各分离模式的特点及用途
针对核酸、多肽、蛋白质的分离，YMC拥有离子交换、体积排阻、疏水层析和反相四种模式的产品线。
对电荷异质体等不同电荷状态的成分可使用离子交换进行分离。对于疏水性存在差异的生物分子，疏水层析色谱可在维持其活性状态下将其分离。对肽图等特性解析，反相模式最为适合。对存在明显分子量差异的抗体及其凝聚体与片段的分离等，体积排阻会是最佳选择。
根据分离的用途和目的，选择适合的分离模式，可迅速进行方法开发。
各分离模式的机理和分离案例
离子交换色谱
在离子交换中，利用各化合物间的电荷差异进行样品的分离。固定相使用具有带电基团的阴离子交换担体和阳离子交换担体，流动相使用缓冲液中添加反离子对的试剂。通过离子交换作用，样品结合于固定相表面，之后随流动相中反离子对浓度的升高，样品结合力变弱，进而从总电荷小的样品开始依次洗脱流出。
关于蛋白质的电荷异质体分析一般使用离子交换色谱。
下图为使用阳离子交换柱BioPro IEX SF采用pH梯度洗脱模式和缓冲盐梯度洗脱模式对4种单抗进行的分析案例，从结果中可以看到无论哪种模式都可获得尖锐的峰形且实现了电荷异质体中众多色谱峰及异构体的分离。
| 1. natalizumab |
| 2. cetuximab |
| 3. adalimumab |
| 4. denosumab |
| Column | BioPro IEX SF (5 μm), 100 X 4.6 mmI.D. |
|---|---|
| Eluent | A) CX-1 pH Gradient Buffer A* (pH 5.6) B) CX-1 pH Gradient Buffer B* (pH 10.2) 0-100%B (0-20 min) |
| Flow rate | 0.6 mL/min |
*Purchased Thermo Fisher Scientific Inc.
| Column |
BioPro IEX SF (5 μm), 100 X 4.6 mmI.D. |
|---|---|
| Eluent | A) 10 mM MES-NaOH (pH 5.7) B) 10 mM MES-NaOH (pH 5.7) containing 1 M NaCl 0-20%B (0-20 min) |
| Flow rate | 0.6 mL/min |
- 用阳离子交换色谱柱进行的单克隆抗体高效分析
- 离子交换色谱柱・填料 BioPro IEX系列
体积排阻色谱
体积排除色谱是根据分子大小进行分离的方法。固定相使用有网眼构造孔穴的硅胶或聚合物，流动相使用对样品溶解性和稳定性好的pH缓冲液。关于样品洗脱顺序，小分子由于可以深入到孔内因此洗脱速度慢，反之未能进入孔内的大分子会被先行洗脱出来。
蛋白质的单体、二聚体、凝聚体和分解物的分离通常使用体积排阻色谱。
适于分离抗体类产品的YMC-SEC MAB可将单体和多聚体的色谱峰充分分离。同时，在用蛋白木瓜酶降解的单克隆抗体碎片分析中，该柱亦可实现同等分子量的Fc和Fab间的良好分离。
单抗和凝聚体的分析
| Column | YMC-SEC MAB (3 µm, 25 nm)
300 X 4.6 mmI.D. |
|---|---|
| Eluent | 0.1 M KH2PO4-K2HPO4 (pH 7.0) containing 0.2 M NaCl |
| Flow rate | 0.165 mL/min |
| Temperature | 25ºC |
| Detection | UV at 280 nm |
| Injection | 10 µL (5 mg/mL) |
| Sample |
Humanized monoclonal antibody |
片段分析
| Column | YMC-SEC MAB (3 µm, 25 nm), 300 X 4.6 mmI.D. |
|---|---|
| Eluent | 0.1 M KH2PO4-K2HPO4 (pH 7.0) containing 0.2 M NaCl |
| Flow rate | 0.165 mL/min |
| Temperature | 25ºC |
| Detection | UV at 280 nm |
| Injection | 2 µL (3 mg/ml) |
| Sample |
Humanized monoclonal IgG1 + Papain消化液 |
- YMC-SEC MAB
- YMC-Pack Diol
疏水层析色谱
疏水层析色谱是利用填料和蛋白质等疏水相互作用进行的分离。与反相模式不同，键合基团的覆盖率较低，由于流动相使用硫酸铵而非有机溶剂，因此可在维持蛋白质活性的状态下实现分离。通过降低流动相中硫酸铵的浓度，减弱与键合基团的作用力，使蛋白质溶出。
将小分子药物结合到单克隆抗体上的抗体偶联药物（ADC）由于其药物抗体偶联比（Drug to Antibody Ratio；DAR）的疏水性不同，因此可通过疏水层析色谱进行分离。
在ADC的DAR分析案例中，使用BioPro HIC HT色谱柱获得了良好的分离。
- Antibody
- Binding site
- Linker
- Payload
| Column | BioPro HIC HT (2.3 μm), 100 X 4.6 mmI.D. |
|---|---|
| Eluent | A) 20 mM NaH2PO4-Na2HPO4 (pH 7.0) containing 1.0 M (NH4)2SO4 B) 20 mM NaH2PO4-Na2HPO4 (pH 7.0)/2-propanol (90/10) 0-100%B (0-15 min), 100%B (15-20 min) |
| Flow rate | 0.5 mL/min |
| Temperature | 25ºC |
| Detection | UV at 280 nm |
| Injection | 10 µL |
| Sample |
Brentuximab vedotin (2.5 mg/mL) |
- 疏水层析色谱柱 BioPro HIC HT
反相色谱
反相色谱是通过样品和固定相、流动相之间的疏水相互作用来进行分离的方法。使用硅胶或杂化硅胶基质上化学键合了C18、C8、C4等疏水性官能团的固定相，流动相采用酸性水溶液或缓冲盐等与有机溶剂的混合溶液。随着流动相中有机溶剂比率的提高，从疏水性低的样品开始依次洗脱流出。
反相色谱具有很高的分辨率和很高的分离能力，且易于与MS组合，用于抗体降解物和片段的分析、肽图测定等。在LC-MS分析中加酸条件下虽然倾向于选用甲酸，但峰形往往不佳。下图单抗片段的分离案例中，分别使用TFA和甲酸条件。从测试结果看，YMC-Triart柱在添加甲酸的条件下也能获得良好的峰形。
- Fc/2
- Light chain
- Fd’
| Column | YMC-Triart Bio C4 (1.9 µm, 30 nm), 150 X 2.1 mmI.D |
|---|---|
| Eluent <TFA> | A) water/TFA (100/0.1) B) acetonitrile/TFA (100/0.1) 25-50%B (0-10 min), 90%B (10-12.5 min) |
| Eluent <Formic acid> | A) water/formic acid (100/0.1) B) acetonitrile/formic acid (100/0.1) 20-45%B (0-10 min), 90%B (10-12.5 min) |
| Flow rate | 0.4 mL/min |
| Temperature | 80°C |
| Detection | UV at 280 nm |
| Injection | 4 µL (0.25 mg/mL) |
- YMC-Triart（生物液相用）
- 関連リンク
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