产品名称：InspireSpark © dsDNA 高灵敏检测试剂盒
产品货号：KP04124
产品介绍：
使用红荣微再 dsDNA 高灵敏检测试剂盒可简便快速地进行双链DNA (dsDNA) 荧光定量。本试剂盒 包含荧光检测试剂、标准品和缓冲液，可使用荧光酶标仪或Qubit ®仪器进行检测，对dsDNA有高度选择性， RNA干扰小，在0.1-100 ng区间有很好的线性关系，可更精确地对DNA进行定量，提高实验的准确性。针对酶标 仪高通量检测模式，酶标仪版试剂盒特别提供了5 个点的标准品，使定量结果更加准确。
产品用途：
对浓度为100 pg/µL-100 ng/µL的dsDNA样品进行精确定量。
产品特点：
特异性强；
高灵敏度；
线性范围宽；
操作简便，兼容性好；
对常规的污染物有很好的耐受性。
产品名称：InspireSpark © dsDNA 高灵敏检测试剂盒
产品货号：KP04124
订购信息：
InspireSpark dsDNA高灵敏检测试剂盒 KP04124 500rxn
InspireSpark dsDNA高灵敏检测试剂盒 KP04125 500rxn
产品名称：安度斯 鲎试剂 光度法
产品货号：BK-011
产品规格：10样品/盒
产品产地：中国
产品简介：
鲎试验是检测非经肠道药品及医疗器械内毒素污染稳定可靠的体外检测方法。
作为目前灵敏和稳定的实验，鲎实验已从凝胶法演变为快速的定量方法，技术不断改进。安度斯一直站在内毒素检测的变革前沿，投资新技术和创新产品以提高检测质量，加速研发进程。我们最新研发的全自动化细菌内毒素检测系统，采用法定动态显色法鲎试剂，可用于快速内毒素检测，减少复测率，改善周转时间以便您及时、准确地对产品的安全性作出决定。
产品应用：
用于透析液、透析用水、细胞培养液及医疗器具等的细菌内毒素检查。
产品特点：
1.无需制备标准曲线溶液，本试剂盒使用存档标准曲线分析实验数据，标准曲线范围是0.005-0.25EU/ml。
2.样品阳性对照制备方便，只需将已制备的样品溶液0.4ml加入到内毒素工作标准品中，放置旋涡混合器上旋涡混合1分钟，即可得到样品阳性对照溶液。
3.定量检测内毒素，灵敏度高达0.005EU/ml。
产品订购信息：
货号 名称 规格
BK-011 光度法细菌内毒素检测盒 10个样品/盒
产品名称：安度斯 鲎试剂 光度法
产品货号：BK-011
产品名称：安度斯 鲎试剂 动态显色法
产品货号：KC-125
产品规格：1.25ml/支
产品产地：中国
产品简介：
鲎试验是检测非经肠道药品及医疗器械内毒素污染稳定可靠的体外检测方法。经过多年的实践和发展，各国药典接受的鲎试验方法已从最初的凝胶法发展到光度法。中国国家药典委员会2017年7月发布的《中国药典分析检测技术指南》指出，在药检应用中“实际上6种方法具有相同的地位”。
由于凝胶法技术的缺陷，己经越来越难以满足现代医药工业发展的需要。2020年版细菌内毒素检查法应用指导原则中描述了光度法的优势：“光度法（包括浊度法和显色法）可定量检测内毒素的含量，能较为准确评估产品在生产过程中污染的相对风险，定量检测的数据不仅有利于追踪产品质量趋势，还能起到风险预警作用，更易达到数据完整性的要求。”，“光度测定法可通过回收率判断出干扰的趋势，尤其对于研究发中的样品（如新产品）更具有优势。”
湛江安度斯生物有限公司一直致力于在保护人类健康与鲎资源之间取得平衡。基于这一理念，经过逾十年的努力，研发出新一代动态显色法鲎试剂(mKCA)，与现有的细菌内毒素检测技术相比，mKCA可以大幅度减少对鲎资源的依赖。
产品特点：
— 更高的检测灵敏度，最高达0.005Eu/ml；
— 更宽的检测范围，50-0.005Eu/ml（10,000倍）；
— 更好的线性：50-0.005Eu/ml范围内的相关系数|r|≥0.998；
— 更强的抗干扰能力。
安度斯鲎试剂系列：
作为目前灵敏和稳定的实验，鲎实验已从凝胶法演变为快速的定量方法，技术不断改进。安度斯一直站在内毒素检测的变革前沿，投资新技术和创新产品以提高检测质量，加速研发进程。我们最新研发的全自动化细菌内毒素检测系统，采用法定动态显色法鲎试剂，可用于快速内毒素检测，减少复测率，改善周转时间以便您及时、准确地对产品的安全性作出决定。
产品订购信息：
货号 名称 规格 检测限
KC-125 安度斯 鲎试剂（动态显色法） 1.25ml/支 0-0.005
产品名称：安度斯 鲎试剂 动态显色法
产品货号：KC-125
| 品牌 | 其他品牌 | 供货周期 | 现货 |
|---|---|---|---|
| 应用领域 | 医疗卫生,生物产业 |
产品名称：安度斯 鲎试剂 动态浊度法
产品货号：KT-125
产品规格：1.25ml/支
产品产地：中国
产品简介：
鲎试验是检测非经肠道药品及医疗器械内毒素污染可靠的体外检测方法。经过多年的实践和发展，各国药典接受的鲎试验方法已从凝胶法发展到光度法。中国国家药典委员会2017年7月发布的《中国药典分析检测技术指南》指出，在药检应用中“实际上6种方法具有相同的地位”。
由于凝胶法技术的缺陷，己经越来越难以满足现代医药工业发展的需要。2020年版细菌内毒素检查法应用指导原则中描述了光度法的优势：“光度法（包括浊度法和显色法）可定量检测内毒素的含量，能较为准确评估产品在生产过程中污染的相对风险，定量检测的数据不仅有利于追踪产品质量趋势，还能起到风险预警作用，更易达到数据完整性的要求。”，“光度测定法可通过回收率判断出干扰的趋势，尤其对于研究发中的样品（如新产品）更具有优势。”
湛江安度斯生物有限公司一直致力于在保护人类健康与鲎资源之间取得平衡。基于这一理念，经过逾十年的努力，研发出新一代动态显色法鲎试剂(mKCA)，与现有的细菌内毒素检测技术相比，mKCA可以大幅度减少对鲎资源的依赖。
产品特点：
— 稳定性好，对供试品内毒素检测的重复性好；
— 线性好，标准曲线的相关系数在0.99以上；
— 检测灵敏度高。
安度斯鲎试剂系列：
作为目前灵敏和稳定的实验，鲎实验已从凝胶法演变为快速的定量方法，技术不断改进。安度斯一直站在内毒素检测的变革前沿，投资新技术和创新产品以提高检测质量，加速研发进程。我们新研发的全自动化细菌内毒素检测系统，采用法定动态显色法鲎试剂，可用于快速内毒素检测，减少复测率，改善周转时间以便您及时、准确地对产品的安全性作出决定。
产品订购信息：
货号 名称 规格 检测限
KT-125 安度斯 鲎试剂（动态浊度法） 1.25ml/支 10—0.03；10—0.01；10-0.005
产品名称：安度斯 鲎试剂 动态浊度法
产品货号：KT-125
关于公司：
湛江安度斯生物有限公司(安度斯)是Charles River Laboratories International, Inc. (CRL)于1997年在华收购的控股合资企业。CRL是新药合约研发机构，总部位于美国马萨诸塞州的Wilmington, 在全球23个国家经营80家分公司，为全球制药和生物技术公司、政府机构和学术机构提供加速药品研发必需的全套产品及服务，业务涵盖新药研发、安全性评估、非经肠道药品及医疗器械的细菌内毒素检测、微生物快速检测及鉴定、临床支持、运营及人员配置支持等。
安度斯是经广东省食品药品监督管理局批准的鲎试剂生产企业，一直致力于细菌内毒素检测产品的研发、生产和销售，是中国细菌内毒素检测领域。安度斯公司位于广东省湛江市，占地面积10,000㎡，拥有10万级、1万级和局部100级洁净区的现代化生产车间。安度斯严格执行GMP及ISO9001标准管理，并且获得了ISO13485:2016质量管理体系认证。
生物-安度斯代理
重庆生物医药科技有限公司是一个以提供高新生物和医药技术为核心的生物医药技术服务，技术咨询和产品销售的品牌企业。公司于2019年3月经国家相关政府部门审批正式成立，成立以来，公司运用现代电子商务模式一直致力于帮助客户达成科学研究。公司立足西南，面向全国，以“积极借鉴成功经验，追求越创新”为核心思想，时刻牢记初心，始终秉承“诚信、思考、研究”的哲学观，在为广大客户服务的过程中不断完善公司的业务结构和能力，生物医药作为生命科学领域内的一份子，我们郑重向客户承诺：为客户精心挑选优质的产品，提供专业的技术服务，为生物高新行业的发展奋斗。在此，生物热诚欢迎您的关怀、指导和帮助，并期盼与您真诚合作，共赢发展！
产品名称：CasPASE1, 4, 5assay含Ac-WEHD-AFC底物
产品货号：786-200A
英文名称：CasPASE1, 4, 5 assay with Ac-WEHD-AFC substrate
产品规格：50 Assays
产品品牌：G-biosciences
产品简介：
CasPASE 细胞凋亡检测试剂盒是用来检测 Caspase 的活性来检测细胞的凋亡，是细胞凋亡早期指示剂。
1.荧光检测
这个检测是基于合成的底物切割的检测，底物的 C 端有一个 （AFC）。当从肽上释放出来后，AFC 会产生一个光学上的变化，在 360-390nm 处激发以及 510-550nm 发射处读数。
2.比色检测
这个检测是基于合成的底物切割的检测，底物在 C 端进行标记。当从肽上释放出来后，产生一个光学上的变化，这个变化可以在 405nm 处的吸光值通过读数进行检测。
所有的 CasPASE 检测可以方便的适用于高通量 96 孔板形式。这个检测系统可能可以用于纯化的酶的制备，细胞抽提物或组织裂解物。
每个细胞凋亡检测试剂盒提供有实验必要的检测缓冲液，酶特定性的 AFC 或对硝基苯胺底物，自由染料（AFC 或对硝基苯胺）以及有效的通用的抑制剂 Z-VAD-FMK 用于建立恰当的阳性和阴性对照和标准。可以提供 50 次或 100 次检测的产品包装。
CasPASE1, 4, 5assay含Ac-WEHD-AFC底物即其中常用底物。
产品特点：
荧光或比色选择
荧光检测 Caspase 1-10 和 13
比色检测 Caspase 1-10
产品订购信息：
货号 名称 规格
786-200A CasPASE1, 4, 5assay含Ac-WEHD-AFC底物 50 Assays
产品名称：CasPASE1, 4, 5assay含Ac-WEHD-AFC底物
产品货号：786-200A
关于公司：
Geno Technology, Inc. 的成立旨在简化生命科学研究。我们的主要目标是针对蛋白质研究的关键技术，并找到经济实惠的方法来简化和改进这些技术。多年来，Geno Technology, Inc. 已经扩展到其他研究领域，但我们的主要目标仍然是蛋白质，我们的主要目标“简化和改进这些技术”仍然成立。这一信息在 2010 年随着我们标志性吉祥物“蛋白质人”和 G-Biosciences 品牌（Geno Technology, Inc. 的注册商标）的演变而得到加强。
G-Bioscience 的团队检查了特定实验技术的各个方面，从蛋白质提取到蛋白质纯化和检测，以确定我们可以针对改进的关键领域。因此，我们现在生产各种产品，从浓度和尺寸方便的简单缓冲液到定制设备，例如 Tube-O-Dialyzer，可增强和简化关键技术。我们关注的关键领域包括但不限于蛋白质测定、样品制备、电泳、蛋白质印迹、质谱、测定开发、抗体生产和蛋白质纯化。
G-Biosciences 现在为蛋白质和生命科学研究市场提供数千种产品，所有产品的设计都是为了让研究人员的实验室时间更简单、更实惠。
品名：LONZA MycoAlertPLUS 支原体检测试剂盒
产品型号： LT07-710
产品规格：100Tests/盒
产品品牌：LONZA
产品简介：
支原体是已知小较简单的原核生物，支原体不能独立生活，需寄生在宿主体内获取营养物质。在连续细胞培养中经常会出现支原体污染，它与细胞竞争获取培养基成份，会导致细胞生长变慢，细胞反应发生变化，包括基因表达等。支原体检测试剂盒是专门检测细胞培养过程中是否被支原体污染的经典试剂盒，它包含检测所用到的各种试剂。
MycoAlert TM PLUS 检测是一种选择性生化测试，它利用支原体酶的活性，支原体酶存在于所有六种主要支原体细胞培养污染物和绝大多数 180 种支原体物种中，但不存在于真核细胞中。
测试样品（细胞上清液或新鲜培养基或补充剂）中的活支原体被裂解，酶与 MycoAlert TM PLUS 底物反应，催化 ADP 转化为 ATP。然后通过 MycoAlert TM PLUS 试剂中的荧光素酶将 ATP 转换为光信号。通过在添加 MycoAlert TM之前（读取 A）和之后测量样品中的 ATP 水平 PLUS 底物（读取 B），可以获得指示支原体存在或不存在的比率。
MycoAlert TM PLUS 支原体检测试剂盒是下一代 MycoAlert TM试剂盒，可提供更高的光输出，这允许与灵敏度较低的平板光度计或多功能阅读器一起使用
测试未使用的培养基、培养基补充剂或水
MycoAlert TM PLUS 支原体检测试剂盒适用于管式光度计、板式光度计和多功能阅读器。
作用机理
MycoAlertTM PLUS可快速灵敏检测到样品中污染支原体的支原体酶。活性支原体裂解后，释放出的支原体酶与MycoAlertTM PLUS底物反应，催化ADP生成ATP。通过测定样品中ATP水平增加量，根据添加MycoAlertTM PLUS底物前后ATP读数的比率可以检测出是否存在支原体污染。ATP光强度可用光度计读出，光强度与ATP量成线性关系。比率<1，支原体阴性，无支原体污染；比率1-1.2，不确定，需要重新检测；比率>1.2，支原体阳性，存在支原体污染。
优点
简便的测定：只需将两种试剂添加到培养上清液中并进行两次发光读数
不到20分钟的结果轻松解释结果
应用领域
检测所有常见的软体动物污染物（支原体，破膜，内质和螺旋体；尿素除外）
适用于管式照度计，平板式照度计和多功能阅读器
内容
1 x 1.2 mL MycoAlert TM PLUS试剂（冻干）
1 x 1.2 mL MycoAlert TM PLUS底物（冻干）
1 x 3 mL MycoAlert TM PLUS测定缓冲液
品名：LONZA MycoAlertPLUS 支原体检测试剂盒
产品型号： LT07-710
订购信息
LONZA LT07-118 MycoAlertTM Mycoplasma Detection Kit 支原体检测试剂盒 10Tests/盒
LONZA LT07-218 MycoAlertTM Mycoplasma Detection Kit 支原体检测试剂盒 25Tests/盒
LONZA LT07-418 MycoAlertTM Mycoplasma Detection Kit 支原体检测试剂盒 50Tests/盒
LONZA LT07-318 MycoAlertTM Mycoplasma Detection Kit 支原体检测试剂盒 100Tests/盒
