biosynthesis by targeted inactivation of concomitant polyene macrolide biosynthesis in Streptomyces albulus, J. Biosci.Bioeng., 2020,DOI: 10.1016/j.jbiosc.2019.12.002 |
| 3 | HCT116细胞 | Serine racemase enhances growth of colorectal cancer by producing pyruvate from serine, Nat. Metab., 2020, 2(1), 81 |
| 4 | P388白血病细胞 | 2-Deoxy-D-glucose enhances the anti-cancer effects of idarubicin on idarubicin-resistant P388 leukemia cell, Oncol. Lett., 2020, 20(1), 962-966 |
| 5 | 小鼠精子细胞 | Macrophage ubiquitin‑specific protease 2 contributes to motility, hyperactivation, capacitation, and in vitro fertilization activity of mouse sperm, Cellular and Molecular Life Sciences, 2020, doi: 10.1007/s00018-020-03683-9 |
*要测定细胞培养上清液以外的样品，请事先查看常见问题FAQ“是否有除检测细胞上清液以外的样品检测实验例”。
特点：
●酶标仪即可检测，无需昂贵的检测仪器
●试剂盒包含所有所需试剂 All in One Kit
●详尽的操作手册
规格性状
产品概述
很多癌细胞都是主要依靠糖酵解途径产生ATP，而近年来的研究发现，如果抑制癌细胞的糖酵解途径，细胞中的主要能量代谢会从糖酵解途径向线粒体的氧化磷酸化途径转移。对于这一现象的研究，有望成为新的抗癌药物研发的靶点，并且在细胞衰老、神经退行性疾病等其他疾病的治疗和药物研发的工作中也具有潜力，因此而备受瞩目。
本试剂盒通过酶标仪就可以方便快捷的检测糖酵解能、细胞代谢途径转移、细胞对糖酵解途径和氧化磷酸化途径的依赖程度。试剂盒中包含所有所需的试剂，可大幅减少实验前的准备工作和时间。
三种评价方式
用Oligomycin抑制氧化磷酸化(OXPHOS)的ATP合成，或者用2-Deoxy-D-glucose(2-DG)抑制糖酵解(Glycolysis)的ATP合成，然后通过检测ATP的量(发光法)和Lactate的量(吸光度法)对下图中的①~③进行评价。
实验例
对糖酵解抑制剂(2-DG)处理后的HeLa细胞进行糖酵解能评价和代谢途径转移评价。糖酵解能评价(左图)的结果可以看出，HeLa细胞经过糖酵解抑制剂作用后，糖酵解能明显降低。而代谢途径转移评价的结果(右图)可以看出，糖酵解抑制剂作用后，HeLa细胞内的代谢途径开始向氧化磷酸化转移，由线粒体产生的ATP明显增加。
常见问题Q&A
| Q：一个试剂盒可以检测多少个样品？ |
| A：按照每个样品3个复孔计算，可检测的样品数请见下表： |
※以上是按照不做预实验，最多可能检测的样品数量。
※Lactate Assay时，如果培养基内含有血清，建议单独检测含有血清的培养基，作为背景空白扣除。
※以上是先做预实验，再做正式实验时，最多可能检测的样品数量。
※Lactate Assay时，如果培养基内含有血清，建议单独检测含有血清的培养基，作为背景空白扣除。
糖酵解能评价(Lactate Assay)的孔板设置例(n=3时)
(左：不做预实验； 右：做预实验)
代谢途径转移评价(ATP Assay)的孔板设置例(n=3时)
(左：不做预实验； 右：做预实验)
代谢途径依赖程度评价的孔板设置例(n=3时)
(左：ATP Assay； 右：Lactate Assay)(不做预实验)
代谢途径依赖程度评价的孔板设置例(n=3时)
(左：ATP Assay； 右：Lactate Assay)(做预实验)
| Q：在做糖酵解能评价时，实验孔与空白孔(只含培养基)的吸光度没有变化，是什么原因？有哪些改善方法？ |
| A：可能的原因是细胞释放的乳酸量过少，建议提高细胞数，增加培养时间(3小时⇒5小时)。 |
| Q：是否需要通过使用蛋白质定量分析使乳酸和ATP浓度正常化？ |
| A：Oligomycin和2-DG处理5小时的检测结果，用蛋白定量校正和不校正的结果几乎没有变化。但是，如果检测中使用其他药物时，请预先确认该药物是否会对细胞数和蛋白质的量有影响，然后再用本试剂盒检测。 |
需要用蛋白质定量进行校正的时候，请参考下图中的步骤。
※在进行蛋白质定量校正的时候，由于ATP Assay的试剂的原因，不能使用ATP Assay或Lactate Assay检测时使用的细胞，请额外专门准备蛋白质定量用的细胞悬液。
| Q：Lactate Assay时，是否可以用450 nm以外的滤光片检测？ |
| A：如果没有450 nm的滤光片，可以用490 nm滤光片检测，不过检测得到的吸光度的值要比450 nm检测时低。 |
| Q：发光信号是否稳定？ |
| A：发光信号在3小时以内都稳定。不过，发光信号会受温度和光照影响，如果不能立即检测的话，请在避光和25℃环境下静置。 |
| Q：检测时是否可以用白色96孔板以外的孔板？ |
| A：黑色和透明孔板都会造成发光强度的降低，透明孔板还会导致背景升高。因此建议使用白色96孔板。 |
| Q: ATP检测时用的发光法，检测波长为多少？ |
| A：由于P是通过萤光素检测，所以检测波长为556 nm。 |
特点：
● 检测灵敏度高
● 操作简便，用时短
● 可以用荧光酶标仪做高通量筛选
● 荧光染料泄露少，数据重现性高
凑单关联产品TOP5
NO.1. Cell Viability Assay Kit – Luminescent Detection 细胞增殖/毒性检测-发光法(CCK-L)
NO.2. Caspase-3 Assay Kit-Colorimetric- 细胞凋亡检测
NO.3. Cell Counting Kit-8 细胞增殖毒性检测
NO.4. DALGreen – Autophagy Detection 细胞自噬检测
NO.5. FerroOrange 细胞亚铁离子检测
产品概述
