标签： 乳酸检测试剂盒 L256

乳酸是细胞的一种主要代谢途径-糖酵解的代谢产物，也是肌肉疲劳和高乳酸血症的重要生物标志物。它还可以作为监测细胞内代谢途径变化的标志物。此外最近的代谢研究表明，乳酸是组织和癌细胞的三羧酸循环中碳的主要来源。

Lactate Assay Kit-WST^®可用于定量检测糖酵解代谢产生的乳酸，并优化了定量过程。本试剂盒通过测定WST^®的显色反应来定量细胞上清液中的乳酸含量，可用96孔板检测，灵敏度高，最低可检测到0.02 mmol/l的乳酸。

WST^®：WST是日本同仁化学研究所的注册商标

本试剂盒通过测定WST的显色反应来定量细胞上清或细胞内的乳酸含量。

另外，试剂盒中含有乳酸标准液，可以通过制备标准曲线来定量样品中的乳酸浓度。

特点1：操作简单，只需要加入试剂

只需在加入细胞裂解液的细胞上清液中加入试剂，培养即可。

特点2：试剂稳定性高

可以从使用试剂盒中的乳酸标准液制作出乳酸标准曲线，然后通过标准曲线求出样品中的乳酸浓度。

当乳酸浓度在1 mmol/l以上时，可以通过稀释样品进行检测。

2-脱氧-D-葡萄糖对糖酵解的抑制作用 

1、在96孔板中接种1×10⁴个/孔的HeLa细胞(MEM培养基中含有10%胎牛血清和1%青霉素-链霉素)，在37℃，5% CO₂培养箱中过夜培养。

2、去除上清液后，在培养基中加入100 µl配制好的系列浓度的2-脱氧-D-葡萄糖溶液。

3、在37℃，5% CO₂培养箱中过夜培养。

4、培养后，吸取20 µl细胞上清液至1.5 ml微量管中，并用超纯水稀释8倍制备样品溶液，然后按照说明书的图3在每孔中加入20 µl样品溶液。

5、按照“配制乳酸标准液”的方法配制乳酸标准液。

6、在96孔板中按照说明书的图3在每孔中加入20 µl各种浓度的乳酸标准液。

7、在每孔中加入80 µl工作液。

8、在37℃培养箱中培养30 min。

9、用酶标仪测定450 nm的吸光度，并用标准曲线计算样品的乳酸浓度。

2-脱氧-D-葡萄糖对糖酵解的抑制作用，随着2-脱氧-D-葡萄糖 (一种糖酵解抑制剂)浓度的增加，乳酸浓度逐渐减少

葡萄糖和乳酸的测定例

用葡萄糖测定试剂盒（货号：G264）和乳酸测定试剂盒检测（货号：L256）:检测将葡萄糖转运蛋白抑制剂Phloretin添加到Jurkat细胞时的代谢活性变化。

■实验条件

细胞：Jurkat细胞（5×10⁵细胞）

药物：Phloretin（终浓度：100 µmol/l）

培养时间：过夜培养

■结果

Phloretin的添加抑制了葡萄糖的摄取，减少了葡萄糖的消耗，增加了培养基中葡萄糖的量，并减少了乳酸的量。

常见问题Q&A

Q：使用含有血清的培养基，可以测定培养上清液中的乳酸吗？
A：使用含有血清的培养基，可以测定培养上清液中的乳酸。
但是在含有血清的情况下，由于背景上升，需要测定培养基OD值并将其作为背景对照减去。
【参考数据】
含和不含10％FBS的吸光度比较

<结果>
在培养基中加入10％FBS的组吸光度大大升高，因此需要测定培养基作为背景对照。
Q：如何检测细胞内乳酸含量？
（1）用微量管收集1×105的细胞*1。

（2）以300×g离心2 min后去除上清液。

（3）加入300 μl的PBS，用移液器吹打使其重悬，再以300×g离心2 min后去除上清液。
（4）加入300 μl细胞裂解液*2（0.1％Triton-X）并涡旋1 min，制成细胞裂解液。