产品名称：LONZA PYROGENT-5000动力学比浊法 鲎试剂
产品货号：N383
产品规格：100 次检测
灵敏度EU/mL：0.01 至 100 EU/ml
产品品牌：LONZA
产品简介：
PYROGENT -5000产品适合用于实验室处理大量样品，可以定量的动态检测革兰氏阴性细菌内毒素。检测在96孔板上进行，允许许多样品同时检测。The PYROGENT™–5000 assay是水样，大量注射用药物和医疗设备冲洗水内毒素检测的理想选择。检测使用温育板读数器340nm读数，检测灵敏度在0.01 to 100.0 EU/ml。
产品组成：
2 x 50 检测/瓶裂解液，2 瓶重组缓冲液，1 瓶内毒素
产品优势：
灵敏度为 0.03 EU/ml 易于阅读的定性结果
检测原理：
样品和LAL（鲎变形细胞裂物）反应物混合，革兰氏阴性细菌内毒素催化LAL酶原反应，反应初速度决 定于内毒素浓度。激活的凝固酶原水解LAL凝固蛋白酶原特定化学键形成凝固蛋白。水解形成的凝固蛋白会立即自我凝集成胶状物。LAL浊度法检测可以测定浊 度增加值（光密度），浊度变化在凝胶形成之前出现。反应物变混浊所需时间（反应时间）与细菌内毒素含量成反比例。也就是说，如果有大量内毒素存在，则反应 迅速，很快就会出现混浊；如果有少量内毒素存在反应时间就会延长。未知样品内毒素浓度可通过标准曲线计算出。
注意事项：
本品为体外诊断试剂，严禁用于人体内毒素检测
本品用于药品的G-细菌内毒素检测时，应遵循USP药典细菌内毒素检测法的规定
如果说明书下载不了或者有其它产品信息问题可以咨询客服
LONZA PYROGENTM-5000动态浊度法检测
产品名称：LONZA PYROGENT-5000动力学比浊法 鲎试剂
产品货号：N383
相关订购信息：
品牌 货号 名称 产品规格
LONZA N383 PYROGENTTM -5000动态浊度法检测 100次
LONZA N384 PYROGENTTM -5000动态浊度法检测 200次
关于公司：
LONZA（龙沙） 是一家以生命科学为主导，在生物化学、精细化工、功能化学等行业均处于地位的性跨国公司，具有一百多年历史，总部位于瑞士巴塞尔。
LONZA（龙沙）集团主要生产生命科学产品以及多种类的精细和特殊化工产品，以高科技生命技术与优质产品*。龙沙集团通过战略性的投资、关注客户的需求，巩固其技术基础，在市场上建立起地位。今天，创新及先进的生产技术已成为龙沙固有的服务范围。公司提供一整套从实验室研究到工业应用的开放方案。
活动进行中
订购满5000元，200元礼品等你拿
凑单关联产品TOP5
NO.1. Microbial Viability Assay Kit-WST 微生物活性检测
NO.2. Biofilm Viability Assay 生物被膜药物杀伤效果检测
NO.3. Biofilm TestPiece Assay Kit 材料表面生物被膜形成能力检测
NO.4. CTC 细菌计数、染色
NO.5. Bacstain- CTC Rapid Staining Kit 细菌活力检测
规格性状
・Crystal Violet Solution 22 ml×1
・ 96-peg-Lid ×1
・ 96-well Plate ×10
在针状孔板盖(96-peg-Lid)的针状突起表面形成生物被膜
产品概述
生物被膜 (Biofilm)是一种主要由细菌体外的多糖组成的膜状复合体，可以在几乎所有的环境下广泛存在。医疗器具的细菌污染、龋齿、牙周炎等感染症等都与生物被膜的形成有关。由于生物被膜一旦形成，会对抗生素等药物产生抗性，进而引起严重的污染问题。因此，具有抑制生物被膜活性的药物和食品成分成为近年来的研究热点。
Biofilm Formation Assay Kit是通过结晶紫(Crystal Violet)法，对生物被膜形成量和药物对生物被膜抑制能力进行检测的试剂盒。检测过程中，生物被膜在孔板盖的针形突起表面生长，所以在清洗和染色操作中生物被膜不易脱落。同时，通过使用多孔板，可以一次性进行多样品检测。
结晶紫(Crystal Violet)染色法
1982年，Pedersen通过对比结晶紫(Crystal Violet)的吸光度与各种微生物生成的生物被膜的干燥重量，发现两者呈线性相关。因此结晶紫染色法作为最经典的生物被膜检测法一直沿用至今。
参考文献： K. Pedersen,”Method for Studying Microbial Biofilms in Flowing-Water Systems”, Appl. Environ. Microbiol., 1982, 43(1), 6.
特长和操作
Biofilm Formation Assay Kit的特长和操作
产品特点
特点① 检测时间大幅缩短
传统的多孔板检测方法是在96孔板的内壁和底部生成生物被膜，在细菌的培养和清洗等过程中，需要一个孔一个孔的进行操作，增加了大量的操作步骤和时间。而本试剂盒检测方法中，生物被膜在针状突起孔板盖的突起表面生成，只需移动孔板盖就可完成，使得操作变得异常简便。
特点② 减小复孔间的孔间差
由于传统法是在96孔板的内壁和底部形成生物被膜，在清洗等操作时非常容易造成生物被膜的脱落，所以复孔间的孔间差过大一直是传统方法的一大弊端。本试剂盒的方法是在孔板盖的突起处的表面形成生物被膜，大幅减少操作中生物被膜脱落的情况。
<使用本方法的参考文献>
T. Tsukatani, F. Sakata, R. Kuroda, “A rapid and simple measurement method for biofilm formation inhibitory activity using 96‑pin microtiter plate lids”, World J. Microbiol. Biotechnol., 2020, doi:10.1007/s11274-020-02964-6.
I. Okamoto etc., “Antibacterial and Antibiofilm Photodynamic Activities of Lysozyme-Au Nanoclusters/Rose Bengal Conjugates”, ACS Omega, 2021, doi: 10.1021/acsomega.1c00838
操作
本试剂盒可以对生物被膜形成量和药物对生物被膜抑制能力进行检测。检测过程中，生物被膜在孔板盖的针形突起表面生长，所以在清洗和染色操作中生物被膜不易脱落。同时，通过使用多孔板，可以一次性进行多样品检测。
产品选择指南
针对两种不同用途的试剂盒选择
使用针状孔板盖(96 Peg-Lid)的试剂盒一共有两款，分别通过结晶紫染色法和WST显色法进行检测，供您根据具体的需求自由选择。
两种试剂盒的选择方法
*不同的菌种，生物被膜的形成条件(培养基、培养时间等)也不相同。建议先使用Biolfilm Formation Assay Kit(本产品)进行摸索。具体的摸索方法请参考FAQ “如何摸索生物被膜最佳实验条件”
*本试剂盒是由同仁化学研究所和日本福冈县工业技术中心—生物食品研究所共同开发。
Biofilm关联产品
本系列的其他产品介绍
用检测片评价抗菌材料对生物被膜的抑制能力
Biofilm TestPiece Assay Kit(货号：B606)
需要对抗菌材料的生物被膜抑制能力进行评价的时候，使用同仁化学研究所独自研发出的TestPiece Holder(检测片固定盖)可以大幅缩短检测时间，并且得到重现性更高的检测数据。
与传统法的比较
菌种：Staphylococcus aureus NBRC13276
复孔数： n=8
检测实例
常见的生物被膜检测指标有两种：MBIC(Minimum Biofilm Inhibitory Concentrations,抑制生物被膜形成的最低浓度)和MBEC(Minimum Biofilm Eradication Concentrations,细菌生物被膜的最小清除浓度)。下面用各试剂盒分别检测对S.aureus(金黄葡萄球菌)的MBIC和MBEC。
常见问题Q&A
| Q: 如何摸索生物被膜的最佳实验条件? |
| A：一般对于生物被膜最佳实验条件的摸索项目有：培养基的种类、细菌的接种浓度、培养基的更换次数、培养时间、培养温度等。 下面针对培养基的种类、细菌的接种浓度、培养基的更换次数、培养时间作为检测实例进行摸索。如果要摸索培养温度的最佳条件，需要准备多个Biofilm Formation Assay Kit(B601)。
摸索实验例1 不同的培养基种类、细菌播种浓度、培养基交换条件下，检测生物被膜的形成量。 (孔板设置例)
日程表
*每隔24 h更换一次新的培养基。 操作步骤： 1)第1天：96-well Plate①的A行和B行的每个孔中播种180 μl用培养基A至D制备的浓度①和②的细菌溶液。C行~H行留空，盖上96-peg Lid，在适宜温度下培养24 h。 例: 细菌浓度①约107 CFU/ml，细菌浓度②约106 CFU/ml。 2) 第二天：将180 μl不含细菌的培养基加至96孔板②的A、B行的孔中。如图例所示，C、D行的各孔中加入180 μl培养基A~D配制的细菌浓度①和②细菌悬液。E行~H行留空。 将步骤1)中的96-peg Lid 盖在96-well Plate②上，在适宜温度下培养24 h。 3) 第三天：将180 μl不含细菌的培养基加至96-well Plate③的A行~D行各孔中，如图例所示，E、F行的各孔中加入180 μl培养基A~D配制的细菌浓度①和②细菌悬液。G、H行留空。 将步骤2)中的96-peg Lid 盖在96-well Plate③上，在适宜温度下培养24 h。 4) 第4天：将180 μl不含细菌的培养基加至96-well Plate④的A行~F行各孔中，如图例所示，G、H行的各孔中加入180 μl培养基A~D配制的细菌浓度①和②细菌悬液。 将步骤3)中的96-peg Lid 盖在96-well Plate④上，在适宜温度下培养24 h。 5）按照操作说明书的“生物被膜形成量 /生物被膜形成抑制能力”操作步骤的2~6，在新的96孔板中进行操作。 摸索实验例2 不同的培养基种类、细菌播种浓度、培养时间条件下，检测生物被膜的形成量。 (孔板设置例)
日程表
1)第1天：96-well Plate①的A行和B行的每个孔中播种180 μl用培养基A至D制备的浓度①和②的细菌溶液。C行~H行留空，盖上96-peg Lid，在适宜温度下培养24 h。 例: 细菌浓度①约107 CFU/ml，细菌浓度②约106 CFU/ml。 2) 第二天：取下96-peg Lid，96-well Plate①的A行和B行不更换培养基，C、D行的各孔中加入180 μl培养基A~D配制的细菌浓度①和②细菌悬液。E行~H行留空。 重新将96-peg Lid 盖在96-well Plate①上，在适宜温度下培养24 h。 3) 第三天：取下96-peg Lid，96-well Plate①的A~D行不更换培养基。E、F行的各孔中加入180 μl培养基A~D配制的细菌浓度①和②细菌悬液。G、H行留空。 重新将96-peg Lid 盖在96-well Plate①上，在适宜温度下培养24 h。 4) 第4天：取下96-peg Lid，96-well Plate①的A~F行不更换培养基。G、H行的各孔中加入180 μl培养基A~D配制的细菌浓度①和②细菌悬液。 重新将96-peg Lid 盖在96-well Plate①上，在适宜温度下培养24 h。 5）按照操作说明书的“生物被膜形成量 /生物被膜形成抑制能力”操作步骤的2~6，在新的96孔板中进行操作。 |
| Q：目前有过检测实例的菌种有哪些？ |
| A：目前Biofilm Formation Assay Kit(本产品)以及同系列产品Biofilm Viability Assay Kit (货号：B603)有过实际检测案例的菌种有：
・Staphylococcus aureus（金黄葡萄球菌） ・Pseudomonas aeruginosa（绿脓杆菌） ・Escherichia coli（大肠杆菌） ・Streptococcus mutans（虫牙的病原菌之一） ・Porphyromonas gingivalis（牙周病的发病原因之一）
以上菌种的详细培养条件等请参考产品说明书。 |
| Q：做细菌被膜抑制药物的药效评价时，生物被膜的形成量至少要达到什么程度？ |
| A：使用Biofilm Formation Assay Kit (本产品)时，操作步骤的最后一步，检测结晶紫(CV)溶液的吸光度时，
O.D.在0.5(590 nm)以上为宜。 |
特点：
● 高特异性脂滴定位
● 可进行组织脂滴成像
● 多种颜色可供选择
凑单关联产品TOP5
NO.1. Cell Counting Kit-8 细胞增殖毒性检测
NO.2. FerroOrange 细胞亚铁离子检测
NO.3. Glucose Assay Kit-WST 葡萄糖检测
NO.4. Liperfluo 细胞脂质过氧化物检测
NO.5. MitoPeDPP 线粒体内脂质过氧化物检测
概述
Lipi系列探针是高脂肪亲脂性小分子探针，其在疏水环境例如脂滴中发出强荧光。活细胞和固定细胞中的脂滴都可以使用本试剂清楚地观察。
原理
脂滴(脂肪滴，Lipid droplets, LDs)由中性脂肪组成，主要包括甘油三酯和胆固醇酯，其外层被一层单层磷脂分子包裹。而且脂滴不仅在脂肪细胞中存在，在真核生物中也普遍存在。最新的研究表明，以前认为脂滴仅是一个简单的脂质储存器，但最近的研究表明其在调节脂质代谢1)，自噬2)和细胞衰老3)等方面都起着重要作用，因此需要进一步详细地研究脂滴形成·成长·融合·分解的机制。Lipi系列探针是高脂肪亲油性小分子探针，可在疏水环境例如脂滴中发出强荧光。Lipi探针染色后，无须洗涤即可观察到脂滴。
1) T. Fujimoto et al., “Lipid droplets: a classic organelle with new outfits.” Histochem Cell Biol., 2008, 130(2), 263.
2) R. Singh et al., “Autophagy regulates lipid metabolism.” Nature, 2009, 458(7242), 1131.
3) M. Yokoyama et al., “Inhibition of endothelial p53 improves metabolic abnormalities related to dietary obesity.” Cell Reports, 2014, 7(5), 1691.