细胞通过摄入各种各样的营养物质并在胞内的代谢作用下产生能量。营养物代谢的过程随着细胞外环境、细胞状态、细胞种类的不同亦不尽相同。近年来的研究发现，营养代谢不仅与能量的产生密切相关，还与基因表达等各种各样的细胞调节机制有关。葡萄糖是最重要的一种营养物质，细胞摄取葡萄糖的过程对于研究和理解细胞机能非常重要。细胞摄取葡萄糖的评价方法主要是放射性同位素示踪法。但是由于放射性同位素示踪法操作繁杂，泛用性并不高。另外，还有一种使用2-Deoxy-D-glucose(2-DG)的酶循环法，该方法虽然可以进行孔板检测，但是无法用于荧光显微镜和流式细胞仪观察。因此，最近常用的方法是通过葡萄糖类似物2-NBDG的荧光检测法1)。然而，2-NBDG也有荧光强度弱、灵敏度低的问题，而且被细胞摄取的2-NGDG还有从细胞中向外泄漏的情况出现。同仁化学研究新开发的荧光葡萄糖类似物Glucose Uptake Probe-Green是一种比2-NBDG灵敏度更高的葡萄糖摄取能力检测试剂。而且使用本试剂盒中包含的Washing and Imaging (WI) Solution可以抑制探针从细胞内泄漏，得到重现性更高的实验数据。
产品优势
与传统方向相比的优势！ 4大特征
由于采用高亮度的荧光染料，相较于传统方法(2-NBDG)可以在更短时间内进行高灵敏度检测。
① 高灵敏度
2-NBDG在水中的荧光强度很低，而本试剂盒采用的荧光染料可以进行高灵敏度的葡萄糖摄取能力检测。
<观测条件>
细胞： A549细胞
检测仪器：荧光显微镜
检测滤光片：GFP (Ex: 470 /40 nm; Em: 525 /50 nm)
② 快速检测
使用高亮度的Glucose Uptake Probe-Green，即使使用2-NBDG完全相同的实验步骤，也可以大幅缩短实验时间。
操作的前处理、染色(进入细胞内的过程)的步骤只需要清洗3次，非常简便
③ 荧光酶标仪的多样品检测
2-NBDG很难用于荧光酶标仪的检测，而本试剂盒可用于荧光酶标仪的高通量筛选实验。
<检测条件>
细胞：A549细胞
Ex: 488 nm; Em: 520 nm
④ 减少荧光染料的泄漏
使用试剂盒附带的WI Solution清洗细胞，可以抑制染料进入细胞后的泄漏，得到重现性更高的数据。
使用HBSS清洗细胞时
使用WI Solution清洗细胞时
(Scale Bar: 50 μm)
<观测条件>
细胞：A549细胞
检测仪器：荧光显微镜
检测滤光片：GFP (Ex: 470 /40 nm; Em: 525 /50 nm)
与传统法的比较
Glucose Uptake Probe-Green和2-NBDG都可以用于荧光显微镜和流式细胞仪的检测。而相比较于2-NBDG的激发波长，Glucose Uptake Probe-Green对于488 nm的激发光以及GFP, FITC滤光片的适用度更高。
| 产品名 | 荧光
显微镜 |
荧光
酶标仪 |
流式
细胞仪 |
染料滞留时间 | 荧光特性 |
| Glucose Uptake Assay Kit-Green | 〇 | 〇 | 〇 | 1 h※ | λex: 507 nm, λem: 518 nm |
| 2-NBDG | 〇 | × | 〇 | 30 min以下※ | λex: 465 nm, λem: 540 nm |
※A549细胞的检测结果，不同的细胞种类，染料的滞留时间可能会有差异。
相关产品区别
与Glucose Assay Kit的不同点
Glucose Uptake Probe-Green和Glucose Assay Kit-WST(货号:G264)的不同点。
1.Glucose Assay Kit-WST可以定量检测细胞上清液中葡萄糖的消耗量。
Glucose Uptake Assay Kit无法定量检测葡萄糖。
2.Glucose Uptake Assay Kit-Green可短时间内检测葡萄糖摄取能力的差值。
Glucose Assay Kit-WST无法在短时间内检测葡萄糖量的变化。
Glucose Assay Kit-WST与本试剂盒的差别，通过下面的检测实例来说明。
实验例：用葡萄糖摄取抑制剂(Cytochalasin B)处理的HepG2细胞的葡萄糖消费量和葡萄糖摄取能力的检测。
实验的流程和检测结果：
实验例
实验例1：Cytochalasin B对葡萄糖摄取的抑制作用
HepG2细胞经过葡萄糖转运蛋白抑制剂Cytochalasin B处理后，使用本试剂盒对葡萄糖摄取能力的抑制作用进行高灵敏度观察以及数值化的检测。
荧光显微镜观察
(Scale Bar: 50 μm)
<观测条件>
细胞：HepG2细胞
使用培养基：MEM (5.5 mmol/l Glucose)
培养条件：5 µmol/l Cytochalasin B / MEM （5.5 mmol/l Glucose, 10% FBS）, 37℃, 24 h
染色条件：Glucose Uptake Probe (500倍稀释)/DMEM （0 mol/l Glucose）, 37℃, 15 min
检测仪器：荧光显微镜； 滤光片：GFP (Ex: 470 /40 nm; Em: 525 /50 nm)
荧光酶标仪
<检测条件>
Ex: 488 nm; Em: 520 nm
实验例2：Insulin(胰岛素)对细胞葡萄糖摄取能力的促进
胰岛素对脂肪细胞(adipocyte)的葡萄糖摄取能力的影响通过本试剂盒进行高灵敏度检测。
荧光显微镜观察
(Scale Bar: 50 μm)
<观测条件>
细胞：mouse adipocyte
使用培养基：DMEM (5.5 mmol/l Glucose, 10% FBS)
刺激条件：0 or 1 µmol/l Insulin / DMEM (0 mmol/l Glucose , serum free), 37℃, 15 min
染色条件：Glucose Uptake Probe-Green (500倍稀释) /DMEM (0 mmol/l Glucose, serum free), 37℃, 15 min
检测仪器：荧光显微镜； 滤光片：GFP (Ex: 470 /40 nm; Em: 525 /50 nm)
荧光酶标仪检测
<检测条件>
Ex: 488 nm; Em: 520 nm
※由于脂肪细胞的特性，很难在孔板上均匀分布，所以实验数据会有一些孔间差。
<实验操作>
1.脂肪细胞分别接种到不同的ibidi 96孔板中，过夜培养。
2.用不含葡萄糖的DMEM培养基清洗细胞2次后，加入不含葡萄糖的培养基(0 or 1 μmol/l Insulin)。
3.在37℃下培养15 min。
4.加入用不含葡萄糖的培养基500倍稀释的Probe solution， 37℃下培养15 min。
5.用预冷至4℃的WI Solution(1x)清洗3次后，再次添加WI Solution(4℃)。
6.分别用荧光显微镜和荧光酶标仪检测。
实验例3：前脂肪细胞和细胞脂肪细胞的葡萄糖摄取能力的比较
使用本试剂盒对前脂肪细胞(preadipocyte)和脂肪细胞(adipocyte)的葡萄糖摄取能力进行高灵敏度检测。
荧光显微镜观察
(Scale Bar: 50 μm)
<观测条件>
细胞：preadipocyte, adipocyte
使用培养基：DMEM (5.5 mmol/l Glucose, 10% FBS)
