MT05/Si-DMA for Mitochondrial Singlet Oxygen Imaging试剂

MT05/Si-DMA for Mitochondrial Singlet Oxygen Imaging试剂,单线态氧(Singlet Oxygen,1O2)是一种具有强氧化性的活性氧(ROS),是造成皮肤斑点及皱纹的重要因素。在化妆品等研究中,去除单线态氧是重要的研究目的。在癌症研究领域,单线态氧在光动力疗法(PDT:一种采用光敏药物和激光活化治疗肿瘤的新兴抗癌疗法)中起到关键作用。因此检测活细胞内的单线态氧对于了解PDT的抗癌机理至关重要。但是现有的荧光探针由于不能穿透细胞膜,所以无法用于活细胞检测。

货号:MT05
线粒体内单线态氧荧光探针试剂
Si-DMA for Mitochondrial Singlet Oxygen Imaging
储存条件:-20度保存,避光
运输条件:室温

分子式:C35H37ClN2Si
分子量:549.22

特点:

  1. 能够对活细胞进行荧光成像
  2. 对单线态氧的高选择性

选择规格:2μg

产品概述

       单线态氧(Singlet Oxygen,1O2)是一种具有强氧化性的活性氧(ROS),是造成皮肤斑点及皱纹的重要因素。在化妆品等研究中,去除单线态氧是重要的研究目的。在癌症研究领域,单线态氧在光动力疗法(PDT:一种采用光敏药物和激光活化治疗肿瘤的新兴抗癌疗法)中起到关键作用。因此检测活细胞内的单线态氧对于了解PDT的抗癌机理至关重要。但是现有的荧光探针由于不能穿透细胞膜,所以无法用于活细胞检测。

Majima等人合成了一种由含硅罗丹明和蒽环构成的新型远红外荧光探针Si-DMA,分别作为发色团和单线态氧反应位点。当存在单线态氧时会在Si-DMA的蒽环部位生成内过氧化物,Si-DMA的荧光强度会增强1)。在7种不同活性氧中,Si-DMA能够特异性地检测单线态氧(图3)。另外在用5-氨基乙酰丙酸(5-ALA,一种血红素前体)处理细胞后,Si-DMA可以实时观察到线粒体中原卟啉IX产生单线态氧的变化情况(图4)。

原理

图1. Si-DMA的细胞染色原理

荧光特性

图2. Si-DMA与单线态氧反应后的激发和发射光谱

反应特异性

图3. Si-DMA对各种ROS的选择性

实验例

实验例1  荧光显微镜观察用5-氨基乙酰丙酸 (5-ALA) 处理后的HeLa细胞中的单线态氧

1. 接种200 μl HeLa细胞 (2.4×105 cells/ml) 在μ-slide 8孔板 (ibidi) ,培养基为DMEM (10%FBS,1%青霉素-链霉素),

在37℃ 5% CO2培养箱中过夜培养。

2. 用200 μl Hanks’ HEPES 缓冲液洗涤细胞2次。

3. 在μ-slide 8孔板中加入200 μl 含5-ALA的Hanks’ HEPES 缓冲液 (150 μg/ml),在37℃ 5% CO2培养箱中培养4 h。

4. 用Hanks’ HEPES 缓冲液洗涤细胞2次。

5. 加入200 μl Si-DMA工作液(40 nmol/l), 在37℃ 5% CO2培养箱中培养45 min。

6. 用200 μl Hanks’ HEPES缓冲液洗涤细胞2次。

7. 加入200 μl Hanks’ HEPES缓冲液,并用荧光显微镜进行观察。

Si-DMA检测5-ALA处理的HeLa细胞线粒体中的单线态氧的荧光成像

5-ALA处理过的HeLa细胞经过2.5 min照射后,Si-DMA的荧光增强,因此Si-DMA可以用于实时监测线粒体中原卟啉IX产生的单线态氧。

滤镜 (波长/带通型滤光片)

荧光成像:600±25 nm (Ex), 685±25 nm (Em)

实验例2  线粒体中的单线态氧检测 

用终浓度为50 μmol/l的过氧化氢和终浓度为50 μmol/l的次氯酸刺激或不刺激HeLa细胞,用Si-DMA检测到细胞中产生的单线态氧。和线粒体染料(MitoBright Green: MT06)共染,特异性地在线粒体中检测到了单线态氧。

波长(激发波长/发射波长)

Si-DMA: 600±25 nm/685±25 nm

MitoBright Green: 488 nm/501-563 nm

实验例3  观察用H2O2处理Primary Hepatocytes细胞后产生的单线态氧

Si-DMA检测用H2O2刺激Primary Hepatocytes细胞后产生的单线态氧荧光成像

实验条件:

用10 mM H2O2刺激Primary Hepatocytes 20 min。

细胞数量:1×104/dish

容器:Nest 15 mm共聚焦培养皿801002

染色条件:在37℃ 5% CO2培养箱中染色45 min

Si-DMA工作液浓度:100 nmol/l

检测仪器:激光共聚焦显微镜

仪器品牌:Leica,Cambridge, UK

仪器型号:BMI-6000

Ex:600 nm,Em: 685 nm

(以上数据由东方肝胆外科医院信号转导实验室友情提供)

常见问题Q&A

Q1、本试剂盒与现有方法相比有什么优势?
A1:本试剂盒的优点是“能够对活细胞进行荧光成像”和“对单线态氧的高选择性”。在操作说明中有详细的实验数据。
Q2、DMSO Stock Solution的稳定性怎么样?
A2:DMSO Stock Solution配制后在-20℃及避光条件下可以保存大约1个月,建议根据每次的用量进行分装保存。
Q3、配制Working Solution可以用Hanks’ HEPES以外的缓冲液吗?
A3:还可以用HBSS缓冲液。
Q4、Working Solution的稳定性怎么样?
A4:Working Solution不稳定,请在配制当天使用。

参考文献

NO         检测对象      检测仪器                                       论文名
1 HeLa;   RAW264.7细胞     荧光显微镜  “Far-Red Fluorescence Probe for Monitoring Singlet Oxygen during Photodyanamic Therapy“, J.Am.Chem.Soc., 2014,136 (33),11707.
2 CT26、TK6细胞     流式细胞仪  “Physical plasma elicits immunogenic cancer cell death and mitochondrial singlet oxygen“, TRPMS., 2017, 99, DOI:10.1109/TRPMS.2017.2766027.
3 HeLa、HEK293细胞     荧光显微镜  “Green monomeric photosensitizing fluorescent protein for photo-inducible protein inactivation and cell ablation “,BMC Biol., 2018, 16, 50.
4 RIN-m5f细胞     荧光显微镜  “Sonodynamic therapy inhibits palmitateinduced beta cell dysfunction via PINK1/ Parkin-dependent mitophagy“, Cell Death Dis., 2019, 10, 457.
5 HepG2、NIH3T3细胞     荧光显微镜

    流式细胞仪

        酶标仪

 “Quantitative kinetics of intracellular singlet oxygen generation using a fluorescence probe“, Sci.Rep., 2020, 10, 10616.