脂滴的染色例
在活细胞状态下，用油酸诱导HeLa细胞后，用不同颜色的Lipi系列荧光探针检测
检测条件：
* Lipi-Blue ：Ex：405 nm, Em：450–500 nm
* Lipi-Green：Ex：488 nm, Em：500–550 nm
* Lipi-Red：Ex：561 nm, Em：565–650 nm
* Lipi-Deep Red：Ex：640 nm, Em：650–700 nm
染色条件：
在HeLa细胞培养基中加入200 μmol/l油酸，过夜培养后，用PBS清洗细胞，并分别加入不同颜色的Lipi探针(Lipi-Blue/Green/Deep Red：0.1 μmol/l、Lipi-Red： 1 μmol/l) 染色15 min后观察。
如何制备油酸溶液
请参考Q&A“油酸溶液的制备和加入细胞的方法”。
与竞争品比较
Lipi系列荧光探针大幅度地改善了现有脂滴染色试剂存在的问题 (如选择性，滤波器的适应性，荧光滞留性)。而且 Lipi系列荧光探针也适用于多重染色实验，可选颜色更多。
| 同仁化学试剂 | 其他品牌（T公司） | ||||||
| Lipi-Blue | Lipi-Green | Lipi-Red | Lipi-Deep Red | Oil Red O
(比色) |
Nile Red | 试剂B | |
| 活细胞染色 | 〇 | 〇 | 〇 | 〇 | × | 〇 | 〇 |
| 固定细胞染色 | 〇 | 〇 | 〇 | 〇 | 〇 | 〇 | 〇 |
| 对脂肪滴的选择性 (低背景) |
〇 | 〇 | 〇 | 〇 | × | × | △ |
| 与其他试剂的共染色*1 | 〇 | 〇 | 〇*2 | 〇 | n.d. | ×*3 | 〇 |
| 活细胞内的滞留性(24h) | 〇 | 〇 | × | × | n.d. | × | × |
*1. 关于共染色时推荐的荧光滤光片，您可以参考网页下方Q&A“共染时推荐的荧光滤光片”。
*2. 与绿色荧光共染色时，推荐使用550 nm以下的绿色荧光滤光片。
*3. 用GFP的滤光片(500~540 nm)时会串色。
产品特点
特点1：与抗体检测方法高度相关
用4％PFA固定HepG2细胞后，用1 μmol/l Lipi-Red 染色。 然后在脂滴膜上用抗ADFP抗体荧光标记，免疫染色，该抗体可以特异性标记脂滴膜上的蛋白质 (Adipophilin; ADFP)。实验证明Lipi-Red 与脂滴上蛋白质ADFP的定位高度相关。
<检测条件>
Lipi-Red：Ex: 405 nm / Em: 450-500 nm，
抗ADFP抗体(Alexa Fluor 647)：Ex: 640 nm / Em: 650-700 nm
特点2：高特异性定位脂滴
在HeLa活细胞中加入油酸，并用1μmol/L Lipi-Red和100 nmol/l Nile Red（T公司）染色。该结果显示Nile Red会染上脂滴以外的其它细胞质。
<检测条件>
Lipi-Red： Ex: 561 nm / Em: 565 – 650 nm
Nile Red：Ex: 561 nm / Em: 565-650 nm
特点3：光谱范围更窄，不易串色(Lipi-Red vs Nile Red)
在单通道情况下，Lipi Red和Nile Red（T公司）染色HepG2会用G激发观察红色荧光。而在多重染色情况下，可能会用B激发观察绿色荧光，此时Nile Red会出现串色现象。
在用Lipi-Red染色的细胞中，确认了由于G激发引起的红色荧光，并且没有确认由于B激发引起的绿色荧光泄漏。 另一方面，在用尼罗红染色的细胞中，观察到由于G激发引起的红色荧光，但是由于B激发而观察到绿色荧光的泄漏。
特点4：荧光在细胞中的滞留时间长
分别用Lipi系列、Nile Red和市售的试剂B染色HepG2细胞，观察在培养30 min和24 h的荧光图像。
实验例
用Lipi系列染色3T3-L1前脂肪细胞，可以清楚地检测出脂肪细胞中的脂质。
<脂肪细胞染色实验例>
(1)将3T3-L1细胞(1.5×104cells/孔)接种在µ-Plate 96孔板（ibidi）的各孔中，并在37℃ 5% CO2培养箱内培养。
(2)按照常规方法诱导分化为脂肪细胞。
(3) 去除上清液，用DMEM（25 mmol/l葡萄糖, 10% FBS, 无酚红）洗涤两次。
(4)加入用DMEM（25 mmol/l葡萄糖，10％FBS，无酚红）制备的每种染料的工作溶液，并在37℃下培养24 h。
(5)用荧光显微镜观察。
※试剂浓度：各2.5 µmol/l
实验例2：脂肪组织的脂滴成像
用4%PFA固定小鼠肝脏脂肪组织(冰冻切片)后用Lipi系列染色，比较幼鼠(6周龄)和老年小鼠(31周龄)的脂滴成像图像，发现肝脏脂肪组织中的脂滴量有很大差异。
<组织样品的染色实验例>
(1)向小鼠肝脏脂肪组织(冰冻切片)中加入4%PFA(PBS)，在室温下静置5 min。
(2)用PBS清洗后，加入各浓度的Lipi系列working solution（PBS），在4℃下静置24 h。
(3)用PBS清洗后，用落射型荧光显微镜进行荧光观察。
※工作液浓度：2.5 µmol/l(Lipi-Blue、Lipi-Green、Lipi-Deep Red)、25 µmol/l(Lipi-Red)
实验例3：使用细胞成像仪进行定量分析
将油酸或Triacsin C(acyl-CoA synthetase抑制剂）分别加入到HepG2细胞中，并比较脂滴的变化。在分析中，我们使用共聚焦定量细胞成像仪(横河电机株式会社 CQ1)获得每个细胞脂滴数量和面积的数据。
脂肪滴和细胞核的成像
使用共聚焦定量细胞成像仪在617/73 nm处拍摄脂滴图像，在447/60 nm处拍摄细胞核图像，在分析软体CellPathfinder中识别单个脂滴和细胞核，并计算其数量和面积。
横河电机CQ1拍摄条件
使用板：96 well plate，物镜：20倍
激发波长 ：405 nm (DAPI)：)：蓝色、561 nm (Lipi-Red)： 红色
紫框线：细胞核、黄框线：脂滴
脂滴数量及面积的分析
根据细胞核和脂滴的检测数据，每个细胞的脂滴的数量和面积如图所示。结果，加入油酸的脂滴增加了7-13倍，而加入Triacsin C抑制了脂滴的形成，脂滴数量减少到Control组的60%。
细胞处理及脂滴染色条件
将HepG2细胞(1×103cells)接种到96孔板中过夜培养。除去培养上清液后，加入未处理（仅含FBS的DMEM培养基）、油酸（含200 μmol/l油酸和FBS的DMEM培养基）或Triacsin C（含5 μmol/l Triacsin C和FBS的DMEM培养基）过夜培养。之后用PBS 清洗2次，用4%的PFA在室温下固定5 min后，用PBS 清洗2次。最后，加入1 μmol/l Lipi-Red working solution 在室温、避光下染色2 h后，用共聚焦定量细胞成像仪进行定量分析。
Lipi系列荧光图谱
脂肪滴产品种类的检测方法
| 产品名称 | 规格 | 货号 | |||
| 成像(成像)
脂滴荧光探针 |
Lipi-Blue | 10 nmol | LD01 | ||
| Lipi-Green | 10 nmol | LD02 | |||
| Lipi-Red | 100 nmol | LD03 | |||
| Lipi-Deep Red | 10 nmol | LD04 | |||
| 定量（荧光酶标仪，FCM） 脂滴荧光检测试剂盒 |
Lipid Droplet Assay Kit – Blue | 1 set | LD05 | ||
| Lipid Droplet Assay Kit – Deep Red | 1 set | LD06 | |||
常见问题Q&A
| Q1：油酸溶液的制备和加入细胞的方法 |
| A1：我们按照以下步骤制备和使用油酸溶液。 <油酸储存溶液> 必要的试剂 ·BSA(牛血清白蛋白) ·油酸 ·0.1 mol/l Tris-HCl(pH8.0) 制备步骤 1)在0.1 mol/l Tris-HCl（pH8.0）中加入BSA并溶解（BSA：浓度0.14 g/ml）。 2)在容器(一次性的离心管)中加入油酸后，加入步骤1）得到的BSA溶液，使用涡旋振荡器进行混合(油酸浓度：4 mmol/l)。*1 3)用孔径为0.22 µm的注射式过滤器(PTFE)过滤步骤2)的混合溶液。 4)每次使用后冷藏保存。*2 * 1 油酸和BSA溶液混合可能导致液体混浊，继续摇动让油酸和BSA形成复合物使混浊会消失。 * 2 将所需量的油酸储备溶液加入到实验使用的培养基中，用于将油酸加入到细胞中。 <加入细胞的方法> 1)将细胞在37℃ 5%CO2培养箱内培养24 h。 2)用加入了油酸储备溶液的培养基(油酸的终浓度200 µmol/L)替换，再培养24 h。 3)然后按照说明书对脂滴进行荧光染色观察。 |
| Q2：共染时推荐的荧光滤光片。 |
|
| Q3：检测不到荧光信号的应对方法是什么？ |
| Q4如果没有检测到荧光信号，可能会有几个因素。 请确认以下内容，并根据情况考虑优化条件。 1.激发·发射波长与染料的荧光特性不一致。 确认说明书上的荧光图谱和您仪器的激发和发射波长是否匹配。 2.染色条件不是最合适的。 [试剂浓度] 确认工作液的浓度是否在以下范围内。 Lipi-Blue，Lipi-Green：0.1-0.5μmol/l Lipi-Red：1-5μmol/l *如果在上述条件下仍未检测到荧光信号，请提高染色浓度。 Lipi-Blue，Lipi-Green：1-2μmol/l Lipi-Red：10-20μmol/l [染色时间] -一般是30min，如没有荧光信号可以延长染色时间至1-2 h。 3.固定条件不适合。 根据细胞种类不同，染色前后的固定操作可能会导致无法染色或灵敏度减弱。 在这种情况下，“请参考Q&A：是否可以对固定细胞进行染色？。 4.脂滴小，难以确认。 根据细胞的不同，可能会有脂滴很小难以确认的情况。 这种情况下，我们建议在高倍率的显微镜下确认，或用油酸处理细胞作为阳性对照进行评估。 |
| Q4：是否可以对固定细胞进行染色? |
| A4：可以染色，固定细胞的染色步骤有以下注意事项： ※请用多聚甲醛 (PFA) 固定细胞，不建议用甲醇等醇类固定细胞，因为可能会影响脂滴的结构。 ※部分细胞种类染色后，如果在固定细胞过程中出现无染色或染色强度不够的情况，需要摸索最佳固定条件。 ○细胞染色后固定实验例 (以HepG2细胞为例) 1. 将HepG2细胞接种在µ-Slide 8孔板上，并在37℃ 5% CO2培养箱中过夜培养。 2. 去除培养基，用PBS清洗2次。 3. 在细胞中加入用PBS配制的Lipi工作液，在37℃培养箱中培养15 min。 4. 去除上清液，用PBS清洗2次。 5. 加入4% PFA (在PBS中)，在室温固定5 min。 6. 去除上清液，用PBS清洗后，在荧光显微镜下观察。 ○细胞染色前固定实验例 (以HeLa细胞为例) 1. 将HeLa细胞接种在µ-Slide 8孔板上，并在37℃ 5% CO2培养箱中过夜培养。 2. 去除培养基，用PBS清洗2次。 3. 加入4% PFA (在PBS中)，在室温固定5 min。 4. 去除上清液，用PBS清洗2次。 5. 在细胞中加入用PBS配制的Lipi工作液，在37℃培养箱中培养30 min。 6. 去除上清液，用PBS清洗后，在荧光显微镜下观察。 |
| Q5：绿色滤光片会有荧光泄露吗。 |
| A5：与市场上的Nile Red相比，Lipi-Red的泄漏较少，但根据滤光片的种类和激发光的强度，荧光又可能会泄漏到绿色滤光片中。在观察带有不同染料的绿色滤光片时，请注意以下几点。
·选择550 nm以下绿色荧光滤光片。 ·一边调整激发光的强度，一边检测荧光。 |
特点：
● 高特异性脂滴定位
● 可进行组织脂滴成像
● 多种颜色可供选择
凑单关联产品TOP5
NO.1. Annexin V, 633 Apoptosis Detection Kit 细胞凋亡检测
NO.2. Cell Counting Kit-8 细胞增殖毒性检测
NO.3. DAPGreen – Autophagy Detection 细胞自噬检测
NO.4. FerroOrange 细胞亚铁离子检测
NO.5. HilyMax 阳离子脂质体转染
产品解说
概述
Lipi系列探针是高脂肪亲脂性小分子探针，其在疏水环境例如脂滴中发出强荧光。活细胞和固定细胞中的脂滴都可以使用本试剂清楚地观察。
原理
脂滴(脂肪滴，Lipid droplets, LDs)由中性脂肪组成，主要包括甘油三酯和胆固醇酯，其外层被一层单层磷脂分子包裹。而且脂滴不仅在脂肪细胞中存在，在真核生物中也普遍存在。最新的研究表明，以前认为脂滴仅是一个简单的脂质储存器，但最近的研究表明其在调节脂质代谢1)，自噬2)和细胞衰老3)等方面都起着重要作用，因此需要进一步详细地研究脂滴形成·成长·融合·分解的机制。Lipi系列探针是高脂肪亲油性小分子探针，可在疏水环境例如脂滴中发出强荧光。Lipi探针染色后，无须洗涤即可观察到脂滴。
1) T. Fujimoto et al., “Lipid droplets: a classic organelle with new outfits.” Histochem Cell Biol., 2008, 130(2), 263.
2) R. Singh et al., “Autophagy regulates lipid metabolism.” Nature, 2009, 458(7242), 1131.
3) M. Yokoyama et al., “Inhibition of endothelial p53 improves metabolic abnormalities related to dietary obesity.” Cell Reports, 2014, 7(5), 1691.