染色条件：Glucose Uptake Probe-Green (500倍稀释) /DMEM (0 mmol/l Glucose, serum free), 37℃, 15 min
检测仪器：荧光显微镜； 滤光片：GFP (Ex: 470 /40 nm; Em: 525 /50 nm)
荧光酶标仪检测
<检测条件>
Ex: 488 nm; Em: 520 nm
※由于脂肪细胞的特性，很难在孔板上均匀分布，所以实验数据会有一些孔间差。
<实验操作>
1.前脂肪细胞和脂肪细胞分别接种到不同的ibidi 96孔板中，过夜培养。
2.用不含葡萄糖的DMEM培养基清洗细胞2次后，加入不含葡萄糖的培养基。
3.在37℃下培养15 min。
4.加入用不含葡萄糖的培养基500倍稀释的Probe solution， 37℃下培养15 min。
5.用预冷至4℃的WI Solution(1x)清洗3次后，再次添加WI Solution(4℃)。
6.分别用荧光显微镜和荧光酶标仪检测。
实验例4：饥饿培养引起的细胞自噬和葡萄糖摄取变化
用自噬体染料DAPRed和自噬溶酶体染料DALGreen染色HeLa细胞后，用不含氨基酸的培养基培养3小时诱导细胞自噬。通过DAPRed和DALGreen的荧光强度增高确认细胞发生了细胞自噬，另外通过使用Glucose Uptake Probe-Blue发现细胞摄取葡萄糖的能力上升。
(Scale Bar: 50 μm)
<检测条件>
荧光显微镜
Blue: Ex = 340-380 nm, Em = 435-485 nm
Green: Ex = 450-490 nm, Em = 500-550 nm
Red: Ex = 533-557 nm, Em = 570-640 nm
常见问题Q&A
| Q1: Glucose Uptake Probe-Green具体是通过哪种葡萄糖转运蛋白进入细胞的? |
| A：对于具体的每一种葡萄糖转运蛋白的特异性目前还没有详细的数据。 |
| Q2：目前有过检测实例的细胞有哪些? |
| A：目前的检测实例细胞系请参考下表： |
| 细胞种类 | Probe stock solution
的稀释倍率 |
染色时间 | |
| 人肺腺癌细胞 | A549 | x 500 | 15 min |
| 人肝癌细胞 | HepG2 | x 500 | 15 min |
| 前脂肪细胞 | preadipocyte(3T3-L1) | x 500 | 15 min |
| 脂肪细胞 | adipocyte(3T3-L1) | x 500 | 15 min |
| 恶性黑色肿瘤细胞 | MO5 | x 500 | 15 min |
| 小鼠成肌细胞 | C2C12 | x 500 | 5 min |
| 人星形胶质瘤细胞 | U-251 MG | x 500 | 15 min |
| 人子宫颈癌细胞 | HeLa | x 500 | 15 min |
| 小鼠肺癌细胞 | 3LL | x 50000 | 15 min |
| T细胞 | CD4+ T cell | x 50, x500 | 15 min |
| 小鼠巨噬细胞 | J774.1 | x 500 | 15 min |
| 线虫 | N2 | x 500 | 90 min |
| Q3：Glucose Uptake Probe-Green被细胞摄入后，会被分解或代谢掉吗? |
| A：染料的荧光部分非常稳定，实验范围内的操作不会造成分解。另外，类葡萄糖的部位，从结构上考虑可能会被Hexokinase(己糖激酶)磷酸化，除此以外应该不会参加任何代谢反应。 |
| Q4：Glucose Uptake Probe-Green被活细胞摄入后，可以进行细胞固定的操作吗? |
| A：由于荧光探针会从细胞内漏出，染色后无法进行细胞固定。 |
| Q5：用荧光酶标仪检测时候，对孔板有什么特别要求吗? |
| A：需要使用荧光检测用的细胞培养板。 |
| Q6：Probe working solution可以长期保存吗? |
| A：Probe working solution无法长期保存，请现配现用。Probe stock solution冷冻可以保存一个月。 |
| Q7：无法观察到荧光信号变化的时候，应该怎么办? |
| A：预实验的时候可以先从稀释浓度(x250~x1,000)、染色时间(5 min~1 h)范围内进行摸索。 |
| Q8：荧光背景高的时候，应该怎么办? |
| A：可能是由于有未被细胞摄入的残留荧光染料。请用WI Solution再多进行一次清洗操作。 |
| Q9：Glucose Uptake Probe-Green对细胞有毒性吗? |
| A：使用同仁化学研究所的Cell Counting Kit-8(货号:CK04)对A549细胞的Glucose Uptake Probe-Green细胞毒性进行了检验，没有发现细胞毒性的产生。 |
| Q10：用WI solution清洗之后，荧光染料可以在细胞内停留多长时间? |
| A：一般在室温下可以保持在细胞内1 h左右，不同的细胞种类，时间可能会有一定差别。 |
| Q11：可以对葡萄糖进行定量检测吗? |
| A：本产品不能用于葡萄糖的定量检测。如果需要定量检测培养基中的葡萄糖的消耗量或者细胞内的葡萄糖量，可以使用同仁化学研究所的Glucose Assay Kit-WST(货号:G264)。 |
| Q12：可以对被细胞摄入的染料进行定量吗? |
| A：不可以对细胞摄入的染料进行定量。本试剂盒是葡萄糖摄取能力强弱或增减的检测试剂盒。 |
| Q13：如果无法通过葡萄糖的竞争性抑制细胞探针的摄取，该如何解决？ |
A：竞争性抑制是否发生取决于每个细胞中的葡萄糖转运蛋白的表达水平和类型。（例如：HepG2细胞）
在这种情况下，使用2-脱氧葡萄糖(2-DG)进行预处理可能会在葡萄糖竞争抑制方面产生差异。 请参考Glucose Uptake Assay Kit-Green(产品代码:UP02)的使用示例。 2-DG预处理对探针摄取的抑制和葡萄糖竞争性抑制(HepG2细胞) 1.将细胞接种在培养皿或微孔板中，并在5% CO₂培养箱(37°C)中培养过夜。 2.除去培养基[DMEM (10% FBS，高葡萄糖)]后，加入50 mmol/l 2-DG/培养基，并 在5% CO₂培养箱(37℃)中培养细胞2小时。 3.清洗细胞两次。 4.加入预热的DMEM(无葡萄糖，无血清)并将细胞在5%CO₂中孵育 在培养箱(37°C)中培养15 min。 5.除去上清液后，加入预热的探针溶液并在5% CO₂中孵育 在培养箱(37°C)中培养15 min。 6.除去上清液后，用冷却的WI溶液(1x)洗涤细胞两次。 7.除去上清液后，加入冷却后的WI溶液(1x)，并在室温下培养 5分钟。 8.除去上清液后，加入冷却的WI溶液(1x)。 9.荧光显微镜下观察细胞。
|
| Q14: 以下为不同细胞添加抑制剂后，葡萄糖摄取能力检测实验。 |
 |
规格性状
| Glucose Uptake Probe-Green ×1
