分类： Dojindo同仁化学

MitoBright LT Deep Red试剂货号：MT12

MitoBright LT Deep Red试剂货号：MT12
线粒体长效荧光探针-深红色
MitoBright LT Deep Red
商品信息
储存条件：-20度保存，避光
运输条件：室温

特点：

● 荧光持续时间长

● 可在含血清培养基中染色

● 荧光显微镜、流式细胞仪均可检测

选择规格：
20μl
400μl

产品概述

细胞内有各种各样的细胞器，承担着各种各样必须的生命活动。其中线粒体不仅是通过氧化磷酸化反应生成ATP的场所，它还与癌症、细胞衰老、阿尔兹海默症、帕金森综合症等神经退行性疾病紧密相关，因此它是细胞内最重要的细胞器之一。

在对线粒体的形态和动态进行观察以及定量检测时，通常使用小分子荧光探针标记和荧光蛋白的基因转染两种方法。荧光蛋白的基因转染存在转染效率不稳定等情况，因此操作简便的小分子荧光探针的使用更为广泛。现在市面上销售的小分子荧光探针中，多为含有氯甲基的探针，该探针存在观察时间短，染色时不能使用含血清的培养基，染色后荧光背景高等问题。MitoBright LT荧光探针克服了这些问题，可在线粒体内稳定存在一天以上，条件合适的情况下可达到一周。而且与含有氯甲基的探针相比，染色后的荧光强度更高。本品直接采用DMSO溶液包装，可快速方便的进行线粒体染色。荧光颜色有Green, Red, Deep Red等多种选择，可满足多重染色等各种各样的实验要求。

产品特点

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1.可长时间在细胞内存在

用HBSS清洗HeLa细胞后，分别用MitoBright LT和其他公司的试剂进行染色，更换含血清的培养基，培养4天后观察线粒体染色情况。其他公司的染色试剂在4天后荧光强度大幅降低，而MitoBright LT依然维持着高荧光强度，并且在染色7日后依然可以观察到荧光。

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＜检测条件＞

MitoBright LT Green 、（T公司）Green：Ex 488 nm/Em 500–560 nm

MitoBright LT Red 、（T公司）Red：Ex 561 nm/Em 560–620 nm

MitoBright LT Deep Red 、（T公司）Deep Red：Ex 640 nm/Em 650–700 nm

2.可以使用含血清培养基

用MitoBright LT和其他公司试剂，分别用含有血清和不含血清的培养基染色。其他公司试剂在含有血清的培养基染色时，荧光明显减弱，而MitoBright LT在含有血清的培养基条件下，荧光没有减弱，可明显观察到线粒体的染色情况。

image.png

实验例

实时荧光观察

HeLa细胞用CCCP处理，并与线粒体检测试剂（Mtphagy Dye）和线粒体染色试剂（MitoBright LT Green）共同染色，并经过一段时间（6小时）后进行检测。

<检测条件>

设备：LSM-700 Laser scanning confocal microscope (LSCM)

(Carl Zeiss, Oberkochen, Germany)

激发波长：

MitoBright LT Green 488 nm

Mtphagy Dye      555 nm

物镜：63x

拍摄时间：6小时

拍摄间隔：15秒

用流式细胞仪检测

1. 用RPMI培养基(10% Fetal Bovine Serum, 1% Penicillin-Streptomycin)配制Jurkat细胞悬液(3.2×105cell/ml)接种于5 cm培养皿中，在37℃，5% CO2培养箱内过夜培养。

2. 去除培养基，加入MitoBright LT Working Solution (0.1 μmol/l, 5 ml)， 在37℃培养30分钟。

3. 去除溶液，用 5 ml的PRPMI培养基清洗细胞2 次。

4. 更换RPMI培养基，持续培养细胞，每隔2 天用流式细胞仪检测。

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 MitoBright LT Green                                   MitoBright LT Red                                     MitoBright LT Deep Red

                        Excitation: 488 nm                                      Excitation: 488 nm                                     Excitation: 633 nm      