脂滴的染色例
在活细胞状态下，用油酸诱导HeLa细胞后，用不同颜色的Lipi系列荧光探针检测
检测条件：
* Lipi-Blue ：Ex：405 nm, Em：450–500 nm
* Lipi-Green：Ex：488 nm, Em：500–550 nm
* Lipi-Red：Ex：561 nm, Em：565–650 nm
* Lipi-Deep Red：Ex：640 nm, Em：650–700 nm
染色条件：
在HeLa细胞培养基中加入200 μmol/l油酸，过夜培养后，用PBS清洗细胞，并分别加入不同颜色的Lipi探针(Lipi-Blue/Green/Deep Red：0.1 μmol/l、Lipi-Red：1 μmol/l) 染色15 min后观察。
如何制备油酸溶液
请参考Q&A“油酸溶液的制备和加入细胞的方法”。
与竞争品比较
Lipi系列荧光探针大幅度地改善了现有脂滴染色试剂存在的问题 (如选择性，滤波器的适应性，荧光滞留性)。而且 Lipi系列荧光探针也适用于多重染色实验，可选颜色更多。
| 同仁化学试剂 | 其他品牌（T公司） | ||||||
| Lipi-Blue | Lipi-Green | Lipi-Red | Lipi-Deep Red | Oil Red O
(比色) |
Nile Red | 试剂B | |
| 活细胞染色 | 〇 | 〇 | 〇 | 〇 | × | 〇 | 〇 |
| 固定细胞染色 | 〇 | 〇 | 〇 | 〇 | 〇 | 〇 | 〇 |
| 对脂肪滴的选择性 (低背景) |
〇 | 〇 | 〇 | 〇 | × | × | △ |
| 与其他试剂的共染色*1 | 〇 | 〇 | 〇*2 | 〇 | n.d. | ×*3 | 〇 |
| 活细胞内的滞留性(24h) | 〇 | 〇 | × | × | n.d. | × | × |
*1. 与绿色荧光共染时，推荐使用550 nm以下的绿色荧光滤光片。
*2. 关于共染时推荐的荧光滤光片，您可以参考网页下方Q&A“共染时推荐的荧光滤光片”。
*3. 用GFP的滤光片(500~540 nm)时会串色。
产品特点
特点1：与抗体检测方法高度相似
4％PFA固定HepG2细胞后，用100 nmol/l Lipi-Blue染色。 然后在脂滴膜上用抗ADFP抗体荧光标记，免疫染色， 该抗体可以特异性标记脂滴膜上的蛋白质 (Adipophilin; ADFP)。 实验证明Lipi-Blue与脂滴上蛋白质ADFP的定位高度相关。
<检测条件>
Lipi-Blue：Ex：405 nm / Em：450-500 nm，
抗ADFP抗体(Alexa Fluor 647)：Ex：640 nm / Em：650-700 nm
特点2：高特异性定位脂滴
在HeLa活细胞中加入油酸，并用100 nmol/l Lipi-Blue和100 nmol/l Nile Red（T公司）染色。该结果显示Nile Red会染上脂滴以外的其它细胞质。
<检测条件>
Lipi-Blue：Ex：405 nm / Em：450-500 nm，
Nile Red：Ex：561 nm / Em：565-650 nm
特点3：荧光在细胞中滞留时间长
分别用Lipi系列、Nile Red和市售的试剂B染色HepG2细胞，观察在培养30 min和24 h时的荧光图像。
实验证实Lipi-Blue和Lipi-Green在培养24 h后虽然荧光强度有所降低，但仍有荧光。 而Lipi-Red，Lipi-Deep Red，Nile Red和市售试剂B在培养24 h后几乎无荧光，不适合长时间的实时成像观察。
实验例
实验例1：脂肪细胞的脂滴成像
用Lipi系列染色3T3-L1前脂肪细胞，可以清楚地检测出脂肪细胞中的脂质。
<脂肪细胞染色实验例>
(1)将3T3-L1细胞(1.5×104cells/孔)接种在µ-Plate 96孔板（ibidi）的各孔中，并在37℃ 5% CO2培养箱内培养。
(2)按照常规方法诱导分化为脂肪细胞。
(3) 去除上清液，用DMEM（25 mmol/l葡萄糖, 10% FBS, 无酚红）洗涤两次。
(4)加入用DMEM（25 mmol/l葡萄糖，10％FBS，无酚红）制备的每种染料的工作溶液，并在37℃下培养24 h。
(5)用荧光显微镜观察。
※试剂浓度：各2.5 µmol/l
实验例2：脂肪组织的脂滴成像
用4%PFA固定小鼠肝脏脂肪组织(冰冻切片)后用Lipi系列染色，比较幼鼠(6周龄)和老年小鼠(31周龄)的脂滴成像图像，发现肝脏脂肪组织中的脂滴量有很大差异。
<组织样品的染色实验例>
(1)向小鼠肝脏脂肪组织(冰冻切片)中加入4%PFA(PBS)，在室温下静置5 min。
(2)用PBS清洗后，加入各浓度的Lipi系列working solution（PBS），在4℃下静置24 h。
(3)用PBS清洗后，用落射型荧光显微镜进行荧光观察。
※工作液浓度：2.5 µmol/l(Lipi-Blue、Lipi-Green、Lipi-Deep Red)、25 µmol/l(Lipi-Red)
实验例3：使用细胞成像仪进行定量分析
将油酸或Triacsin C(acyl-CoA synthetase抑制剂）分别加入到HepG2细胞中，并比较脂滴的变化。在分析中，我们使用共聚焦定量细胞成像仪(横河电机株式会社 CQ1)获得每个细胞脂滴数量和面积的数据。
脂肪滴和细胞核的成像
使用共聚焦定量细胞成像仪在447/60 nm处拍摄脂滴图像，在525/50 nm处拍摄细胞核图像，在分析软件CellPathfinder中识别单个脂滴和细胞核，并计算其数量和面积。
横河电机CQ1拍摄条件
使用板：96 well plate，物镜：20倍
激发波长 ：405 nm (Lipi-Blue)：蓝色、488 nm (SYBR Green)： 绿色
黄框线：细胞核、红框线：脂滴
脂滴数量及面积的分析
根据细胞核和脂滴的检测数据，每个细胞的脂滴的数量和面积如图所示。结果，加入油酸的脂滴增加了7-10倍，而加入Triacsin C抑制了脂滴的形成，脂滴数量减少到Control组的50-60%。
细胞处理及脂滴染色条件
将HepG2细胞(1×103cells)接种到96孔板中过夜培养。除去培养上清液后，加入未处理（仅含FBS的DMEM培养基）、油酸（含200 μmol/l油酸和FBS的DMEM培养基）或Triacsin C（含5 µmol/l Triacsin C和FBS的DMEM培养基）过夜培养。之后用PBS 清洗2次，用4%的PFA在室温下固定5 min后，用PBS 清洗2次。最后，加入0.5 μmol/l Lipi-Blue working solution在室温、避光下染色2 h后，用共聚焦定量细胞成像仪进行定量分析。
Lipi系列荧光图谱
脂肪滴产品种类的检测方法
| 产品名称 | 规格 | 货号 | |||
| 成像(成像)
脂滴荧光探针 |
Lipi-Blue | 10 nmol | LD01 | ||
| Lipi-Green | 10 nmol | LD02 | |||
| Lipi-Red | 100 nmol | LD03 | |||
| Lipi-Deep Red | 10 nmol | LD04 | |||
| 定量（荧光酶标仪，FCM） 脂滴荧光检测试剂盒 |
Lipid Droplet Assay Kit – Blue | 1 set | LD05 | ||
| Lipid Droplet Assay Kit – Deep Red | 1 set | LD06 | |||
常用问题Q&A
| Q1：油酸溶液的制备和加入细胞的方法 |
| A1：我们按照以下步骤制备和使用油酸溶液。 <油酸储存溶液> 必要的试剂 ·BSA(牛血清白蛋白) ·油酸 ·0.1 mol/l Tris-HCl(pH8.0) 制备步骤 1)在0.1 mol/l Tris-HCl（pH8.0）中加入BSA并溶解（BSA：浓度0.14 g/ml）。 2)在容器(一次性的离心管)中加入油酸后，加入步骤1）得到的BSA溶液，使用涡旋振荡器进行混合(油酸浓度：4 mmol/l)。*1 3)用孔径为0.22 µm的注射式过滤器(PTFE)过滤步骤2)的混合溶液。 4)每次使用后冷藏保存。*2 * 1 油酸和BSA溶液混合可能导致液体混浊，继续摇动让油酸和BSA形成复合物使混浊会消失。 * 2 将所需量的油酸储备溶液加入到实验使用的培养基中，用于将油酸加入到细胞中。 <加入细胞的方法> 1)将细胞在37℃ 5%CO2培养箱内培养24 h。 2)用加入了油酸储备溶液的培养基(油酸的终浓度200 µmol/L)替换，再培养24 h。 3)然后按照说明书对脂滴进行荧光染色观察。 |
| Q2：共染时推荐的荧光滤光片。 |
 |
| Q3：检测不到荧光信号的应对方法是什么？ |
| Q4如果没有检测到荧光信号，可能会有几个因素。 请确认以下内容，并根据情况考虑优化条件。 1.激发·发射波长与染料的荧光特性不一致。 确认说明书上的荧光图谱和您仪器的激发和发射波长是否匹配。 2.染色条件不是最合适的。 [试剂浓度] 确认工作液的浓度是否在以下范围内。 Lipi-Blue，Lipi-Green：0.1-0.5μmol/l Lipi-Red：1-5μmol/l *如果在上述条件下仍未检测到荧光信号，请提高染色浓度。 Lipi-Blue，Lipi-Green：1-2μmol/l Lipi-Red：10-20μmol/l [染色时间] -一般是30min，如没有荧光信号可以延长染色时间至1-2 h。 3.固定条件不适合。 根据细胞种类不同，染色前后的固定操作可能会导致无法染色或灵敏度减弱。 在这种情况下，“请参考Q&A：是否可以对固定细胞进行染色？。 4.脂滴小，难以确认。 根据细胞的不同，可能会有脂滴很小难以确认的情况。 这种情况下，我们建议在高倍率的显微镜下确认，或用油酸处理细胞作为阳性对照进行评估。 |
| Q4：是否可以对固定细胞进行染色? |
| A4：可以染色，固定细胞的染色步骤有以下注意事项： ※请用多聚甲醛 (PFA) 固定细胞，不建议用甲醇等醇类固定细胞，因为可能会影响脂滴的结构。 ※部分细胞种类染色后，如果在固定细胞过程中出现无染色或染色强度不够的情况，需要摸索最佳固定条件。 ○细胞染色后固定实验例 (以HepG2细胞为例) 1. 将HepG2细胞接种在µ-Slide 8孔板上，并在37℃ 5% CO2培养箱中过夜培养。 2. 去除培养基，用PBS清洗2次。 3. 在细胞中加入用PBS配制的Lipi工作液，在37℃培养箱中培养15 min。 4. 去除上清液，用PBS清洗2次。 5. 加入4% PFA (在PBS中)，在室温固定5 min。 6. 去除上清液，用PBS清洗后，在荧光显微镜下观察。 ○细胞染色前固定实验例 (以HeLa细胞为例) 1. 将HeLa细胞接种在µ-Slide 8孔板上，并在37℃ 5% CO2培养箱中过夜培养。 2. 去除培养基，用PBS清洗2次。 3. 加入4% PFA (在PBS中)，在室温固定5 min。 4. 去除上清液，用PBS清洗2次。 5. 在细胞中加入用PBS配制的Lipi工作液，在37℃培养箱中培养30 min。 6. 去除上清液，用PBS清洗后，在荧光显微镜下观察。 |
特点：
•纯度高
•杂质峰少
•灵敏度高
凑单关联产品TOP5
NO.1. DMPO 超氧阴离子和羟自由基检测
NO.2. BMPO 超氧阴离子和羟自由基检测
NO.3. ROS Assay Kit -Highly Sensitive DCFH-DA- ROS检测
NO.4. Calcein-AM/PI Double Staining Kit 活死细胞双染
NO.5. Cell Counting Kit-8 细胞增殖毒性检测
产品概述
单线态氧 (Singlet Oxygen，1O2) 即激发态氧分子，是一种具有强氧化性的活性氧 (ROS)，在环境、化学、生物、医学等学科中具有重要的研究价值。在众多检测手段中，电子顺磁共振 (EPR) 公认为选择性最好，灵敏度最高的方法。
单线态氧分子和捕获剂TEMP本身呈EPR沉默 (EPR-silent)，TEMP捕获单线态氧后，可形成稳定的氮氧自由基TEMPO，通过对TEMPO的EPR信号分析并结合反应进程，可获知单线态氧的生成的速率和浓度变化。
产品特点
同仁化学研究所 (DOJINDO) 研发的TEMP(2,2,6,6-四甲基-4-哌啶酮 盐酸盐)，保持了一贯的高品质、高稳定性捕获剂的产品特点。TEMP基线无TEMPO的干扰EPR信号，稳定性更好。同时盐酸盐结构增强了捕获剂的水溶性，避免沉淀的析出。
实验例
使用光敏剂Rose Benga (1 mM) 光照后，检测单线态氧。TEMP终浓度100 mM，PBS缓冲液 (PH 7.5) 中进行检测。
备注：
① 由于跃迁高度禁阻，基态氧分子吸收光不能直接产生1O2，可以通过光敏化法、微波放电法和化学方法得到。
② PBS缓冲液可更换为纯水等其他溶剂，实验者可根据实验设计自行选择。
③如信号较弱，可调节PH至8.5-9.5，以提高TEMPO的稳定性，使信号加强。
关联产品
C6H11NO
113.16
特点：
• 纯度高
• 杂质峰少
凑单关联产品TOP5
NO.1. TEMP 单线态氧检测
NO.2. BMPO 超氧阴离子和羟自由基检测
NO.3. ROS Assay Kit 活性氧检测
NO.4. SOD Assay Kit 超氧化物歧化酶(SOD)检测
NO.5. Caspase-3 Assay Kit-Colorimetric- 细胞凋亡检测
规格性状
质量约为1.1g
产品概述
由于具有潜在的致癌风险和促进衰老的作用，生物体内的自由基已成为研究的热点。 DMPO是研究自由基最常用的自旋捕获剂。 它适用于捕获氧自由基，尤其是超氧化物，并生成具有特征的EPR信号的加合物。 但是，大多数市售的DMPO包含会引起高背景的杂质。 因此，这些DMPO需要进一步纯化才能在EPR上进行实验。 Dojindo的DMPO实行严格的质量管控，没有杂质引起的背景问题，因此不需要任何预纯化处理。
产品特点
•超高纯度
•更高的信噪比
•无需预纯化
同仁化学研究所 (Dojindo) 的DMPO没有杂质 (*) 检出
以羟自由基的Fenton反应(黑色)和空白(蓝色)为例，同仁化学研究所(Dojindo)的峰更清晰，S/N比例更高
应用
自旋捕获剂，EPR（ESR）检测，超氧阴离子，羟基自由基
原理
自旋捕捉ESR技术是一种检测活性氧的最可靠的办法，它能提供具有特征的ESR信号。DMPO采用一种特殊的敏感方法，可以捕捉超氧阴离子和羟自由基等，分别产生独特的ESR光谱。因此它是探测生物系统内ROS的强有力工具。
操作步骤
SOD清除超氧阴离子的活性检测
1. 将15 μl的DMPO溶液和 50 μl的5 mM的次黄嘌呤加入到35 μl的0.1 M的磷酸盐缓冲液 (pH 7.8) 中。
2. 加入50 μl的待测SOD标准品或待测样品，涡旋振荡 1-2 s。
3. 加入50 μl的0.4 U/ml的黄嘌呤氧化酶之后立即涡旋振荡。
4. 放置一段时间 (例如 1 min) 将溶液转入ESR样品管中检测。
5. 通过峰值计算相对强度(DMPO-O2-/Mn2+)。
C-,N-,S-基自由基的检测
1. 制备100 mM含有25 μM Diethylenetriaminepentaacetic Acid (DTPA)的磷酸盐缓冲液 (pH 7.4)，作为过渡金属螯合剂。