WI Solution (50X) 5 ml ×1 供参考的可测次数 每个试剂盒大约可检测12枚35 mm dish或1枚96孔板 |
特点：
● 检测灵敏度高
● 操作简便，用时短
● 可以用荧光酶标仪做高通量筛选
● 荧光染料泄露少，数据重现性高
产品概述
细胞通过摄入各种各样的营养物质并在胞内的代谢作用下产生能量。营养物代谢的过程随着细胞外环境、细胞状态、细胞种类的不同亦不尽相同。近年来的研究发现，营养代谢不仅与能量的产生密切相关，还与基因表达等各种各样的细胞调节机制有关。葡萄糖是最重要的一种营养物质，细胞摄取葡萄糖的过程对于研究和理解细胞机能非常重要。细胞摄取葡萄糖的评价方法主要是放射性同位素示踪法。但是由于放射性同位素示踪法操作繁杂，泛用性并不高。另外，还有一种使用2-Deoxy-D-glucose(2-DG)的酶循环法，该方法虽然可以进行孔板检测，但是无法用于荧光显微镜和流式细胞仪观察。因此，最近常用的方法是通过葡萄糖类似物2-NBDG的荧光检测法1)。然而，2-NBDG也有荧光强度弱、灵敏度低的问题，而且被细胞摄取的2-NGDG还有从细胞中向外泄漏的情况出现。同仁化学研究新开发的荧光葡萄糖类似物Glucose Uptake Probe-Red是一种比2-NBDG灵敏度更高的葡萄糖摄取能力检测试剂。而且使用本试剂盒中包含的Washing and Imaging (WI) Solution可以抑制探针从细胞内泄漏，得到重现性更高的实验数据。
产品优势
与传统方向相比的优势！ 4大特征
Glucose Uptake Probe-Red是红色荧光染料，可以与红色野外其他颜色的荧光染料共染色。另外，由于采用高亮度的荧光染料，相较于传统方法(2-NBDG)可以在更短时间内进行高灵敏度检测。
① 与其他荧光染料的共染色
可以根据实验需求，选择其他荧光染料与Glucose Uptake Probe进行共染色，一次检测多个指标。下图是用Glucose Uptake Probe Red与脂肪滴(绿色：Lipi-Green货号LD02)共染色脂肪细胞分化而来的3T3-L1细胞的荧光图像。
<观测条件>
细胞： 3T3-L1
检测条件：
Glucose Uptake Probe-Red：Ex = 533-557 nm; Em = 570-640 nm
Lipi-Green：Ex = 450-490 nm; Em = 500-550 nm
② 可用荧光显微镜或流式细胞仪检测
Glucose Uptake Probe-Red除了荧光显微镜和流式细胞仪以外还可以用荧光酶标仪进行检测。下面是A549细胞的葡萄糖摄取能力的检测结果，可以明显观察到高浓度葡萄糖对Glucose Uptake Probe-Red摄入的抑制作用。
细胞：A549
检测条件
Glucose Uptake Assay Kit-Red：Ex = 545 nm, Em = 605 nm
③ 快速检测
使用高亮度的Glucose Uptake Probe-Blue，即使使用2-NBDG完全相同的实验步骤，也可以大幅缩短实验时间。
操作的前处理、染色(进入细胞内的过程)的步骤只需要清洗3次，非常简便。
④ 减少荧光染料的泄漏
使用试剂盒附带的WI Solution清洗细胞，可以抑制染料进入细胞后的泄漏，得到重现性更高的数据。详细的实验数据请参考Glucose Uptake Assay Kit-Green 货号UP02的页面。
与传统法的比较
*以上结果源自A549细胞实验的结果，其他细胞系的向胞外泄露的时间可能不同。
相关产品区别
与Glucose Assay Kit的不同点
Glucose Uptake Probe-Green和Glucose Assay Kit-WST(货号:G264)的不同点。
1.Glucose Assay Kit-WST可以定量检测细胞上清液中葡萄糖的消费量。
Glucose Uptake Assay Kit无法定量检测葡萄糖。
2.Glucose Uptake Assay Kit-Green可短时间内检测葡萄糖摄取能力的差值。
Glucose Assay Kit-WST无法在短时间内检测葡萄糖量的变化。
详细的实验数据请参考Glucose Uptake Assay Kit-Green 货号UP02 的页面。
实验例
实验例1：Cytochalasin B对葡萄糖摄取的抑制作用
HepG2细胞经过葡萄糖转运蛋白抑制剂Cytochalasin B处理后，使用本试剂盒对葡萄糖摄取能力的抑制作用进行高灵敏度观察。
荧光显微镜观察
(Scale Bar: 50 μm)
<观测条件>
细胞：HepG2细胞
使用培养基：MEM (5.5 mmol/l Glucose)
培养条件：5 µmol/l Cytochalasin B / MEM （5.5 mmol/l Glucose, 10% FBS）, 37℃, 24 h
染色条件：Glucose Uptake Probe (500倍稀释)/DMEM（0 mol/l Glucose）, 37℃, 15 min
检测仪器：荧光显微镜；
Glucose Uptake Assay Kit-Blue: Ex = 340-380 nm; Em = 435-485 nm
Glucose Uptake Assay Kit-Green: Ex = 450-490 nm; Em = 500-550 nm
Glucose Uptake Assay Kit-Red: Ex = 533-557 nm; Em = 570-640 nm
实验例2：Insulin(胰岛素)对细胞葡萄糖摄取能力的促进
胰岛素对脂肪细胞(adipocyte)的葡萄糖摄取能力的影响通过本试剂盒进行高灵敏度检测。
荧光显微镜观察
(Scale Bar: 50 μm)
<观测条件>
细胞：mouse adipocyte
使用培养基：DMEM (5.5 mmol/l Glucose, 10% FBS)
刺激条件：0 or 1 µmol/l Insulin / DMEM (0 mmol/l Glucose , serum free), 37℃, 15 min
染色条件：Glucose Uptake Probe-Green (500倍稀释) /DMEM (0 mmol/l Glucose, serum free), 37℃, 15 min
检测仪器：荧光显微镜；
Glucose Uptake Assay Kit-Blue: Ex = 340-380 nm; Em = 435-485 nm
Glucose Uptake Assay Kit-Green: Ex = 450-490 nm; Em = 500-550 nm
Glucose Uptake Assay Kit-Red: Ex = 533-557 nm; Em = 570-640 nm
常见问题Q&A
| Q1: Glucose Uptake Probe-Red具体是通过哪种葡萄糖转运蛋白进入细胞的？ |
| A：对于具体的每一种葡萄糖转运蛋白的特异性目前还没有详细的数据。 |