                        Emission: 515-545 nm                                Emission: 564-604 nm                               Emission: 650-670 nm

在胶原蛋白涂覆玻璃板上观察线粒体荧光成像

胶原蛋白涂覆玻璃板通常用于线粒体形态的高倍放大观察。

现有的线粒体染色试剂存在吸附胶原蛋白和升高背景的问题，但是MitoBright LT系列可以在不受背景影响的情况下清楚地对线粒体进行染色。

<染色条件>

将HeLa细胞接种在胶原蛋白涂覆玻璃板上，培养24小时，提取上清液并用HBSS洗涤。

加入100 nmol/l的MitoBright LT Green工作溶液，培养30分钟后，提取上清液并用HBSS洗涤后用荧光显微镜观察。

<检测条件>

Ex 488 nm，Em 500-560 nm

image.png

<结果>

现有的线粒体染色剂存在吸附胶原蛋白和升高背景的问题，但是MitoBright  LT系列可以清晰地对线粒体染色，而不受背景影响。

通过超分辨率激光显微镜（STED）观察线粒体内部构造

线粒体疾病致突变的Cybrid细胞用MitoBright-LT-Deep Red染色，用超分辨激光显微镜(STED)观察，证实线粒体嵴结构异常。

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＜实验条件＞

色素：MitoBrightLT Deep Red（100 nmol/l）

仪器：Leica超分辨率激光显微镜TCS SP8 STED 3X

Ex. 640 nm / Em. 650-700 nm

STED激光：775nm

 

<实验步骤>

1将细胞接种在玻璃培养皿中，培养2天（37℃，5% CO2）。

2去除培养基后，加入使用L-15培养基（含10%FBS）制备的MitoBrightLT Deep Red（100 nmol/l）工作液。

3孵育45分钟（37度，5% CO2）。

4去除上清液，用HBSS清洗两次。

5加入L-15培养基（含10%FBS），通过超分辨率激光显微镜（Leica TCS SP8 STED）进行观察。

以上数据由东京都老年学研究所衰老控制研究小组的大澤郁朗博士和藤田泰典博士友情提供。

MitoBright LT Red试剂货号：MT11
线粒体长效荧光探针-红色
MitoBright LT Red
商品信息
储存条件：-20度保存，避光
运输条件：室温
选择规格：
20μl
400μl
产品概述

细胞内有各种各样的细胞器，承担着各种各样必须的生命活动。其中线粒体不仅是通过氧化磷酸化反应生成ATP的场所，它还与癌症、细胞衰老、阿尔兹海默症、帕金森综合症等神经退行性疾病紧密相关，因此它是细胞内最重要的细胞器之一。

在对线粒体的形态和动态进行观察以及定量检测时，通常使用小分子荧光探针标记和荧光蛋白的基因转染两种方法。荧光蛋白的基因转染存在转染效率不稳定等情况，因此操作简便的小分子荧光探针的使用更为广泛。现在市面上销售的小分子荧光探针中，多为含有氯甲基的探针，该探针存在观察时间短，染色时不能使用含血清的培养基，染色后荧光背景高等问题。MitoBright LT荧光探针克服了这些问题，可在线粒体内稳定存在一天以上，条件合适的情况下可达到一周。而且与含有氯甲基的探针相比，染色后的荧光强度更高。本品直接采用DMSO溶液包装，可快速方便的进行线粒体染色。荧光颜色有Green, Red, Deep Red等多种选择，可满足多重染色等各种各样的实验要求。

产品特点

image.png

1.可长时间在细胞内存在

用HBSS清洗HeLa细胞后，分别用MitoBright LT和其他公司的试剂进行染色，更换含血清的培养基，培养4天后观察线粒体染色情况。其他公司的染色试剂在4天后荧光强度大幅降低，而MitoBright LT依然维持着高荧光强度，并且在染色7日后依然可以观察到荧光。