2. 制备以下过氧化物酶底物：A) 100 mM 甲酸钠(HCOONa)；B) 100 mM氰化钾(KCN)；C) 100 mM叠氮钠(NaN3)；D) 含有100 mM亚硫酸钠 (Na2SO3)的100 mM磷酸盐缓冲液 (pH 7.4)。
3. 制备4.0 mg/ml(~100 μM)的辣根过氧化物酶 (HRP)溶液和1 mM H2O2溶液。
4. 制备浓度为1 M的DMPO溶液。
5. 在离心管中加入130 μl的缓冲液，加入20 μl已配好的1 M的DMPO溶液，再加入20 μl底物储存液，10 μl的1 mM H2O2溶液，最后加入20 μl HRP触发反应。
6. 涡旋振荡离心管，加入到进样系统中，检测图谱。
7. 加样后调节光谱并得到图谱。各物质的终浓度为：100 mM DMPO，10 mM的底物，50 μM H2O2，10 μM HRP。
数据和操作流程由Bruker公司友情提供
C9H17NO·HCl
191.70
特点：
• 纯度高
• 杂质峰少
• 灵敏度高
凑单关联产品TOP5
NO.1. DMPO 超氧阴离子和羟自由基检测
NO.2. BMPO 超氧阴离子和羟自由基检测
NO.3. ROS Assay Kit -Highly Sensitive DCFH-DA- ROS检测
NO.4. Calcein-AM/PI Double Staining Kit 活死细胞双染
NO.5. Cell Counting Kit-8 细胞增殖毒性检测
产品概述
单线态氧 (Singlet Oxygen，1O2) 即激发态氧分子，是一种具有强氧化性的活性氧 (ROS)，在环境、化学、生物、医学等学科中具有重要的研究价值。在众多检测手段中，电子顺磁共振 (EPR) 公认为选择性最好，灵敏度最高的方法。
单线态氧分子和捕获剂TEMP本身呈EPR沉默 (EPR-silent)，TEMP捕获单线态氧后，可形成稳定的氮氧自由基TEMPO，通过对TEMPO的EPR信号分析并结合反应进程，可获知单线态氧的生成的速率和浓度变化。
产品特点
同仁化学研究所 (DOJINDO) 研发的TEMP(2,2,6,6-四甲基-4-哌啶酮 盐酸盐)，保持了一贯的高品质、高稳定性捕获剂的产品特点。TEMP基线无TEMPO的干扰EPR信号，稳定性更好。同时盐酸盐结构增强了捕获剂的水溶性，避免沉淀的析出。
实验例
使用光敏剂Rose Benga (1 mM) 光照后，检测单线态氧。TEMP终浓度100 mM，PBS缓冲液 (PH 7.5) 中进行检测。
备注：
① 由于跃迁高度禁阻，基态氧分子吸收光不能直接产生1O2，可以通过光敏化法、微波放电法和化学方法得到。
② PBS缓冲液可更换为纯水等其他溶剂，实验者可根据实验设计自行选择。
③如信号较弱，可调节PH至8.5-9.5，以提高TEMPO的稳定性，使信号加强。
关联产品
C6H11NO
113.16
特点：
● 纯度高
● 杂质峰少
凑单关联产品TOP5
NO.1. TEMP 单线态氧检测
NO.2. BMPO 超氧阴离子和羟自由基检测
NO.3. ROS Assay Kit 活性氧检测
NO.4. SOD Assay Kit 超氧化物歧化酶(SOD)检测
NO.5. Caspase-3 Assay Kit-Colorimetric- 细胞凋亡检测
规格性状
质量约为1.1g
产品概述
由于具有潜在的致癌风险和促进衰老的作用，生物体内的自由基已成为研究的热点。 DMPO是研究自由基最常用的自旋捕获剂。 它适用于捕获氧自由基，尤其是超氧化物，并生成具有特征的EPR信号的加合物。 但是，大多数市售的DMPO包含会引起高背景的杂质。 因此，这些DMPO需要进一步纯化才能在EPR上进行实验。 Dojindo的DMPO实行严格的质量管控，没有杂质引起的背景问题，因此不需要任何预纯化处理。
产品特点
•超高纯度
•更高的信噪比
•无需预纯化
同仁化学研究所 (Dojindo) 的DMPO没有杂质 (*) 检出
以羟自由基的Fenton反应(黑色)和空白(蓝色)为例，同仁化学研究所(Dojindo)的峰更清晰，S/N比例更高
应用
自旋捕获剂，EPR（ESR）检测，超氧阴离子，羟基自由基
原理
自旋捕捉ESR技术是一种检测活性氧的最可靠的办法，它能提供具有特征的ESR信号。DMPO采用一种特殊的敏感方法，可以捕捉超氧阴离子和羟自由基等，分别产生独特的ESR光谱。因此它是探测生物系统内ROS的强有力工具。
操作步骤
SOD清除超氧阴离子的活性检测
1. 将15 μl的DMPO溶液和 50 μl的5 mM的次黄嘌呤加入到35 μl的0.1 M的磷酸盐缓冲液 (pH 7.8) 中。
2. 加入50 μl的待测SOD标准品或待测样品，涡旋振荡 1-2 s。
3. 加入50 μl的0.4 U/ml的黄嘌呤氧化酶之后立即涡旋振荡。
4. 放置一段时间 (例如 1 min) 将溶液转入ESR样品管中检测。
5. 通过峰值计算相对强度(DMPO-O2-/Mn2+)。
C-,N-,S-基自由基的检测
1. 制备100 mM含有25 μM Diethylenetriaminepentaacetic Acid (DTPA)的磷酸盐缓冲液 (pH 7.4)，作为过渡金属螯合剂。
2. 制备以下过氧化物酶底物：A) 100 mM 甲酸钠(HCOONa)；B) 100 mM氰化钾(KCN)；C) 100 mM叠氮钠(NaN3)；D) 含有100 mM亚硫酸钠 (Na2SO3)的100 mM磷酸盐缓冲液 (pH 7.4)。
3. 制备4.0 mg/ml(~100 μM)的辣根过氧化物酶 (HRP)溶液和1 mM H2O2溶液。
4. 制备浓度为1 M的DMPO溶液。
5. 在离心管中加入130 μl的缓冲液，加入20 μl已配好的1 M的DMPO溶液，再加入20 μl底物储存液，10 μl的1 mM H2O2溶液，最后加入20 μl HRP触发反应。
6. 涡旋振荡离心管，加入到进样系统中，检测图谱。
7. 加样后调节光谱并得到图谱。各物质的终浓度为：100 mM DMPO，10 mM的底物，50 μM H2O2，10 μM HRP。
数据和操作流程由Bruker公司友情提供
C10H17NO3&am
199.25
特点：
● 纯度高
● 杂质峰少
● 灵敏度高
凑单关联产品TOP5
NO.1. DMPO 超氧阴离子和羟自由基检测
NO.2. TEMP 单线态氧检测
NO.3. Calcein-AM/PI Double Staining Kit 活死细胞双染
NO.4. ROS Assay Kit 活性氧检测
NO.5. Annexin V, FITC Apoptosis Detection Kit 细胞凋亡检测
产品概述
自旋捕捉技术是当今检测和鉴别不稳定自由基的最可靠的手段之一。顺磁共振波谱 (EPR) 捕捉剂能够成功的检测体内或体外生成的超氧自由基和羟自由基等。
BMPO是同仁化学研究所 (DOJINDO) 自主开发生产的新型高效、高稳定型自由基捕捉剂。它在捕捉自由基能力上优于PBN、DMPO等一般捕获剂，与自由基的结合能力更强，半衰期 (t½=23 min) 更长，ESR谱图能够明显的区别不同的自由基结构如：GS•和•OH。BMPO检测结果可靠性高、重复性强。由于具有高水溶性的特点，更利于水相体系自由基的研究，尤其是生物体系的自由基研究。
应用
自旋捕获剂，EPR（ESR）检测，超氧阴离子，羟基自由基
产品特点
•半衰期长，可检测自由基加合物
•高水溶性
•更高的信噪比
化学结构式
操作步骤
常规检测步骤 (*本数据仅供参考，具体参数可能因仪器厂家的不同而适当调整)
检测芬顿 (Fenton) 反应所产生的羟自由基：
1. 将1.5 mg的BMPO溶解于5 ml的超纯水。
2. 取15 μl的BMPO溶液，75 μl的1 mM的H2O2和75 μl的100 μM的FeSO4加入到50 μl的超纯水中。
3. 放置一段时间 (例如1 min) 将溶液转入EPR样品管中检测。
4. 通过峰值计算相对强度。
检测黄嘌呤和黄嘌呤氧化酶体系 (XO) 所产生的超氧自由基：
1. 溶液A：将1 mg的BMPO溶解于1 ml的浓度为50 mM的PBS溶液 (pH 7.4)。
2. 溶液B：用50 mM的PBS溶液 (pH 7.4) 配制含有1 mMDTPA和0.4 mM黄嘌呤的混合溶液。
3. 溶液C：用50 mM的PBS溶液 (pH 7.4) 配制含有0.1 U/ml的黄嘌呤氧化酶溶液。
4. 取15 μl溶液A，135 μl溶液B和10 μl溶液C混合。
5. 放置一段时间 (例如 8 min) 将溶液转入EPR样品管中检测。
6. 通过峰值计算相对强度。
实验例
(*本数据仅供参考，具体参数可能因仪器厂家的不同而适当调整)
*本数据均由Bruker公司EPR仪器检测得出，由于BMPO的分子结构在平面上下差异较大，使得图中BMPO/•OH的两种异构体的超精细结构常数较大能够被ESR分辨出来。本实验中BMPO/•OH的两种立体异构体与BMPO/•OOH的构成相似，两种BMPO结合物的适宜条件为：
构象异构体 (conformer)Ⅰ：
aN =13.47 G，aH
aHβ=15.31 G，aH
aHγ1 = 0.62 G
构象异构体 (conformer)Ⅱ：
aN =13.56 G，aH
aHβ=12.3 G，aH
aHγ1 = 0.66 G
超氧化物检测操作流程
1. 用100 mM的PBS溶液 (pH 7.4) 制备浓度为25 μM的DTPA，作为过渡金属螯合剂。
2. 用100 mM PBS (pH 7.4)配制1 mM次黄嘌呤溶液。
3. 配制1 U/ml的黄嘌呤氧化酶溶液。
4. 将10 mg的BMPO溶于200 μl的PBS溶液中。(终浓度约为 250 mM)。
5. 向EP管中加入70 μl缓冲液。
6. 继续添加20 μl浓度为250 mM的BMPO和100 μl步骤2中准备的1 mM的次黄嘌呤溶液。
7. 加入10 μl黄嘌呤氧化酶触发反应，将EP管漩涡震荡后转移到扁平池。
8. 上样并调整参数，获得图谱。
溶液终浓度为：25 mM BMPO， 0.5 mM次黄嘌呤和0.05 U/ml的黄嘌呤氧化酶。
羟自由基操作流程
1. 分别准备1 mM的FeSO4，10 mM的H2O2和250 mM的BMPO水溶液。
2. 向EP管中加入140 μl的超纯水。
3. 继续加入20 μl浓度为250 mM的BMPO和20 μl浓度为1 mM的FeSO4。
4. 加入20 μl浓度为10 mM的H2O2，触发反应。
5. 混合并迅速转移至扁平池中。
6. 上样并调整参数，获得图谱。
溶液终浓度为：25 mM BMPO，0.1 mM FeSO4和1 mM H2O2
*建议实验人员做背景图片，以在EPR图谱中排除自选杂质的干扰。
相关参考数据
超氧化物信号强弱随时间的变化曲线和半衰期时间
*BMPO检测超氧阴离子O2•-的半衰期 (pH=7.4) 更长。因此更适合长时间观察样品的实验。(如检测生物酶反应)
特点：
● 特异性检测铁死亡相关的脂质过氧化
● 比BODIPY C11更适合于胞内定位
● 铁死亡常见指标之一
凑单关联产品TOP5
NO.1. Lipid Peroxidation Probe -BDP 脂质过氧化探针BDP
NO.2. FerroOrange 细胞亚铁离子检测
NO.3. GSSG/GSH Quantification Kit II 氧化型/还原型谷胱甘肽
NO.4. Mito-FerroGreen 线粒体内亚铁离子检测
NO.5. ROS Assay Kit 活性氧检测
规格性状
性状：深红色结晶粉末或固体。
纯度（HPLC）：90.0%以上
核磁共振谱：符合一致性
<使用次数>每50µg可用5-50次
产品概述
Liperfluo是Spy-LHP的类似物，可用于检测脂质过氧化物 (LPO)，Liperfluo会被脂质过氧化物特异性氧化而在乙醇等有机溶剂中发出很强的荧光。由于氧化型Liperfluo的激发和发射波长分别为524 nm和535 nm (均为长波长)，因此可以减轻光对测定样品的损伤和降低样品的自发荧光。由于Liperfluo在二异喹啉环的一个末端连接有四乙二醇基团，因此提高了它在水溶液中的分子分散性。虽然它的氧化型在水溶液中几乎没有荧光，但是在细胞膜等脂溶性高的部位会产生较强的荧光。因此Liperfluo适用于活细胞中脂质过氧化物的荧光成像或流式分析。
特点：
1）能够成像和检测细胞中的脂质过氧化物
2）长波长激发，可以减少光损伤和自发荧光对细胞的影响
3）高度脂质过氧化物特异性
研究领域
在铁死亡研究中：
作为细胞死亡形式之一，在铁死亡研究中使用到Liperfluo
| 细胞种类
(铁死亡诱导剂） |
论文信息 |
| 人支气管上皮细胞（RSL3） | Pseudomonas aeruginosa utilizes host polyunsaturated phosphatidylethanolamines to trigger theft-ferroptosis in bronchial epithelium. |
| 小鼠成纤维细胞(RSL3) | Oxidized arachidonic and adrenic PE s navigate cells to ferroptosis. |
| HeLa细胞(添Erastin或Brefeldin A) | Golgi stress mediates redox imbalance and ferroptosis in human cells. |
原理
Liperfluo是Spy-LHP的类似物，可用于检测脂质过氧化物 (LPO)，Liperfluo会被脂质过氧化物特异性氧化而在乙醇等有机溶剂中发出很强的荧光。由于氧化型Liperfluo的激发和发射波长分别为524 nm和535 nm (均为长波长)，因此可以减轻光对测定样品的损伤和降低样品的自发荧光。由于Liperfluo在二异喹啉环的一个末端连接有四乙二醇基团，因此提高了它在水溶液中的分子分散性。虽然它的氧化型在水溶液中几乎没有荧光，但是在细胞膜等脂溶性高的部位会产生较强的荧光。因此Liperfluo适用于活细胞中脂质过氧化物的荧光成像或流式分析。
荧光特性
激发波长Ex：488 nm，发射波长Em：500-550 nm
操作步骤
1.在dish等容器中接种细胞并培养。
2.去除培养基后，用无血清培养基清洗一次。
3.加入合适浓度的Liperfluo工作液，在37℃培养30 min。
※请根据细胞种类，诱导药物等实验条件，摸索最佳的Liperfluo工作液浓度。
4.去除上清液后，用无血清培养基清洗2次。
5.用荧光显微镜或流式细胞仪进行检测。
实验例
用激光共聚焦荧光显微镜观察HeLa细胞
1) 在 μ-slide 8孔板中 (ibidi公司) 接种HeLa细胞 (3.0×104个/孔、含血清MEM培养基)，在37℃ 5%的CO2培养箱中过夜培养。
2) 去除培养基，用无血清MEM培养基清洗细胞1次。
3) 将200 μl用无血清MEM培养基稀释的1 μmol/l的Liperfluo溶液加入8孔板中，在37℃ 5%的CO2培养箱中培养30 min。
4) 去除溶液，用200 μl HBSS清洗2次。
5) 均匀地加入200 μl用HBSS稀释的500 μmol/l的 t-BHP(tert-Buthyl Hydroperoxide) 溶液，在37℃ 5%的CO2培养箱中培养60 min。
6) 用共焦荧光显微镜观察 (激发波长：488 nm，发射波长：500-550 nm)。
用流式细胞仪检测HeLa细胞