| Q2: Glucose Uptake Probe-Red被细胞摄入后，会被分解或代谢掉吗？ |
| A：染料的荧光部分非常稳定，实验范围内的操作不会造成分解。另外，类葡萄糖的部位，从结构上考虑可能会被Hexokinase(己糖激酶)磷酸化，除此以外应该不会参加任何代谢反应。 |
| Q3: Glucose Uptake Probe-Red被活细胞摄入后，可以进行细胞固定的操作吗？ |
| A：由于荧光探针会从细胞内漏出，染色后无法进行细胞固定。 |
| Q4: 用荧光酶标仪检测时候，对孔板有什么特别要求吗？ |
| A：需要使用荧光检测用的细胞培养板。 |
| Q5:Probe working solution可以长期保存吗？ |
| A：Probe working solution无法长期保存，请现配现用。Probe stock solution冷冻可以保存一个月。 |
| Q6: 无法观察到荧光信号变化的时候，应该怎么办？ |
| A：预实验的时候可以先从稀释浓度（x250~x1,000）、染色时间(5 min~1 h)范围内进行摸索。 |
| Q7: 荧光背景高的时候，应该怎么办？ |
| A：可能是由于有未被细胞摄入的残留荧光染料。请用WI Solution再多进行一次清洗操作。 |
| Q8: 用WI solution清洗之后，荧光染料可以在细胞内停留多长时间？ |
| A：一般在室温下可以保持在细胞内1 h左右，不同的细胞种类，时间可能会有一定差别。 |
| Q9: 可以对葡萄糖进行定量检测吗？ |
| A：本产品不能用于葡萄糖的定量检测。如果需要定量检测培养基中的葡萄糖的消耗量或者细胞内的葡萄糖量，可以使用同仁化学研究所的Glucose Assay Kit-WST(货号:G264)。 |
| Q10: 可以对被细胞摄入的染料进行定量吗？ |
| A：不可以对细胞摄入的染料进行定量。本试剂盒是葡萄糖摄取能力强弱或增减的检测试剂盒。 |
| Q11: 如果无法通过葡萄糖的竞争性抑制细胞探针的摄取，该如何解决？ |
| A：竞争性抑制是否发生取决于每个细胞中的葡萄糖转运蛋白的表达水平和类型。（例如：HepG2细胞）
在这种情况下，使用2-脱氧葡萄糖(2-DG)进行预处理可能会在葡萄糖竞争抑制方面产生差异。 请参考Glucose Uptake Assay Kit-Green(产品代码:UP02)的使用示例。 2-DG预处理对探针摄取的抑制和葡萄糖竞争性抑制(HepG2细胞) 1.将细胞接种在培养皿或微孔板中，并在5% CO₂培养箱(37°C)中培养过夜。 2.除去培养基[DMEM (10% FBS，高葡萄糖)]后，加入50 mmol/l 2-DG/培养基，并 在5% CO₂培养箱(37℃)中培养细胞2小时。 3.清洗细胞两次。 4.加入预热的DMEM(无葡萄糖，无血清)并将细胞在5%CO₂中孵育 在培养箱(37°C)中培养15 min。 5.除去上清液后，加入预热的探针溶液并在5% CO₂中孵育 在培养箱(37°C)中培养15 min。 6.除去上清液后，用冷却的WI溶液(1x)洗涤细胞两次。 7.除去上清液后，加入冷却后的WI溶液(1x)，并在室温下培养 5分钟。 8.除去上清液后，加入冷却的WI溶液(1x)。 9.荧光显微镜下观察细胞。
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| Q12: 目前有过检测实例的细胞有哪些? |
 |
| Q13: 以下为不同细胞添加抑制剂后，葡萄糖摄取能力检测实验。 |
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规格性状
| Glucose Uptake Probe-Red ×1
WI Solution (50X) 5 ml ×1 供参考的可测次数 每个试剂盒大约可检测12枚35 mm dish或1枚96孔板 |
特点：
● 数据可靠，不会与NAD+及NADH反应
● 只有Dojindo的试剂盒中带有可以简单去除蛋白质的微量管
● 享有显色底物WST专利
凑单关联产品TOP5
NO.1. FerroOrange 细胞亚铁离子检测
NO.2. Glucose Assay Kit-WST 葡萄糖检测
NO.3. Liperfluo 细胞脂质过氧化物检测
NO.4. Lactate Assay Kit-WST 乳酸检测
NO.5. Lipi-Green 脂滴检测（绿色）
试剂盒内含
概述
烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(NADP) 是磷酸戊糖途径（一种细胞代谢途径）反应中一种重要的辅因子。NADP以氧化态NADP+和还原态NADPH的形式存在于细胞中。NADPH不光对脂肪酸、胆固醇而且对还原型谷胱甘肽的生成至关重要。另外最近的研究表明，NADP+/NADPH通过限制碳水化合物的摄入来延长寿命与NADP+/NADPH有很大关联。
NADP/NADPH Assay Kit-WST能定量检测细胞中总NADP+/NADPH、NADPH和NADP+的量，并计算它们的比值。细胞内NADPH水平可以用试剂盒内的Extraction Buffer裂解细胞后加热进行定量检测。而细胞内的NADP+水平则可以通过总NADP+/NADPH减去NADPH的量计算得到。
原理
技术资料
分别检测NADP+和NADPH
分别测定NADP+和NADPH的操作步骤
*只有Dojindo的试剂盒中带有可以简单去除蛋白质的微量管
用试剂盒内的提取缓冲液及去除蛋白质用的微量管，能简便地制备细胞裂解液。 通过加热细胞裂解液能单独检测细胞内NADPH量，而细胞内的NADP+量则可以通过总NADP+/NADPH量减去NADPH量的计算得到。
在本试剂盒中，当n=3时，可以测量12个样品和8个标准样品。使用超过12个样品时，您需要准备单独的超滤管。
使用NADP+/NADPH作为标记的研究
检索来源：Google Scholar
检索关键词：
NADP/NADPH：“NADP/NADPH”
线粒体：”NADP/NADPH”Mitochondria
癌：”NADP/NADPH”Cancer
氧化应激：”NADP/NADPH”Oxidative Stress
孔板检测中数据的可靠性
通过同时检测试剂盒内的标准溶液，可以对浓度在0.01-1 μmol/l的总NADP+/NADPH和NADPH进行定量。如果样品中的总NADP+/NADPH的浓度>1 μmol/l，可以通过稀释样品来调节。实验证实本试剂盒(NADP/NADPH Assay Kit-WST)不会与NAD+及NADH反应。
操作步骤
（1）按下图，在每孔中分别加入50 μl的标准液和样品溶液。
※为了获得准确的数据，建议每个样品做3个复孔。
（2）在每孔中加入50 μl Working Solution。
※由于在加入Working Solution后酶会立刻反应，请用多通道移液器以减少由于加液时间延迟而导致的实验误差。