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＜检测条件＞

MitoBright LT Green 、（T公司）Green：Ex 488 nm/Em 500–560 nm

MitoBright LT Red 、（T公司）Red：Ex 561 nm/Em 560–620 nm

MitoBright LT Deep Red 、（T公司）Deep Red：Ex 640 nm/Em 650–700 nm

2.可以使用含血清培养基

用MitoBright LT和其他公司试剂，分别用含有血清和不含血清的培养基染色。其他公司试剂在含有血清的培养基染色时，荧光明显减弱，而MitoBright LT在含有血清的培养基条件下，荧光没有减弱，可明显观察到线粒体的染色情况。

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实验例

实时荧光观察

HeLa细胞用CCCP处理，并与线粒体检测试剂（Mtphagy Dye）和线粒体染色试剂（MitoBright LT Green）共同染色，并经过一段时间（6小时）后进行检测。

<检测条件>

设备：LSM-700 Laser scanning confocal microscope (LSCM)

(Carl Zeiss, Oberkochen, Germany)

激发波长：

MitoBright LT Green 488 nm

Mtphagy Dye      555 nm

物镜：63x

拍摄时间：6小时

拍摄间隔：15秒

用流式细胞仪检测

1. 用RPMI培养基(10% Fetal Bovine Serum, 1% Penicillin-Streptomycin)配制Jurkat细胞悬液(3.2×105cell/ml)接种于5 cm培养皿中，在37℃，5% CO2培养箱内过夜培养。

2. 去除培养基，加入MitoBright LT Working Solution (0.1 μmol/l, 5 ml)， 在37℃培养30分钟。

3. 去除溶液，用 5 ml的PRPMI培养基清洗细胞2 次。

4. 更换RPMI培养基，持续培养细胞，每隔2 天用流式细胞仪检测。

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 MitoBright LT Green                                   MitoBright LT Red                                     MitoBright LT Deep Red

                        Excitation: 488 nm                                      Excitation: 488 nm                                     Excitation: 633 nm      

                        Emission: 515-545 nm                                Emission: 564-604 nm                               Emission: 650-670 nm

在胶原蛋白涂覆玻璃板上观察线粒体荧光成像

胶原蛋白涂覆玻璃板通常用于线粒体形态的高倍放大观察。

现有的线粒体染色试剂存在吸附胶原蛋白和升高背景的问题，但是MitoBright LT系列可以在不受背景影响的情况下清楚地对线粒体进行染色。

<染色条件>

将HeLa细胞接种在胶原蛋白涂覆玻璃板上，培养24小时，提取上清液并用HBSS洗涤。

加入100 nmol/l的MitoBright LT Green工作溶液，培养30分钟后，提取上清液并用HBSS洗涤后用荧光显微镜观察。

<检测条件>

Ex 488 nm，Em 500-560 nm

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<结果>

现有的线粒体染色剂存在吸附胶原蛋白和升高背景的问题，但是MitoBright  LT系列可以清晰地对线粒体染色，而不受背景影响。

通过超分辨率激光显微镜（STED）观察线粒体内部构造

线粒体疾病致突变的Cybrid细胞用MitoBright-LT-Deep Red染色，用超分辨激光显微镜(STED)观察，证实线粒体嵴结构异常。

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＜实验条件＞

色素：MitoBrightLT Deep Red（100 nmol/l）

仪器：Leica超分辨率激光显微镜TCS SP8 STED 3X

Ex. 640 nm / Em. 650-700 nm

STED激光：775nm

<实验步骤>

1将细胞接种在玻璃培养皿中，培养2天（37℃，5% CO2）。

2去除培养基后，加入使用L-15培养基（含10%FBS）制备的MitoBrightLT Deep Red（100 nmol/l）工作液。

3孵育45分钟（37度，5% CO2）。

4去除上清液，用HBSS清洗两次。

5加入L-15培养基（含10%FBS），通过超分辨率激光显微镜（Leica TCS SP8 STED）进行观察。

以上数据由东京都老年学研究所衰老控制研究小组的大澤郁朗博士和藤田泰典博士友情提供。

产品文献

同仁化学研究所开发的线粒体长效染色荧光探针MitoBright LT系列在世界范围内广受科研人员的好评。在上市后的很短时间内，就出现了多篇使用MitoBright LT系列探针的论文，下面收集整理了部分的论文，其中红色字体标记的是使用本产品标记线粒体后，长时间(最长至5天)观察线粒体动态的报道，供感兴趣的科研人员参考。