1) 将HeLa细胞 (1.0×105个/孔、含血清MEM培养基) 接种至6孔板(Thermo公司) 中，在37℃ 5%的CO2培养箱中过夜培养。
2) 去除培养基，用无血清MEM培养基清洗细胞1次。
3) 将2 ml用无血清MEM培养基稀释的1 μmol/l的Liperfluo溶液加入6孔板中，在37℃ 5%的CO2培养箱中培养30 min。
4) 去除溶液，用2 ml HBSS清洗2次。
5) 均匀地加入2 ml用HBSS稀释的500 μmol/l的t-BHP (tert-Buthyl Hydroperoxide) 溶液，在37℃ 5%的CO2培养箱中培养60 min。
6) 用胰酶消化细胞后，用含有血清的MEM培养基重悬细胞，移至管中并将培养基更换为HBSS。
7) 用流式细胞仪检测 (激发波长：488 nm，发射波长：515-545 nm)。
用Erastin诱导铁死亡细胞的荧光成像
1) 在 μ-slide 8孔板中 (ibidi公司) 接种A549细胞 (1.0×105个/孔、含血清DMEM培养基)，在37℃ 5%的CO2培养箱中过夜培养。
2) 去除培养基，加入200 μl用无血清DMEM培养基稀释的50 μmol/l的Erastin溶液，在37℃ 5%的CO2培养箱中过夜培养。
3) 去除培养基，用200 μl HBSS清洗2次。
4) 去除HBSS，加入200 μl用HBSS稀释的1 μmol/l的Liperfluo溶液，在37℃ 5%的CO2培养箱中培养30 min。
5) 去除溶液，用200 μl HBSS清洗2次。
6) 用激光共焦荧光显微镜观察 (激发波长：488 nm，发射波长：500-550 nm)。
常见问题Q&A
| Q1.文献实验方法：先加Liperfluo，后加药；说明书实验方法：先加药，后加探针， 哪种方法比较好？ |
| A1: 都可以。
先加Liperfluo再加药 用共聚焦荧光显微镜观察HeLa细胞 （1）在μ-slide 8孔板中（ibidi公司）接种HeLa细胞（3.0×104个/孔、含血清MEM培养基），在37℃ 5%的CO2培养箱中过夜培养。 （2）去除培养基，用无血清MEM培养基清洗细胞一次。 （3）将200 μl无血清MEM培养基稀释后的1 μmol/l的Liperfluo溶液加入8孔板中，在37℃ 5%的CO2培养箱中培养30 min。 （4）去除溶液，用200 μl HBSS清洗2次。 （5）均匀地加入200 μl用HBSS稀释的500 μmol/l的t-BHP(tert-Buthyl Hydroperoxide) 溶液，在37℃ 5%的CO2培养箱中培养60 min。 （6）用共焦荧光显微镜观察 (激发波长：488 nm，发射波长：500-550 nm)。 先加药再加Liperfluo （1）在 μ-slide 8孔板中 (ibidi公司) 接种A549细胞 (1.0×105个/孔、含血清DMEM培养基)， 在37℃ 5%的CO2培养箱中过夜培养。 （2）去除培养基，加入200 μl用无血清DMEM培养基稀释的50 μmol/l的Erastin溶液， 在37℃ 5%的CO2培养箱中过夜培养。 （3）去除培养基，用200 μl HBSS清洗2次。 （4）去除HBSS，加入200 μl用HBSS稀释的1 μmol/l的Liperfluo溶液， 在37℃ 5%的CO2培养箱中培养30 min。 （5）去除溶液，用200 μl HBSS清洗2次。 （6）用激光共焦荧光显微镜观察 (激发波长：488 nm，发射波长：500-550 nm)。 |
| Q2. Liperfluo如果按照文献进行，先加探针，后加药，荧光淬灭时间为2小时可能无法满足实验，希望延长荧光时间，是否有好的方法？或者是否可以加荧光防淬灭剂？ |
| A2: 关于荧光抗淬灭剂：由于抗淬灭剂的作用原理，有可能无法在实验中使用。
其他的改善方法： (1)如果褪色的原因是由光源照射造成的褪色。可以尝试减小光源强度进行观测。 (2)清洗操作后长时间放置可能会造成探针向细胞外漏出。可考虑不清洗直接观察。 |
| Q3.Liperfluo由于是活细胞荧光探针，如果铁死亡发生，导致细胞膜破裂后，荧光是否存在？ |
| A3:由于Liperfluo是活细胞探针，对死细胞无法发挥出探针的正常性能。 |
| Q4：培养基中酚红或血清对实验有没有影响？此外，在背景高或荧光弱的情况下有没有改善意见？ |
| A4:可用于酚红或含血清培养基。但是，如果背景高，请用PBS替换。 此外，当背景较高时，Liperfluo可能会被光自然氧化，培养时也请尽量遮光。
(溶解后请务必用铝箔等遮光)。 荧光强度弱的情况下，即使反应时间延长，背景也会变高，所以不推荐。 因此，建议调整设备 (荧光观察)的条件。 1.增强激发光的强度。 2.延长曝光时间。 |
| Q5：悬浮和贴壁细胞都可以使用Liperfluo染色吗？是否可以染色固定细胞 |
| A5:悬浮和贴壁细胞，都可以使用。
有实验经验的：HL-60细胞(悬浮细胞)，CHO细胞·SH-SY5Y细胞(贴壁细胞)等，固定的细胞不能染色。 |
特点：
● 细胞、组织样品均可检测
● 操作更加简单
● 采用荧光法灵敏度更高
产品概述
丙二醛(MDA)是脂质过氧化物分解后形成的一种化合物。因此，MDA 是检测细胞和组织中脂质过氧化物的最常见的指标之一，在氧化应激、铁死亡等领域的研究中被广泛使用。MDA Assay Kit 可以检测样品中的 MDA 浓度，通过硫代巴比妥酸（TBA）与水解产生的 MDA 反应形成的 TBA 复合体的吸光度或荧光强度来检测样品中的丙二醛（MDA）。试剂盒中配有抗氧化剂(Antioxidant)，可以防止样品在反应过程中发生不必要的氧化，从而确保获得准确的实验结果。
试剂盒内含
测定原理
本试剂盒采用经典的TBA法，通过检测MDA/硫代巴比妥酸(TBA)复合体的荧光或吸光度来检测细胞或组织中的MDA浓度。此外，试剂盒中还附带MDA标准溶液，以便通过标准曲线检测样品中的MDA。
产品特点
简化操作步骤
一般的MDA检测试剂盒(TBA法)，作为底物的硫代巴比妥酸(TBA)需要天平称量和高温加热溶解的步骤。而同仁化学研究所的MDA试剂盒中的TBA无需称量和加热溶解的操作，从而减少由于称量等造成的误差，使得实验结果的孔间差更小。同时，还可大幅缩短操作所需的时间。
细胞、组织样品均可检测
细胞样品通过荧光法检测。组织样品可以根据样品中MDA的含量在荧光法和吸光度法之间自由选择。具体可参考下表。
实验例
由于Erastin可以抑制xCT（胱氨酸/谷氨酸转运体），是最常见的铁死亡诱导剂之一。使用同仁化学研究所的MDA试剂盒检测Erastin处理的HepG2(人肝癌细胞)中MDA的变化。通过标准曲线(用BCA法蛋白定量校准后)，计算样品中MDA的浓度。可以发现，Erastin处理的细胞中，MDA含量明显上升。
特点：
● 检测灵敏度高
● 操作简便，用时短
● 可以用荧光酶标仪做高通量筛选
● 荧光染料泄露少，数据重现性高
凑单关联产品TOP5
NO.1. Cell Viability Assay Kit – Luminescent Detection 细胞增殖/毒性检测-发光法(CCK-L)
NO.2. Caspase-3 Assay Kit-Colorimetric- 细胞凋亡检测
NO.3. Cell Counting Kit-8 细胞增殖毒性检测
NO.4. DALGreen – Autophagy Detection 细胞自噬检测
NO.5. FerroOrange 细胞亚铁离子检测
产品概述
细胞通过摄入各种各样的营养物质并在胞内的代谢作用下产生能量。营养物代谢的过程随着细胞外环境、细胞状态、细胞种类的不同亦不尽相同。近年来的研究发现，营养代谢不仅与能量的产生密切相关，还与基因表达等各种各样的细胞调节机制有关。葡萄糖是最重要的一种营养物质，细胞摄取葡萄糖的过程对于研究和理解细胞机能非常重要。细胞摄取葡萄糖的评价方法主要是放射性同位素示踪法。但是由于放射性同位素示踪法操作繁杂，泛用性并不高。另外，还有一种使用2-Deoxy-D-glucose(2-DG)的酶循环法，该方法虽然可以进行孔板检测，但是无法用于荧光显微镜和流式细胞仪观察。因此，最近常用的方法是通过葡萄糖类似物2-NBDG的荧光检测法1)。然而，2-NBDG也有荧光强度弱、灵敏度低的问题，而且被细胞摄取的2-NGDG还有从细胞中向外泄漏的情况出现。同仁化学研究新开发的荧光葡萄糖类似物Glucose Uptake Probe-Green是一种比2-NBDG灵敏度更高的葡萄糖摄取能力检测试剂。而且使用本试剂盒中包含的Washing and Imaging (WI) Solution可以抑制探针从细胞内泄漏，得到重现性更高的实验数据。
产品优势
与传统方向相比的优势！ 4大特征
由于采用高亮度的荧光染料，相较于传统方法(2-NBDG)可以在更短时间内进行高灵敏度检测。
① 高灵敏度
2-NBDG在水中的荧光强度很低，而本试剂盒采用的荧光染料可以进行高灵敏度的葡萄糖摄取能力检测。
<观测条件>
细胞： A549细胞
检测仪器：荧光显微镜
检测滤光片：GFP (Ex: 470 /40 nm; Em: 525 /50 nm)
② 快速检测
使用高亮度的Glucose Uptake Probe-Green，即使使用2-NBDG完全相同的实验步骤，也可以大幅缩短实验时间。
操作的前处理、染色(进入细胞内的过程)的步骤只需要清洗3次，非常简便
③ 荧光酶标仪的多样品检测
2-NBDG很难用于荧光酶标仪的检测，而本试剂盒可用于荧光酶标仪的高通量筛选实验。
<检测条件>
细胞：A549细胞
Ex: 488 nm; Em: 520 nm
④ 减少荧光染料的泄漏
使用试剂盒附带的WI Solution清洗细胞，可以抑制染料进入细胞后的泄漏，得到重现性更高的数据。
使用HBSS清洗细胞时
使用WI Solution清洗细胞时
(Scale Bar: 50 μm)
<观测条件>
细胞：A549细胞
检测仪器：荧光显微镜
检测滤光片：GFP (Ex: 470 /40 nm; Em: 525 /50 nm)
与传统法的比较
Glucose Uptake Probe-Green和2-NBDG都可以用于荧光显微镜和流式细胞仪的检测。而相比较于2-NBDG的激发波长，Glucose Uptake Probe-Green对于488 nm的激发光以及GFP, FITC滤光片的适用度更高。
| 产品名 | 荧光
显微镜 |
荧光
酶标仪 |
流式
细胞仪 |
染料滞留时间 | 荧光特性 |
| Glucose Uptake Assay Kit-Green | 〇 | 〇 | 〇 | 1 h※ | λex: 507 nm, λem: 518 nm |
| 2-NBDG | 〇 | × | 〇 | 30 min以下※ | λex: 465 nm, λem: 540 nm |
※A549细胞的检测结果，不同的细胞种类，染料的滞留时间可能会有差异。
相关产品区别
与Glucose Assay Kit的不同点
Glucose Uptake Probe-Green和Glucose Assay Kit-WST(货号:G264)的不同点。
1.Glucose Assay Kit-WST可以定量检测细胞上清液中葡萄糖的消耗量。
Glucose Uptake Assay Kit无法定量检测葡萄糖。
2.Glucose Uptake Assay Kit-Green可短时间内检测葡萄糖摄取能力的差值。
Glucose Assay Kit-WST无法在短时间内检测葡萄糖量的变化。
Glucose Assay Kit-WST与本试剂盒的差别，通过下面的检测实例来说明。
实验例：用葡萄糖摄取抑制剂(Cytochalasin B)处理的HepG2细胞的葡萄糖消费量和葡萄糖摄取能力的检测。
实验的流程和检测结果：
实验例
实验例1：Cytochalasin B对葡萄糖摄取的抑制作用
HepG2细胞经过葡萄糖转运蛋白抑制剂Cytochalasin B处理后，使用本试剂盒对葡萄糖摄取能力的抑制作用进行高灵敏度观察以及数值化的检测。
荧光显微镜观察
(Scale Bar: 50 μm)
<观测条件>
细胞：HepG2细胞
使用培养基：MEM (5.5 mmol/l Glucose)
培养条件：5 µmol/l Cytochalasin B / MEM （5.5 mmol/l Glucose, 10% FBS）, 37℃, 24 h
染色条件：Glucose Uptake Probe (500倍稀释)/DMEM （0 mol/l Glucose）, 37℃, 15 min
检测仪器：荧光显微镜； 滤光片：GFP (Ex: 470 /40 nm; Em: 525 /50 nm)
荧光酶标仪
<检测条件>
Ex: 488 nm; Em: 520 nm
实验例2：Insulin(胰岛素)对细胞葡萄糖摄取能力的促进
胰岛素对脂肪细胞(adipocyte)的葡萄糖摄取能力的影响通过本试剂盒进行高灵敏度检测。
荧光显微镜观察
(Scale Bar: 50 μm)
<观测条件>
细胞：mouse adipocyte
使用培养基：DMEM (5.5 mmol/l Glucose, 10% FBS)
刺激条件：0 or 1 µmol/l Insulin / DMEM (0 mmol/l Glucose , serum free), 37℃, 15 min
染色条件：Glucose Uptake Probe-Green (500倍稀释) /DMEM (0 mmol/l Glucose, serum free), 37℃, 15 min
检测仪器：荧光显微镜； 滤光片：GFP (Ex: 470 /40 nm; Em: 525 /50 nm)
荧光酶标仪检测
<检测条件>
Ex: 488 nm; Em: 520 nm
※由于脂肪细胞的特性，很难在孔板上均匀分布，所以实验数据会有一些孔间差。
<实验操作>
1.脂肪细胞分别接种到不同的ibidi 96孔板中，过夜培养。
2.用不含葡萄糖的DMEM培养基清洗细胞2次后，加入不含葡萄糖的培养基(0 or 1 μmol/l Insulin)。
3.在37℃下培养15 min。
4.加入用不含葡萄糖的培养基500倍稀释的Probe solution， 37℃下培养15 min。
5.用预冷至4℃的WI Solution(1x)清洗3次后，再次添加WI Solution(4℃)。
6.分别用荧光显微镜和荧光酶标仪检测。
实验例3：前脂肪细胞和细胞脂肪细胞的葡萄糖摄取能力的比较
使用本试剂盒对前脂肪细胞(preadipocyte)和脂肪细胞(adipocyte)的葡萄糖摄取能力进行高灵敏度检测。
荧光显微镜观察
(Scale Bar: 50 μm)
<观测条件>
细胞：preadipocyte, adipocyte
使用培养基：DMEM (5.5 mmol/l Glucose, 10% FBS)
染色条件：Glucose Uptake Probe-Green (500倍稀释) /DMEM (0 mmol/l Glucose, serum free), 37℃, 15 min
检测仪器：荧光显微镜； 滤光片：GFP (Ex: 470 /40 nm; Em: 525 /50 nm)
荧光酶标仪检测
<检测条件>
Ex: 488 nm; Em: 520 nm
※由于脂肪细胞的特性，很难在孔板上均匀分布，所以实验数据会有一些孔间差。
<实验操作>