（3）在37°C培养60 min。
※培养时请密封培养板，以防止液体蒸发。
（4）用酶标仪在450 nm处检测吸光度。
（5）用标准曲线测定样品中总NADP+/NADPH和NADPH的量。
※如果原样品在检测前已稀释，可用稀释倍率乘以检测的数值。
※NADP+的量可用下列计算公式计算：总NADP+/NADPH-NADPH的量计算得到。
NADP+=总NADP+/NADPH-NADPH
实验例
细胞样品检测实验例 (加入抗癌药物Doxorubicin)
向Jucket细胞中 (3×106 cells)加入终浓度为500 nmol/l的Doxorubicin (Dox)，在培养24 h后检测NADP+/NADPH 比值和还原型/氧化型谷胱甘肽的比值(GSH/GSSG)。用本试剂盒检测PBS清洗后的细胞的NADP+/NADPH比值，用 GSSG/GSH Quantification Kit II (货号：G263) 检测谷胱甘肽的比值。
在细胞内加入DOX后，产生的ROS(H2O2) 破坏了DNA、DNA修复酶 (PARP*) 被激活， 并且NADP+被其消耗。为了补充不足的NADP+，NADPH氧化酶被激活，结果在数据中则会表现为NADP+的增加。与此同时还原型谷胱甘肽 (GSH) 会被产生的ROS所消耗，因此GSH/GSSG的比值会下降。
常见问题Q&A
| Q1：该试剂盒可以检测多少个样本？ |
| A1：
*所有样品均测定3次（n=3） 上表中显示了当标准样品从2 μmol/l连续稀释，作出一条共计8个点（n=3）的标准曲线时可以检测的样品数量。如果分为2次检测，由于需要重复做一条标准曲线，因此样品检测的数量会更少。 |
| Q2：可以单独购买过滤管吗？ |
| A2：不可以，我们不单独出售过滤管。如果需要其他耗材，可以使用市场上售卖的过滤管。 |
| Q3：工作液稳定吗？ |
| A3：工作液无法长期保存。请在使用前配制工作液，由于工作液对光敏感请注意避光。该工作液在室温下可避光保存4小时。 |
| Q4：样品颜色没有变化，是什么原因？ |
| A4：样品中的NAD含量可能低于使用此试剂盒可测定的检测限度，在这种情况下，请增加细胞数，或者如果检测样品被稀释，则在检测前降低稀释比例。 |
特点：
● 适用于普通荧光酶标仪
● 不需要昂贵的仪器、特殊介质和孔板
● 带OCR计算表的一体式试剂盒
产品规格
OCR是线粒体功能的重要指标
由于氧主要在线粒体氧化磷酸化产生三磷酸腺苷（ATP）的过程中消耗，因此其耗氧率（OCR）是分析线粒体功能的指标。众所周知，癌细胞通过糖酵解途径产生ATP，其效率低于氧化磷酸化。在免疫细胞中，氧化磷酸化的优势是抑制抗肿瘤，而糖酵解途径的优势促进抗肿瘤作用。因此，细胞的OCR作为能量代谢的检测指标。
产品概述
细胞外氧消耗量试剂盒包括氧气探针，其具有随着介质中氧气浓度的降低而增加荧光强度的特性，矿物油阻止氧气从空气中流入。
在用荧光显微镜根据细胞外氧浓度测量荧光强度之后，根据Stern-Volmer方程计算细胞的OCR（自动计算表）。
*该产品在群马大学Toshitada Yoshihara博士的指导下实现了产品化。
与现有方法比较
到目前为止，OCR测量需要昂贵的设备，如通量分析仪，实时动态检测酶标仪，以及酶标仪的功能调节。该试剂盒推荐给初此使用的人，因为它可以与常规荧光酶标仪一起使用，并附带所有必要试剂的完整包装。
与石英分析仪对比
石英分析仪（XFe24）和本试剂盒在相同条件下（细胞类型、细胞数量和FCCP浓度）进行测量。
得到XFe24与本试剂盒相关氧消耗速度变化的数据。
细胞种类: HepG2
细胞数: 5×10⁴ cells/well
试剂: FCCP (Carbonyl cyanide 4-(trifluoromethoxy)phenylhydrazone)
FCCP 浓度: 2 μmol/l
实验例：抑制线粒体电子传输链
用抗霉素刺激大鼠细胞，评估线粒体电子运输链抑制后细胞状态的变化，检测多种指标。
结果表明，电子传输链的抑制导致（1）线粒体膜电位的降低和（2）OCR的降低。此外，观察到（3）整个糖酵解途径的NAD+/NADH比率降低，这是由于丙酮酸到乳酸的代谢增加，以维持糖酵解通路；（4）由于活性氧（ROS）增加，GSH耗竭；（6）由于谷胱甘肽生物合成所需NADH减少，NADP+/NADPH比率增加。
实验例：细胞最大呼吸能力评估
在HepG2细胞中，通过FCCP刺激后OCR值的变化来评估细胞的最大呼吸。
在FCCP浓度分别2µmol/l和4µmol/l 测量OCR。与2µmol/l相比，在4µmol/l时观察到OCR降低，表明在2µmol/l FCCP时最大呼吸。
细胞: HepG2
细胞数: 5×104 cells/well
试剂: FCCP
FCCP 浓度 2, 4 μmol/l
Q&A
| Q:本试剂盒可以检测多少样本？ |
| A:当测试一种细胞类型的相同数量的细胞时，可以测量24个样品。
*如果实验中使用了两种以上的细胞类型或多个细胞编号，则必须准备单独的空白和对照，并且可以测量的样本数量会有所不同。 有关详细信息，请参考手册中的板布局示例。 |
| Q:悬浮细胞有什么实验案例吗？ |
| A:我们准备了一个大鼠细胞实验的例子。＜说明＞
（1） 将大鼠细胞（3.0×106细胞/ml）悬浮于RPMI培养基中作为空白3，将大鼠细胞（3.0×106细胞/ml）悬于工作溶液中作为对照或样品。将细胞接种在100µl（300000个细胞/孔）的96孔黑色透明底部微孔板中。
（2） 向空白1中加入100µl RPMI培养基，向空白2中加入100μl工作溶液。
（3） 将微孔板放置在预先设定为37°C的读板器中，孵育30分钟。
（4） 向空白1、空白2、空白3和对照品中加入10µl RPMI培养基。
（5） 将用RPMI培养基稀释的样品溶液（抗霉素或FCCP溶液）分10µl加入样品中。
（6） 加入样品溶液后，立即向每个孔中加入一滴矿物油。
（7） 将微板放置在37°C的平板读数器中，孵育5分钟。
（8） 在一个时间过程中，用荧光板读取器每10分钟测量一次强度，持续200分钟（Ex:500nm，Em:650nm，底部读数）。 （9） OCR值通过将获得的强度值输入下载的专用Excel计算表来计算。 每孔所需的样品和试剂数量。
|
| Q:如何使用此试剂盒计算OCR？ |
| A:请使用Excel计算表并遵循以下说明
＜OCR计算程序概述＞ （1） 将OCR测量获得的强度值输入计算表，使用Stern-Volmer公式自动计算氧含量（nmol）。 （2） 根据时间（min）与氧含量（nmol）的关系图，检查所有测量条件下获得的线性范围。 （3） 计算步骤（2）中确认的时间（min）和氧含量（nmol）范围内的斜率。 （4） 根据步骤（3）中计算的斜率计算OCR（pmol/min）。 有关详细信息，请参阅手册中的“分析”。 *需要计算OCR的客户请至【网站首页】-【技术支持】-【实验工具】即可找到OCR计算器 |