 

产品名 检测样品 染色后的
观察时间		 检测仪器 发表期刊(含原文链接) 影响因子
MitoBright   LT Green 细胞 (U251) 立即 荧光显微镜 Pharmaceuticals 4.286
MitoBright   LT Green 酵母 (Lipomyces starkeyi) 立即 荧光显微镜 Genes to Cells 1.655
MitoBright   LT Green 细胞 (HeLa) 立即 荧光酶标仪 Biomaterials 10.317
MitoBright   LT Green 细胞 (Naive CD4+ T cells) 立即 荧光显微镜 Cell Reports 9.423
MitoBright   LT Green 细胞 (CT26) 立即 流式细胞仪 Journal of Radiation Research 2.841
MitoBright   LT Green 细胞 (C2C12) 5 天 荧光显微镜 Polymers 4.329
MitoBright   LT Green 细胞 (BMM) 36 小时 or

3 天

 荧光显微镜/
流式细胞仪		 JCI Insights 8.315
MitoBright   LT Green 细胞 (mouse erythrocytes) 立即 荧光显微镜 Front.   Cell. Infect. Microbiol. 5.293
MitoBright   LT Red 细胞 (SH-SY5Y) 立即 荧光显微镜 Free Radical Biol.   Med. 7.376
MitoBright   LT Red 细胞 (MRC-5) 立即 荧光显微镜 The   FEBS Journal 5.542
MitoBright   LT Red 细胞 (A11   cells/ P29 cells) 3 天 荧光显微镜 BMC Mol. Cell Biol. 5.293
MitoBright   LT Deep Red 细胞 (HT-1080;   MCF-10A; MCF-7; HCT-116 ) 立即 荧光显微镜 Small 13.281
MitoBright   LT Deep Red 细胞 (HT-1080;   MCF-10A; MCF-7 ) 8 小时 荧光显微镜 Advanced Therapeutics –
MitoBright   LT Deep Red 细胞 (4T1) 24 小时  荧光显微镜 Advanced Functional Materials 18.808
MitoBright   LT Deep Red 细胞 (SW982) 立即 荧光显微镜 Gene 3.368

荧光特性

MitoBright LT 染料的荧光特性

image.png

常见问题Q&A

Q1：MitoBright LT需要用DMSO溶液配制，反复冻结融化也不会影响试剂质量吗？
A1：我们已经确认可以使用冻融30次的溶液进行染色。
Q2：MitoBright LT和MitoBright的区别。
A2：MitoBright LT是MitoBright具有更强细胞内滞留性性能的产品。另外MitoBright LT是溶于DMSO的产品，可以立即使用，而无需准备染色溶液。

image.png

 

Q3：用MitoBright LT系列染色后再去极化是否会影响染色效果？
A3：我们确认了去极化和细胞种类对于染色效果的影响，MitoBright LT的每种染料都有不同程度的影响。作为参考，本公司将HeLa细胞用不同的MitoBrightLT试剂进行染色，在以下条件下进行去极化处理，观察荧光染色的变化。

<染色条件>

HeLa细胞用MitoBright LT（100 μmol/l，孵育30分钟）染色，并用HBSS洗涤。

用FCCP（100 μmol/l，孵育60分钟）处理，用HBSS洗涤2次，然后观察荧光。

image.png

 

<检测条件>

MitoBright LT Green         :Ex 488 nm/Em 500–560 nm

MitoBright LT Red            :Ex 561 nm/Em 560–620 nm

MitoBright LT Deep Red     :Ex 640 nm/Em 650–700 nm

规格性状

性状：本品是黄色液体

吸光度：0.600～0.800(490 nm附近）

MitoBright LT Green试剂货号：MT10

MitoBright LT Green试剂货号：MT10
线粒体长效荧光探针-绿色
MitoBright LT Green
商品信息
储存条件：-20度保存
选择规格：
20μl
400μl