1.前脂肪细胞和脂肪细胞分别接种到不同的ibidi 96孔板中，过夜培养。
2.用不含葡萄糖的DMEM培养基清洗细胞2次后，加入不含葡萄糖的培养基。
3.在37℃下培养15 min。
4.加入用不含葡萄糖的培养基500倍稀释的Probe solution， 37℃下培养15 min。
5.用预冷至4℃的WI Solution(1x)清洗3次后，再次添加WI Solution(4℃)。
6.分别用荧光显微镜和荧光酶标仪检测。
实验例4：饥饿培养引起的细胞自噬和葡萄糖摄取变化
用自噬体染料DAPRed和自噬溶酶体染料DALGreen染色HeLa细胞后，用不含氨基酸的培养基培养3小时诱导细胞自噬。通过DAPRed和DALGreen的荧光强度增高确认细胞发生了细胞自噬，另外通过使用Glucose Uptake Probe-Blue发现细胞摄取葡萄糖的能力上升。
(Scale Bar: 50 μm)
<检测条件>
荧光显微镜
Blue: Ex = 340-380 nm, Em = 435-485 nm
Green: Ex = 450-490 nm, Em = 500-550 nm
Red: Ex = 533-557 nm, Em = 570-640 nm
常见问题Q&A
| Q1: Glucose Uptake Probe-Green具体是通过哪种葡萄糖转运蛋白进入细胞的? |
| A：对于具体的每一种葡萄糖转运蛋白的特异性目前还没有详细的数据。 |
| Q2：目前有过检测实例的细胞有哪些? |
| A：目前的检测实例细胞系请参考下表： |
| 细胞种类 | Probe stock solution
的稀释倍率 |
染色时间 | |
| 人肺腺癌细胞 | A549 | x 500 | 15 min |
| 人肝癌细胞 | HepG2 | x 500 | 15 min |
| 前脂肪细胞 | preadipocyte(3T3-L1) | x 500 | 15 min |
| 脂肪细胞 | adipocyte(3T3-L1) | x 500 | 15 min |
| 恶性黑色肿瘤细胞 | MO5 | x 500 | 15 min |
| 小鼠成肌细胞 | C2C12 | x 500 | 5 min |
| 人星形胶质瘤细胞 | U-251 MG | x 500 | 15 min |
| 人子宫颈癌细胞 | HeLa | x 500 | 15 min |
| 小鼠肺癌细胞 | 3LL | x 50000 | 15 min |
| T细胞 | CD4+ T cell | x 50, x500 | 15 min |
| 小鼠巨噬细胞 | J774.1 | x 500 | 15 min |
| 线虫 | N2 | x 500 | 90 min |
| Q3：Glucose Uptake Probe-Green被细胞摄入后，会被分解或代谢掉吗? |
| A：染料的荧光部分非常稳定，实验范围内的操作不会造成分解。另外，类葡萄糖的部位，从结构上考虑可能会被Hexokinase(己糖激酶)磷酸化，除此以外应该不会参加任何代谢反应。 |
| Q4：Glucose Uptake Probe-Green被活细胞摄入后，可以进行细胞固定的操作吗? |
| A：由于荧光探针会从细胞内漏出，染色后无法进行细胞固定。 |
| Q5：用荧光酶标仪检测时候，对孔板有什么特别要求吗? |
| A：需要使用荧光检测用的细胞培养板。 |
| Q6：Probe working solution可以长期保存吗? |
| A：Probe working solution无法长期保存，请现配现用。Probe stock solution冷冻可以保存一个月。 |
| Q7：无法观察到荧光信号变化的时候，应该怎么办? |
| A：预实验的时候可以先从稀释浓度(x250~x1,000)、染色时间(5 min~1 h)范围内进行摸索。 |
| Q8：荧光背景高的时候，应该怎么办? |
| A：可能是由于有未被细胞摄入的残留荧光染料。请用WI Solution再多进行一次清洗操作。 |
| Q9：Glucose Uptake Probe-Green对细胞有毒性吗? |
| A：使用同仁化学研究所的Cell Counting Kit-8(货号:CK04)对A549细胞的Glucose Uptake Probe-Green细胞毒性进行了检验，没有发现细胞毒性的产生。 |
| Q10：用WI solution清洗之后，荧光染料可以在细胞内停留多长时间? |
| A：一般在室温下可以保持在细胞内1 h左右，不同的细胞种类，时间可能会有一定差别。 |
| Q11：可以对葡萄糖进行定量检测吗? |
| A：本产品不能用于葡萄糖的定量检测。如果需要定量检测培养基中的葡萄糖的消耗量或者细胞内的葡萄糖量，可以使用同仁化学研究所的Glucose Assay Kit-WST(货号:G264)。 |
| Q12：可以对被细胞摄入的染料进行定量吗? |
| A：不可以对细胞摄入的染料进行定量。本试剂盒是葡萄糖摄取能力强弱或增减的检测试剂盒。 |
| Q13：如果无法通过葡萄糖的竞争性抑制细胞探针的摄取，该如何解决？ |
A：竞争性抑制是否发生取决于每个细胞中的葡萄糖转运蛋白的表达水平和类型。（例如：HepG2细胞）
在这种情况下，使用2-脱氧葡萄糖(2-DG)进行预处理可能会在葡萄糖竞争抑制方面产生差异。 请参考Glucose Uptake Assay Kit-Green(产品代码:UP02)的使用示例。 2-DG预处理对探针摄取的抑制和葡萄糖竞争性抑制(HepG2细胞) 1.将细胞接种在培养皿或微孔板中，并在5% CO₂培养箱(37°C)中培养过夜。 2.除去培养基[DMEM (10% FBS，高葡萄糖)]后，加入50 mmol/l 2-DG/培养基，并 在5% CO₂培养箱(37℃)中培养细胞2小时。 3.清洗细胞两次。 4.加入预热的DMEM(无葡萄糖，无血清)并将细胞在5%CO₂中孵育 在培养箱(37°C)中培养15 min。 5.除去上清液后，加入预热的探针溶液并在5% CO₂中孵育 在培养箱(37°C)中培养15 min。 6.除去上清液后，用冷却的WI溶液(1x)洗涤细胞两次。 7.除去上清液后，加入冷却后的WI溶液(1x)，并在室温下培养 5分钟。 8.除去上清液后，加入冷却的WI溶液(1x)。 9.荧光显微镜下观察细胞。
|
| Q14: 以下为不同细胞添加抑制剂后，葡萄糖摄取能力检测实验。 |
 |
规格性状
| Glucose Uptake Probe-Green ×1
WI Solution (50X) 5 ml ×1 供参考的可测次数 每个试剂盒大约可检测12枚35 mm dish或1枚96孔板 |
特点：
● 灵敏度高
● 易上手
● 多种仪器均可检测
凑单关联产品TOP5
NO.1. Cell Counting Kit-8 细胞增殖毒性检测
NO.2. ROS Assay Kit 活性氧检测
NO.3. FerroOrange 细胞亚铁离子检测
NO.4. GSSG/GSH Quantification Kit II 氧化型/还原型谷胱甘肽
NO.5. Mitophagy Detection Kit 线粒体自噬检测
试剂盒内含
产品概述
细胞中的线粒体作为有氧呼吸产生ATP的主要场所，是体内重要的细胞器之一，常被用于早期细胞毒性、氧化应激、细胞凋亡等研究中1)。线粒体活性的降低与机能失调，已被证实与癌症、衰老、神经退行性疾病 (如阿尔兹海默症、帕金森病等) 等密切相关2)3)。
JC-1是一种被广泛使用的小分子线粒体膜电位探针，依赖于线粒体膜电位在线粒体中聚集，染料伴随聚集过程，荧光从绿色 (530 nm) 变为红色 (590 nm)。当线粒体发生去极化，红/绿荧光强度比值降低。以往的研究者反映，JC-1不易溶于水并有大量沉淀产生。但与其他公司的产品不同，同仁化学研究所研制的JC-1试剂解决了这一问题，避免了沉淀的产生。同时使用试剂盒中配制的成像缓冲液 (Imaging Buffer)，可大幅降低荧光背景并在检测过程中保护细胞不受损伤。
当JC-1工作液的浓度为2 μmol/l, 每次用量为100 μl时，可以检测500次。
产品特点
1.为什么要检测线粒体膜电位
线粒体不仅是细胞内产生能量的场所，它还与癌症、衰老、阿尔兹海默症、帕金森等神经变异性疾病密切相关。因此，针对线粒体状态的研究非常重要，其中线粒体膜电位的变化经常被作为重要的指标之一检测。
当线粒体正常、膜电位差保持不变时，JC-1会聚集并发出红色荧光，而当膜电位降低时，JC-1会作为单体存在并发出绿色荧光。红色和绿色荧光强度的变化可以作为检测线粒体状态的指标。
2.初次使用也很容易上手
3.去极化的检测实例
使用去极化剂carbonylcyanide-p-trifluoromethoxyphenylhydrazone（FCCP）对HeLa细胞进行处理，用本试
剂盒进行检测。可以发现与未加药物的细胞相比，加药组细胞的红色荧光明显减少。
实验条件
JC-1浓度： 2 μmol/l in MEM, 染色时间30 min
FCCP浓度：100 μmol/l， FCCP处理时间1 h
检测条件
Green : Ex 488 nm/ Em 500-550 nm;
Red : Ex 561 nm/ Em 560-610 nm;
标尺: 20 μm
操作步骤
实验例
1.诱导凋亡的实验例
1.1 荧光显微镜
通过荧光颜色的改变判断由凋亡导致的线粒体膜电位的变化。
检测条件
Green: Ex 488 nm / Em 500-550 nm
Red : Ex 561 nm / Em 560-610 nm
标尺: 80 μm
1.2 流式细胞仪
定量分析单个细胞的膜电位变化
检测条件
Green: Ex 488 nm / Em 515-545 nm
Red : Ex 488 nm / Em 564-604 nm
1.3 酶标仪
确认孔板中吸光度来判断线粒体膜电位的变化
检测条件
Green: Ex 485 nm / Em 525-545 nm
Red : Ex 535 nm / Em 585-605 nm
2.诱导自噬的实验例
使用表达Parkin的HeLa细胞，分别使用线粒体自噬试剂盒（Mitophagy Detection Kit：MD01）和线粒体膜电位检测试剂盒（JC-1 MitoMP Detection Kit： MT09）来观察添加和不添加CCCP（羰基氰化物间氯苯）的线粒体状态的变化。
结果证明在未经CCCP处理的细胞中几乎未检测到线粒体自噬的发生，并且线粒体膜电位正常维持。 而在添加了CCCP的细胞中，证实了线粒体膜电位的降低（JC-1的红色荧光的降低）和线粒体的自噬（Mtphagy染料的荧光的增强）。
<检测条件>
线粒体自噬检测
Ex：561 nm，Em：570-700 nm
线粒体膜电位检测
绿色Ex：488 nm，Em：500-550 nm
红色Ex：561 nm，Em：560-610 nm
实验条件
1.将Parkin质粒导入HeLa细胞
使用HilyMax（货号：H357）将Parkin质粒引入HeLa细胞中（Parkin质粒/HilyMax试剂：0.1 μg/0.2 μl）
然后过夜培养，收集细胞进行以下检测。
2.自噬检测
向表达Parkin的HeLa细胞中添加0.1 μmol/l Mtphagy工作溶液，并在37°C下孵育30分钟。然后将细胞用HBSS洗涤，加入10 μg/ml CCCP/MEM溶液，并在37℃下孵育2小时。荧光显微镜下观察处理后的细胞。
3.线粒体膜电位检测
将10 μg/ml的CCCP/MEM溶液添加至表达Parkin的HeLa细胞中，并在37℃下孵育1.5小时。加入4 μmol/l的JC-1工作溶液使终浓度至2 μmol/l，并将细胞溶液在37℃下孵育30分钟。孵育后将细胞用HBSS洗涤，加入成像缓冲液，在荧光显微镜下观察细胞。
3.线粒体膜电位与细胞周期关联性
将已知能在细胞周期的G2/M期起作用以终止细胞增殖并诱导细胞衰老的阿霉素（DOX）加入A549细胞后，
使用细胞周期检测试剂盒蓝色（产品代码：C549）/深红色（产品代码：C548）后检测。
结果证实了A549细胞的细胞周期确实发生了变化，同时用细胞衰老检测试剂盒–SPiDER-βGal（产品代码：SG03）证实了细胞产生衰老，实验证实了线粒体膜电位会发生变化。
参考文献
| 文献No. | 检测对象 | 检测仪器 | 引用 |
| 1) | 细胞（U2OS, HeLa） | 荧光显微镜 | T. Namba, “BAP31 regulates mitochondrial function via interaction with Tom40 within ER-mitochondria contact sites “, Sci Adv., 2019, 5, (6), 1386. |
| 2) | 细胞（Neuron） | 荧光显微镜 | I. Kawahata, L. Luc Bousset, R. Melki and K. Fukunaga , “Fatty Acid-Binding Protein 3 is Critical for α-Synuclein Uptake and MPP+-Induced Mitochondrial Dysfunction in Cultured Dopaminergic Neurons “, Int J Mol Sci., 2019, 20, 5358. |
| 3) | 细胞（3T3L1, C2C12） | 流式细胞仪 | M. Kurano, K. Tsukamoto, T. Shimizu, H. Kassai, K. Nakao, A. Aiba, M. Hara and Yatomi , “Protection Against Insulin Resistance by Apolipoprotein M/Sphingosine 1-Phosphate “, Diabetes, 2020, DOI: 10.2337/db19-0811. |
| 4) | 细胞 | 流式细胞仪 | T. Nechiporuk, S.E. Kurtz, O. Nikolova, T. Liu, C.L. Jones, A. D. Alessandro, R. C. Hill, A. Almeida, S. K. Joshi, M. Rosenberg, C. E. Tognon, A. V. Danilov, B. J. Druker, B. H. Chang, S. K McWeeney and J. W. Tyner , “The TP53 Apoptotic Network Is a Primary Mediator of Resistance to BCL2 Inhibition in AML Cells.”, Cancer Discov, 2019, 9, |
| 5) | 细胞 | 荧光显微镜 | G. Yang, M. Fan, J. Zhu, C. Ling, L. Wu, X. Zhang, M. Zhang, J. Li, Q. Yao, Z. Gu and X. Cai, “A multifunctional anti-inflammatory drug that can specifically target activated macrophages massively deplete intracellular H2O2 and produce large amounts CO for a highly efficient treatment of osreoarthritis” , Biomaterials, 2020, doi:10.1016/j.biomaterials.2020.120155. |