| Q：矿物油对细胞有细胞毒性吗？ |
| A： 当通过Cell Counting Kit-8细胞毒性测定测定时，在用矿物油处理的细胞中未观察到毒性。 |
| Q：OCR检测后如何测量细胞数？ |
| A：使用核酸探针（代码：H342）Hoechst 33342测量每个孔的细胞数，这是该方案的一个示例。
＜说明＞ （1） 将细胞接种到孔中进行OCR测量（液体体积：100μl/孔）。 （2） 将制备校准曲线的细胞接种到孔中（液体体积：100μl/孔）。 （3） OCR根据说明书进行测量。 （4） 向孔中加入10µl/孔的介质进行校准（使介质体积与OCR测量孔的体积对齐至110µl/孔）。 （5） 将用培养基稀释的Hoechst 33342溶液（10µg/ml）以100µl/孔的速度添加到所有孔中。 *从油的顶部添加OCR测量孔。 （6） 在37°C下培养30分钟。 （7） 用荧光板读数器（Ex:350nm，Em:461nm）测量。 （8） 制备校准曲线（X轴：细胞数量，Y轴：荧光强度），并计算用于OCR测量的孔中的细胞数量。
|
| Q：可以长期存储工作液吗 |
| A 工作液不能储存，需要现配现用。 |
| Q：氧探针或矿物油的反复冷冻和解冻是否会影响测定？ |
| A 我们已经证实，氧气探针和矿物油的反复冻融循环对测定没有影响。 |
特点：
●可获得稳定的ADP/ATP比值
●溶液配制后可以保存
●冷藏保存(无需解冻操作)
产品概述
通常情况下，当细胞内ATP浓度降低时，会由二磷酸腺苷(ADP)重新合成为ATP，以维持细胞内一定的ATP浓度。当产生ATP的相关代谢发生紊乱时，ADP无法再合成为ATP，ATP却不断地分解成为ADP，导致ADP/ATP的比例上升。而ADP/ATP比率的变化与细胞凋亡、细胞自噬、能量代谢等诸多途径息息相关，因此经常被作为细胞活性的指标之一检测。
规格性状
检测原理
本试剂盒可以检测细胞中ADP与ATP的比率。首先用萤火虫荧光素酶法检测细胞内的ATP。
之后用酶将细胞内的ADP全部转化为ATP，再用相同的发光原理检测ATP，即可算出细胞内ADP/ATP的比率。
与其他公司产品比较
本试剂盒的检测结果，不受ATP和ADP的总量影响，比值的结果稳定。
实验例
使用Staurosporine诱导细胞凋亡后，用本试剂盒检测细胞中ADP/ATP的比值。另外，用激光共聚焦显微镜和流式细胞仪检测Annexin V-FITC/PI染料标记的Staurosporine诱导凋亡的细胞。
结果显示，Staurosporine诱导后的细胞中ADP/ATP的比例明显上升。相同条件的细胞中也观察到磷脂酰丝氨酸(PS)的外翻以及细胞膜破损。说明凋亡细胞中的ADP/ATP的比率上升。
＜ADP/ATP比的检测结果＞
常见问题Q&A
| Q：一个试剂盒可以检测多少个样品？ |
| A：按照每个样品3个复孔计算，可以检测32个样品，96孔板的孔板设置请参考说明书。 |
| Q：检测时是否可以用白色96孔板以外的孔板？ |
| A：黑色和透明孔板都会造成发光强度的降低，透明孔板还会导致背景升高。因此建议使用白色96孔板。 |
| Q：配制好的working solution是否可以保存？ |
| A：本试剂盒共包含4种working solution，ADP working solution无法保存，请现配现用。其他3种的保存条件及保存时间如下： |
| Q：确定最佳细胞数的方法是什么？ |
| A：配制梯度浓度的细胞悬液播种至孔板中，按照最终实验相同的条件进行培养。使用本试剂盒制作标准曲线(参照图1)，选择呈直线性的范围，并且ADP/ATP比率(参考图2)在相对稳定的范围内进行最终实验的检测。下图的情况，最细胞数的范围是2,000~4,000个。 |
| Q：发光法检测波长为多少？ |
| A：由于是通过萤光素检测，所以检测波长为556 nm。 |
特点：
● 只需添加小分子量荧光试剂即可轻松检测线粒体
● 可以使用荧光显微镜进行活细胞成像
● 可以与附着的溶酶体染色剂同时染色
试剂盒内含
产品概述
线粒体 (Mitochondria) 是细胞中重要的细胞器之一，可以为细胞活力提供能量 。近年有报道去极化线粒体的积累引起的阿尔茨海默病 (Alzheimer’s Disease) 与帕金森病(Parkinson’s Disease)，可能与线粒体自噬有关。线粒体自噬是一种清除机制，可以通过自噬，将氧化应激、DNA损伤因素导致功能失调的线粒体隔离包裹成自噬体(Autophagosome)，再与溶酶体 (Lysosome) 融合后降解。本试剂盒内含Mtphagy Dye (用于检测线粒体自噬) 和Lyso Dye (溶酶体染料)。Mtphagy Dye通过化学结合，固定在细胞内的线粒体上，会发出较弱的荧光。当线粒体发生自噬，损伤的线粒体会与溶酶体融合，pH会下降，变成酸性，此时Mtphagy Dye会产生较强的荧光。如想直观观察Mtphagy Dye标记的线粒体和溶酶体的结合，可联合应用试剂盒中的Lyso Dye (标记溶酶体) 进行双染。
特点：
1）只需添加小分子量荧光试剂即可轻松检测线粒体
2）可以使用荧光显微镜进行活细胞成像
3）可以与附着的溶酶体染色剂同时染色
原理
记载了本产品的检测原理和实验例的论文请看MD01论文实验例中第四篇：Live Cell Imaging of Mitochondrial Autophagy with a Novel Fluorescent Small Molecule
实验例
1.用羰基氰化物间氯苯腙 (CCCP，一种线粒体解偶联剂) 诱导Parkin表达的HeLa细胞线粒体自噬，并通过荧光显微镜进行检测。另外，通过与线粒体染色试剂（MitoBright Deep Red:MT08）一同染色，能够区分出已发生自噬的的线粒体（白色）和未发生自噬的线粒体（紫色）（照片：右侧）。
波长：
Mtphagy Dye:561 nm (Ex)、650 LP nm (Em)
Lyso Dye:488 nm (Ex)、502-554 nm (Em)
MitoBright Deep Red:640 nm (Ex)、656-700 nm (Em)
2.荧光显微镜观察
HeLa细胞用CCCP处理，并与线粒体检测试剂（Mtphagy Dye）和线粒体染色试剂（MitoBright LT Green）共同染色，并经过一段时间（6小时）后进行检测。
<检测条件>
设备：LSM-700 Laser scanning confocal microscope (LSCM)
(Carl Zeiss, Oberkochen, Germany)
激发波长：
MitoBright LT Green 488 nm
Mtphagy Dye 555 nm
物镜：63x
拍摄时间：6小时
拍摄间隔：15秒
3.自噬诱导和线粒体膜电位变化关系的检测
用羰基氰化物间氯苯腙(CCCP，一种线粒体解偶联剂)诱导Parkin表达的HeLa细胞线粒体自噬，并使用线粒体自噬检测试剂盒（Mitophagy Detection Kit：MD01）和线粒体膜电位检测试剂盒（JC-1 MitoMP Detection Kit：MT09）观察荧光结果。