（5）以8000×g离心5 min，收集上清液。
（6）将步骤（5）所得溶液用超滤离心管（PALL，No.OD010C3，滤膜分子量：10K）以12,000×g 离心10 min*3去除蛋白质，得到待测样品。

*1、样品为HeLa细胞时，为了检测出0.02 mmol/l以上的乳酸含量，需要1×105的细胞甚至更多。
*2、如果细胞裂解液中含有SDS会抑制显色，因此不要使用含有SDS的缓冲液。

*3、内源性乳酸脱氢酶（LDH）会导致背景增高，因此通过脱蛋白处理去除内源性乳酸脱氢酶

（LDH）。
※测定样品设定为3个复孔时（n=3），合计至少需要60 μl以上（每孔20 μl×3）。
※如果过滤后滤液不足60 μl，可适当延长过滤时间。
※稀释细胞裂解液至合适的浓度，使结果在标准曲线范围内（0-1 mmol/l）。

Q：配制后的Working Solution稳定性如何，可以保存多久？
A：Working Solution需要现配现用。
光会影响Working Solution的稳定性，所以配制后请用铝箔纸包裹。
配制后的Working Solution在室温避光条件下可以保存4 h。
（Working Solution遇到光，溶液的颜色会由红色变为橙色，背景会升高。）
Q：为什么我的样品孔没有显色？
A：样品中的乳酸浓度可能低于检测限（0.02 mmol/l）。
乳酸浓度低于0.02 mmol/l的样品无法用该试剂盒检测，因此请考虑其他方法，如LC-MS。
如果待测样品被稀释，则稀释样品中含有的乳酸浓度可能低于0.02 mmol/l。
请降低稀释比例，从而将检测样品的乳酸浓度调整到最低检测限以上。
Q：是否可以检测含有还原性物质的样品？
A：如果样品中含有还原性的物质，则WST染料也会发生显色，此时无法准确定量乳酸浓度。
实验中如遇到以上情况，可以设定药物对照（不含细胞含药物的培养基+试剂），
并将标准品孔和样品孔的吸光度分别减去药物对照的吸光度。
Q：该试剂盒可以定量D-Lactate吗？
A：该试剂盒是用于L-Lactate的定量，不能定量D-Lactate。
Q：是否可以使用450 nm以外波长的滤光片进行检测？
A：也可以使用490 nm的滤光片， 但是吸光度会低于在450 nm处的吸光度。
Q：一个试剂盒可以检测样品的数量。
A：制备标准曲线和样品（n=3）时，可以检测的样品数量如下所示。

标准曲线：8个点(0, 0.0157, 0.0313, 0.0625, 0.125, 0.25, 0.5, 1 mmol/l)(n=3)

96孔板排列示意图（n=3）

参考文献

1)Metabolome analysis reveals excessive glycolysis via PI3K/AKT/mTOR and RAS/MAPK signaling in methotrexate-resistant primary CNS lymphoma-derived cells, Clin. Cancer Res., 2020, DOI:10.1158/1078-0432.

2)Serine racemase enhances growth of colorectal cancer by producing pyruvate from serine,Nat. Metab.,2020, 2(1), 81.

3)Novel pharmacological effects of poly (ADP-ribose) polymerase inhibitor rucaparib on the lactate dehydrogenase pathway, Biochem. Biophys. Res. Commun., 2019, 510, (4), 510.

4)PDH-mediated metabolic flow is critical for skeletal muscle stem cell differentiation and myotube formation during regeneration in mice, FASEB J.,2019,33,(7), 8094.

5)Tumor Cell-Derived Angiopoietin-Like Protein 2 Establishes a Preference for Glycolytic Metabolism in Lung Cancer Cells,Cancer Science, 2020,111(4):1241-1253.

6)2-Deoxy-D-glucose enhances the anti-cancer effects of idarubicin on idarubicin-resistant P388 leukemia cells, Oncol. Lett., 2020, 20(1), 962-966.