产品概述

细胞内有各种各样的细胞器，承担着各种各样必须的生命活动。其中线粒体不仅是通过氧化磷酸化反应生成ATP的场所，它还与癌症、细胞衰老、阿尔兹海默症、帕金森综合症等神经退行性疾病紧密相关，因此它是细胞内最重要的细胞器之一。

在对线粒体的形态和动态进行观察以及定量检测时，通常使用小分子荧光探针标记和荧光蛋白的基因转染两种方法。荧光蛋白的基因转染存在转染效率不稳定等情况，因此操作简便的小分子荧光探针的使用更为广泛。现在市面上销售的小分子荧光探针中，多为含有氯甲基的探针，该探针存在观察时间短，染色时不能使用含血清的培养基，染色后荧光背景高等问题。MitoBright LT荧光探针克服了这些问题，可在线粒体内稳定存在一天以上，条件合适的情况下可达到一周。而且与含有氯甲基的探针相比，染色后的荧光强度更高。本品直接采用DMSO溶液包装，可快速方便的进行线粒体染色。荧光颜色有Green, Red, Deep Red等多种选择，可满足多重染色等各种各样的实验要求。

产品特点

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1.可长时间在细胞内存在

用HBSS清洗HeLa细胞后，分别用MitoBright LT和其他公司的试剂进行染色，更换含血清的培养基，培养4天后观察线粒体染色情况。其他公司的染色试剂在4天后荧光强度大幅降低，而MitoBright LT依然维持着高荧光强度，并且在染色7日后依然可以观察到荧光。

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＜检测条件＞

MitoBright LT Green 、（T公司）Green：Ex 488 nm/Em 500–560 nm

MitoBright LT Red 、（T公司）Red：Ex 561 nm/Em 560–620 nm

MitoBright LT Deep Red 、（T公司）Deep Red：Ex 640 nm/Em 650–700 nm

2.可以使用含血清培养基

用MitoBright LT和其他公司试剂，分别用含有血清和不含血清的培养基染色。其他公司试剂在含有血清的培养基染色时，荧光明显减弱，而MitoBright LT在含有血清的培养基条件下，荧光没有减弱，可明显观察到线粒体的染色情况。

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实验例

实时荧光观察

HeLa细胞用CCCP处理，并与线粒体检测试剂（Mtphagy Dye）和线粒体染色试剂（MitoBright LT Green）共同染色，并经过一段时间（6小时）后进行检测。

<检测条件>

设备：LSM-700 Laser scanning confocal microscope (LSCM)

(Carl Zeiss, Oberkochen, Germany)

激发波长：

MitoBright LT Green 488 nm

Mtphagy Dye      555 nm

物镜：63x

拍摄时间：6小时

拍摄间隔：15秒

用流式细胞仪检测

1. 用RPMI培养基(10% Fetal Bovine Serum, 1% Penicillin-Streptomycin)配制Jurkat细胞悬液(3.2×105cell/ml)接种于5 cm培养皿中，在37℃，5% CO2培养箱内过夜培养。

2. 去除培养基，加入MitoBright LT Working Solution (0.1 μmol/l, 5 ml)， 在37℃培养30分钟。

3. 去除溶液，用 5 ml的PRPMI培养基清洗细胞2 次。

4. 更换RPMI培养基，持续培养细胞，每隔2 天用流式细胞仪检测。

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 MitoBright LT Green                                   MitoBright LT Red                                     MitoBright LT Deep Red

                        Excitation: 488 nm                                      Excitation: 488 nm                                     Excitation: 633 nm      

                        Emission: 515-545 nm                                Emission: 564-604 nm                               Emission: 650-670 nm