结果证实在未经CCCP处理的细胞中几乎未检测到线粒体自噬的发生，并且线粒体膜电位正常维持。 另一方面，在添加了CCCP的细胞中，证实了线粒体膜电位的降低（JC-1的红色荧光降低）和线粒体自噬的发生（Mtphagy染料的荧光增强）。
<实验条件>
■将Parkin质粒导入HeLa细胞
使用HilyMax（货号：H357）将Parkin质粒引入HeLa细胞中（Parkin质粒/HilyMax试剂：0.1 μg/0.2 μl）
过夜培养后进行检测。
■线粒体自噬检测
向表达Parkin的HeLa细胞中添加0.1 μmol/l Mtphagy工作溶液，并在37°C下孵育30分钟。然后将细胞用HBSS洗涤，加入10 μg/ml CCCP/MEM溶液，并在37℃下孵育2小时。在荧光显微镜下观察细胞。
■线粒体膜电位检测
将10 μg/ml的CCCP/MEM溶液添加至表达Parkin的HeLa细胞中，并在37℃下孵育1.5小时。加入4 μmol/l的JC-1工作液使其终浓度达到2 μmol/l，并在37℃下孵育30分钟。孵育后，将细胞用HBSS洗涤，加入成像缓冲液，并在荧光显微镜下观察细胞。
<检测条件>
■线粒体自噬检测
Ex：561 nm，Em：570-700 nm
■线粒体膜电位检测
绿色Ex：488 nm，Em：500-550 nm
红色Ex：561 nm，Em：560-610 nm
荧光特性
特点：
● 固定后仍可检测
● 荧光滞留性强
● 灵敏度高
产品概述
线粒体利用氧气合成ATP，从而产生细胞所需的能量，是重要的细胞器之一。线粒体活性低下和机能障碍与癌症、老化、阿尔茨海默病、帕金森病等神经变性疾病密切相关。因此，线粒体膜电位（MMP）作为线粒体相关疾病的一个有希望的靶点已被广泛研究。
产品特点
解决传统试剂的三个问题
观察线粒体膜电位时，使用JC-1、TMRE、TMRM，但由于PFA不可固定、容易淬灭，数据的再现性等问题。MT-1 MitoMP Detection Kit是克服了这些问题的线粒体膜电位的检测试剂。
并且，通过本试剂盒中包含的Imaging Buffer，可以在抑制了荧光背景和对细胞的损伤的状态下进行观察。
①固定后也可检测
由于微小的细胞状态的变化，也会造成线粒体膜电位发生变化，所以取得数据的重现性需要特别注意。通用的线粒体膜电位检测试剂（JC-1、TMRE）如果对细胞进行固定处理的话会失去荧光，所以需要使用活细胞进行迅速的测定。MT-1即使进行染色后进行PFA固定操作，也能保持荧光，因此可以进行高重复性的实验。
②可监控
没有进行药物刺激的细胞通过各种试剂染色，确认了荧光强度的变化。结果，JC-1和TMRE在染色后约10分钟左右荧光强度下降，MT-1仍保持了一定的荧光强度
③高灵敏度
线粒体膜电位的细微变化在JC-1中有难以检测的情况，在这种情况下，使用四甲基罗丹明乙酯（TMRE）监测MMP。MT-1可提供与TMRE同等的检测灵敏度。
与各种试剂的比较
实验例
1.通过去极化的实验例
通过线粒体去极化剂的cyanide-p-trifluoromethoxyphenylhydrazone (FCCP)处理HeLa细胞，用该试剂观察膜电位的变化。
结果，确认了FCCP处理的细胞线粒体膜电位下降的情况。
2.凋亡诱导细胞线粒体膜电位的变化
预先在MT-1中染色的HL60细胞中添加Etoposide，诱导凋亡后，与Annexin V、FITC Conjugate一同染色，并通过流式细胞仪检测。
结果发现Annexin V-FITC产生的荧光强度变化（绿色荧光强度的增加）确认了凋亡的发生，以及从MT-1产生的荧光强度变化（红色荧光强度的降低）发现了线粒体膜电位的变化。
常见问题Q&A
| Q1:使用荧光显微镜检测时需要注意什么？ |
| A1:请尽量减少激发光照射时间并提高检测灵敏度。
细胞长期暴露于激发光内可能导致细胞损伤和荧光染料降解，请优化检测时间。 |
| Q2：MT-1检测后可以固定吗？ |
| A2：应使用4%多聚甲醛（PFA）固定，且不能与（Triton X-100、NP-40等）一起使用，因为这可能导致染泄漏。 |
| Q3：固定后可以对细胞染色吗？ |
| A3：由于MT-1在线粒体中的积累取决于线粒体膜电位，因此固定后不适用于染色。 |
| Q4：是否需要做阳性对照？ |
| A4：作为阳性对照，可在技术手册中找到使用FCCP（羰基氰化物-对三氟甲氧基苯腙）的实验例。 |
|
Q5：优化染色条件时，应使用何种浓度的MT-1染料 |
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A5：MT-1染料的浓度建议稀释1000倍。但在优化染色条件时，请参考以下内容。 <荧光强度弱> 请优化以下浓度：稀释500-1000倍。 <观察到非特异性吸附> 请优化以下浓度：稀释1000至2000倍。 |
| Q6:我可以使用缓冲液来制备MT-1工作溶液吗？ |
| A6:可以使用Hanks的HEPES和HBSS。也可以使用MEM、RPMI和含10%FBS的MEM制备。 |
| Q7：添加MT-1工作液后，可以不清洗直接上机检测吗？ |
| A7：染色后，无需清洗即可观察样品。但我们不建议在不清洗的情况下长期观察它们，因为它们可能具有细胞毒性。
我们建议去除上清液并用培养基替换。 |
| Q8：MT-1染色后，是否可以用PBS代替HBSS来清洗？ |
| A8：我们建议使用HBSS来减少细胞损伤。如果您没有HBSS，我们建议使用培养基来代替清洗。 |
共立理化学研究所（简称共立理化），专业研发生产水质检测试剂盒，土壤等环境元素分析相关产品。
共立理化成立于1952年，旗下Packtest产品通过比色法来快速准确对样品进行快速检测。
Packtest® 水质简易测定试剂盒
Packtest （パックテスト）是简单快速的水质测定试剂盒。
大多数的反应原理是，适用于JIS K0102等规定中的吸光光度法作为基准。
增强型ECL化学发光检测试剂盒（即用型）
高质量的Western 显影试剂
高质量的western显影试剂
优化的配方，增强发光强度
抗淬灭能力强
兼容胶片曝光和CCD扫描
本试剂盒以化学发光方法检测蛋白质或核酸类生物大分子。其原理是，蛋白质或核酸在电泳后转移到印迹膜上，以一抗及辣根过氧化物酶HRP 标记的二抗结合膜上的目的蛋白，或以HRP 标记的探针直接或间接结合膜上的核酸。洗膜后用本产品配制的ECL 工作液，在可见光下室温孵育膜数分钟，将印迹膜用保鲜膜包被粘贴固定于X 光片曝光暗盒。然后转入暗室将X 光胶片压在膜上曝光数秒到数分钟至数小时。显影定影后蛋白质或核酸条带可清晰显示在X 光胶片上。也可不进行X 光胶片曝光直接对印迹膜进行CCD 扫描。
2-8°C 保存。
• 在质粒 DNA 上产生替换、插入、缺失突变
• 在质粒 DNA 上产生替换、插入、缺失突变