| 6) | 细胞（ARPE-19) | 荧光显微镜 | J. H. Quan, F. F. Gao, H. A. Ismail, J. M. Yuk, G. H. Cha, J. Q. Chu and Y. H. Lee, “Silver Nanoparticle-Induced Apoptosis in ARPE-19 Cells Is Inhibited by Toxoplasma gondii Pre-Infection Through Suppression of NOX4-Dependent ROS Generation”, Int J Nanomedicine , 2020, 15, 3695–3716. |
常见问题Q&A
| Q1: 本试剂盒可以检测多少次？ |
| A1:大概的使用次数请参考下表： |
| 检测装置 | 容器 | 使用次数 | 液量 |
| 流式细胞仪 | – | 100次 | 0.5 ml/次 |
| 荧光显微镜 荧光酶标仪 |
35 mm dish | 25次 | 2 ml/孔 |
| 8孔Chamber Slide | 30次 | 200 μl/孔 | |
| 96孔板 | 5次 | 100 μl/孔 |
| Q2：在JC-1染色后，可以使用PBS代替HBSS洗涤吗？ |
| A2：我们建议使用HBSS来减少对细胞的损伤。如果您手边没有HBSS的话，建议使用培养基洗净。 |
| Q3：可以使用含血清的培养基吗？ |
| A3：在清洗细胞和Working Solution中可以使用含血清的培养基。在观察荧光时建议使用Imaging Buffer。如果一定要使用含血清的培养基的话，建议不要加酚红。 |
| Q4：染色后细胞固定或者固定后进行染色可以实现吗？ |
| A4：细胞固定操作会使得线粒体去极化，所以染色前后均不能进行细胞固定。 |
|
Q5：处理后的样品与对照组相比较，红和绿两种荧光值都增加（或减少）了，结果该如何解释？ |
| A5：请先比较实验组和对照组的荧光比值，两者相比，荧光比越低，线粒体膜电位越低。
用荧光之比进行结果分析的理由。 JC-1由于膜电位依存性地在细胞中积蓄，根据细胞的状态，每个细胞的JC-1的浓度有可能不同。 由于对照组和实验组处理样品的细胞状态不同，JC-1的累积浓度不同。) 另外，在线粒体膜电位较高的状态下，JC-1会聚集在一起，使荧光从绿色转移到红色。 该聚集体的量取决于膜电位的程度，因此可以用红/绿之比来比较样品之间的线粒体膜电位。 |
特点：
● 荧光持续时间长
● 可在含血清培养基中染色
● 荧光显微镜、流式细胞仪均可检测
订购满5000元，200元礼品等你拿
凑单关联产品TOP5
NO.1. FerroOrange 细胞亚铁离子检测
NO.2. MitoPeDPP 线粒体内脂质过氧化物检测
NO.3. Liperfluo 细胞脂质过氧化物检测
NO.4. ROS Assay Kit -Highly Sensitive DCFH-DA- ROS检测
NO.5. GSSG/GSH Quantification Kit II 氧化型/还原型谷胱甘肽
产品概述
细胞内有各种各样的细胞器，承担着各种各样必须的生命活动。其中线粒体不仅是通过氧化磷酸化反应生成ATP 的场所，它还与癌症、细胞衰老、阿尔兹海默症、帕金森综合症等神经退行性疾病紧密相关，因此它是细胞内最重要的细胞器之一。
在对线粒体的形态和动态进行观察以及定量检测时，通常使用小分子荧光探针标记和荧光蛋白的基因转染两种方法。荧光蛋白的基因转染存在转染效率不稳定等情况，因此操作简便的小分子荧光探针的使用更为广泛。现在市面上销售的小分子荧光探针中，多为含有氯甲基的探针，该探针存在观察时间短，染色时不能使用含血清的培养基，染色后荧光背景高等问题。MitoBright LT 荧光探针克服了这些问题，可在线粒体内稳定存在一天以上，条件合适的情况下可达到一周。而且与含有氯甲基的探针相比，染色后的荧光强度更高。本品直接采用DMSO 溶液包装，可快速方便的进行线粒体染色。荧光颜色有Green, Red, Deep Red 等多种选择，可满足多重染色等各种各样的实验要求。
产品特点
1.可长时间在细胞内存在
用HBSS 清洗 HeLa 细胞后，分别用 MitoBright LT 和其他公司的试剂进行染色，更换含血清的培养
基，培养4天后观察线粒体染色情况。其他公司的染色试剂在4天后荧光强度大幅降低，而MitoBright
LT 依然维持着高荧光强度，并且在染色7日后依然可以观察到荧光。
＜检测条件＞
MitoBright LT Green 、（T 公司）Green：Ex：488 nm/Em：500–560 nm
MitoBright LT Red 、（T 公司）Red：Ex：561 nm/Em：560–620 nm
MitoBright LT Deep Red 、（T 公司）Deep Red：Ex：640 nm/Em：650–700 nm
2.可以使用含血清培养基
用MitoBright LT 和其他公司试剂，分别用含有血清和不含血清的培养基染色。其他公司试剂在含有血清的培养基染色时，荧光明显减弱，而 MitoBright LT 在含有血清的培养基条件下，荧光没有减弱，可明显观察到线粒体的染色情况。
3.荧光显微镜观察
HeLa细胞用CCCP处理，并与线粒体检测试剂（Mtphagy Dye）和线粒体染色试剂（MitoBright LT Green）共同染色，并经过一段时间（6小时）后进行检测。
<检测条件>
设备：LSM-700 Laser scanning confocal microscope (LSCM)
(Carl Zeiss, Oberkochen, Germany)
激发波长：
MitoBright LT Green 488 nm
Mtphagy Dye 555 nm
物镜：63x
拍摄时间：6小时
拍摄间隔：15秒
实验例
用流式细胞仪检测
1. 用RPMI 培养基(10% fetal bovine serum, 1% penicillin-streptomycin)配制Jurkat 细胞悬液(3.2×105cell/ml)播种于5 cm 培养皿，37℃，5% CO2培养箱内培养一晚。
2. 去除培养基，加入MitoBright LT Working Solution (0.1 μmol/L,5 ml)， 37℃培养30 分钟。
3. 去除溶液，用 5mL 的PRPMI 培养基清洗细胞2次。
4. 添加RPMI培养基，持续培养细胞，每隔2天用流式细胞仪检测。
在胶原蛋白涂覆玻璃板上观察线粒体荧光成像
胶原蛋白涂覆玻璃板通常用于线粒体形态的高倍放大观察。
现有的线粒体染色试剂存在吸附胶原蛋白和升高背景的问题，但是MitoBright LT系列可以在不受背景影响的情况下清楚地对线粒体进行染色。
<染色条件>
将HeLa细胞接种在胶原蛋白涂覆玻璃板上，培养24小时，提取上清液并用HBSS洗涤。
加入100nmol / L的MitoBright LT Green工作溶液，培养30分钟后，提取上清液并用HBSS洗涤后用荧光显微镜观察。
<检测条件>
Ex：488 nm，Em：500-560 nm
<结果>
现有的线粒体染色剂存在吸附胶原蛋白和升高背景的问题，但是MitoBright LT系列可以清晰地对线粒体染色，而不受背景影响。
通过超分辨率激光显微镜（STED）观察线粒体内部构造
线粒体疾病致突变的Cybrid细胞用MitoBright-LT-Deep Red染色，用超分辨激光显微镜(STED)观察，证实线粒体嵴结构异常。
＜实验条件＞
色素：MitoBrightLT Deep Red（100 nmol/l）
仪器：Leica超分辨率激光显微镜TCS SP8 STED 3X
Ex：640 nm / Em： 650-700 nm
STED激光：775nm
<实验步骤>
1将细胞接种在玻璃培养皿中，培养2天（37℃，5% CO2）。
2去除培养基后，加入使用L-15培养基（含10%FBS）制备的MitoBrightLT Deep Red（100 nmol/l）工作液。
3孵育45分钟（37度，5% CO2）。
4去除上清液，用HBSS清洗两次。
5加入L-15培养基（含10%FBS），通过超分辨率激光显微镜（Leica TCS SP8 STED）进行观察。
以上数据由东京都老年学研究所衰老控制研究小组的大澤郁朗博士和藤田泰典博士友情提供。
产品文献
同仁化学研究所开发的线粒体长效染色荧光探针MitoBright LT系列在世界范围内广受科研人员的好评。在上市后的很短时间内，就出现了多篇使用MitoBright LT系列探针的论文，下面收集整理了部分的论文，其中红色字体标记的是使用本产品标记线粒体后，长时间(最长至5天)观察线粒体动态的报道，供感兴趣的科研人员参考。
MitoBright LT 染料的荧光特性
常见问题Q&A
| Q1：MitoBright LT需要用DMSO溶液配制，反复冻结融化也不会影响试剂质量吗？ |
| A1：我们已经确认可以使用冻融30次的溶液进行染色。 |
| Q2：MitoBright LT和MitoBright的区别。 |
| A2：MitoBright LT是MitoBright具有更强细胞内滞留性性能的产品。另外MitoBright LT是溶于DMSO的产品，可以立即使用，而无需准备染色溶液。 |
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Q3：用MitoBright LT系列染色后再去极化是否会影响染色效果？ |
| A3：我们确认了去极化和细胞种类对于染色效果的影响，MitoBright LT的每种染料都有不同程度的影响。作为参考，本公司将HeLa细胞用不同的MitoBrightLT试剂进行染色，在以下条件下进行去极化处理，观察荧光染色的变化。
<染色条件> HeLa细胞用MitoBright LT（100 μmol/l，孵育30分钟）染色，并用HBSS洗涤。 用FCCP（100 μmol/l，孵育60分钟）处理，用HBSS洗涤2次，然后观察荧光。
<检测条件> MitoBright LT Green :Ex 488 nm/Em 500–560 nm MitoBright LT Red :Ex 561 nm/Em 560–620 nm MitoBright LT Deep Red :Ex 640 nm/Em 650–700 nm |
规格性状
性状：本品是黄色液体
吸光度：0.600～0.800(490 nm附近）
Animal Detection U+ Probe qPCR Super PreMix
支持引物探针全预混的高灵敏qPCR预混液
使用便捷高效 支持引物探针体系全预混，并可实现预混后37℃加压7天、反复冻融30次性能稳定，降低操作复杂度，提升实验成功率。
优异的检测灵敏度 热启动Taq酶的优越性能，配合经过升级改造的缓冲体系，实现高灵敏检测，有效降低漏检率。
兼容多重反应体系 支持多靶标同时检测。
支持快速程序 兼容快速程序，40 min内完成检测，有效提高检测效率。
dUTP/UDG 防污染系统 Heat-labile UDG在室温下即可发挥作用，降低假阳性，确保结果真实可靠。
Animal Detection U+ Probe qPCR Super PreMix 是一款适用于DNA探针法检测的专用预混液，只需额外添加引物、探针、模板即可。本预混液采用新一代超高亲和力抗体结合升级的热启动技术，实现高效封闭与准确释放，配合高效荧光保护因子，使预混液在支持引物探针全预混添加的同时实现高效扩增。
1. 预混稳定性
使用双重质控体系，将Animal Detection U+ Probe qPCR Super PreMix（Vazyme#QV114）预混引物探针后分别经30次反复冻融、37℃加压7天的处理，以-20℃保存的预混液作为对照，进行同板上机。结果显示，Vazyme#QV114预混引物探针后在相应的处理条件下，与对照组均无显著差异，试剂具有良好的预混稳定性。
2. 扩增灵敏度
以非洲猪瘟病毒(ASFV)DNA为模板，使用Animal Detection U+ Probe qPCR Super PreMix（Vazyme#QV114）及其他品牌探针法qPCR试剂，在相同反应条件下进行扩增。结果显示，与同类产品相比，Vazyme#QV114拥有更高的检测灵敏度与扩增平台。
3. 兼容多重反应体系
以非洲猪瘟病毒(ASFV)DNA为模板，使用Animal Detection U+ Probe qPCR Super PreMix（Vazyme#QV114）进行扩增。结果显示，Vazyme#QV114可兼容多重体系扩增。
4. 支持快速程序
以非洲猪瘟病毒(ASFV)DNA为模板，使用Animal Detection U+ Probe qPCR Super PreMix（Vazyme#QV114）分别在标准程序和快速程序下进行扩增。结果显示，在三重体系下两种程序的扩增曲线一致，表明Vazyme#QV114可以兼容快速程序，满足快速检测需求。
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组分 |
QV114-01 (400 rxns/25 μl reaction) |
QV114-02 (800 rxns/25 μl reaction) |
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2 × Animal Detection U+ Probe qPCR Super PreMixa |
5×1 ml |
1×10 ml |
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50 × ROX Reference Dye 1b |
200 μl |
400 μl |
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50 × ROX Reference Dye 2b |
200 μl |
400 μl |
a. 包含dNTP/dUTP Mix，Mg2+，热启动Taq酶，Heat-labile UDG等。
b. 用以校正孔与孔之间产生的荧光信号误差。
-30 ~ -15℃保存；≤0℃运输。
在HPLC的常见的问题中，经常会遇到拖尾及分叉等峰形异常情况。为了解决此类问题，需要准确判断原因。通常原因多为色谱柱或洗脱液的选择等分离条件不适合，或色谱柱内出现空隙等导致色谱柱出现异常。在此对原因的判明方法进行介绍。
最简单的方法即是使用色谱柱内添附的色谱柱出厂报告记载的检测条件进行色谱柱性能测试。当使用此条件检测的结果是柱性能正常时，则可以断定是选用的分离条件不适合导致的峰形异常。然后再围绕洗脱液等分离条件进行检讨。
而如果检测结果表现为柱性能异常时，进一步确认是设备问题还是色谱柱问题。必要时进行色谱柱的反冲或再生及更换。为了预防在分离过程中色谱柱的劣化引起的问题发生，推荐定期对色谱柱的性能进行测试。
YMC从给客户提供检测的便利性出发，在所有的色谱柱的检测报告单上均记载有包括样品浓度在内的所有的分析条件，敬请参考。