在胶原蛋白涂覆玻璃板上观察线粒体荧光成像

胶原蛋白涂覆玻璃板通常用于线粒体形态的高倍放大观察。

现有的线粒体染色试剂存在吸附胶原蛋白和升高背景的问题，但是MitoBright LT系列可以在不受背景影响的情况下清楚地对线粒体进行染色。

<染色条件>

将HeLa细胞接种在胶原蛋白涂覆玻璃板上，培养24小时，提取上清液并用HBSS洗涤。

加入100 nmol/l的MitoBright LT Green工作溶液，培养30分钟后，提取上清液并用HBSS洗涤后用荧光显微镜观察。

<检测条件>

Ex 488 nm，Em 500-560 nm

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<结果>

现有的线粒体染色剂存在吸附胶原蛋白和升高背景的问题，但是MitoBright  LT系列可以清晰地对线粒体染色，而不受背景影响。

通过超分辨率激光显微镜（STED）观察线粒体内部构造

线粒体疾病致突变的Cybrid细胞用MitoBright-LT-Deep Red染色，用超分辨激光显微镜(STED)观察，证实线粒体嵴结构异常。

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＜实验条件＞

色素：MitoBrightLT Deep Red（100 nmol/l）

仪器：Leica超分辨率激光显微镜TCS SP8 STED 3X

Ex. 640 nm / Em. 650-700 nm

STED激光：775nm

<实验步骤>

1将细胞接种在玻璃培养皿中，培养2天（37℃，5% CO2）。

2去除培养基后，加入使用L-15培养基（含10%FBS）制备的MitoBrightLT Deep Red（100 nmol/l）工作液。

3孵育45分钟（37度，5% CO2）。

4去除上清液，用HBSS清洗两次。

5加入L-15培养基（含10%FBS），通过超分辨率激光显微镜（Leica TCS SP8 STED）进行观察。

以上数据由东京都老年学研究所衰老控制研究小组的大澤郁朗博士和藤田泰典博士友情提供。

产品文献

同仁化学研究所开发的线粒体长效染色荧光探针MitoBright LT系列在世界范围内广受科研人员的好评。在上市后的很短时间内，就出现了多篇使用MitoBright LT系列探针的论文，下面收集整理了部分的论文，其中红色字体标记的是使用本产品标记线粒体后，长时间(最长至5天)观察线粒体动态的报道，供感兴趣的科研人员参考。

 

产品名 检测样品 染色后的
观察时间		 检测仪器 发表期刊(含原文链接) 影响因子
MitoBright   LT Green 细胞 (U251) 立即 荧光显微镜 Pharmaceuticals 4.286
MitoBright   LT Green 酵母 (Lipomyces starkeyi) 立即 荧光显微镜 Genes to Cells 1.655
MitoBright   LT Green 细胞 (HeLa) 立即 荧光酶标仪 Biomaterials 10.317
MitoBright   LT Green 细胞 (Naive CD4+ T cells) 立即 荧光显微镜 Cell Reports 9.423
MitoBright   LT Green 细胞 (CT26) 立即 流式细胞仪 Journal of Radiation Research 2.841
MitoBright   LT Green 细胞 (C2C12) 5 天 荧光显微镜 Polymers 4.329
MitoBright   LT Green 细胞 (BMM) 36 小时 or

3 天

 荧光显微镜/
流式细胞仪		 JCI Insights 8.315
MitoBright   LT Green 细胞 (mouse erythrocytes) 立即 荧光显微镜 Front.   Cell. Infect. Microbiol. 5.293
MitoBright   LT Red 细胞 (SH-SY5Y) 立即 荧光显微镜 Free Radical Biol.   Med. 7.376
MitoBright   LT Red 细胞 (MRC-5) 立即 荧光显微镜 The   FEBS Journal 5.542
MitoBright   LT Red 细胞 (A11   cells/ P29 cells) 3 天 荧光显微镜 BMC Mol. Cell Biol. 5.293
MitoBright   LT Deep Red 细胞 (HT-1080;   MCF-10A; MCF-7; HCT-116 ) 立即 荧光显微镜 Small 13.281
MitoBright   LT Deep Red 细胞 (HT-1080;   MCF-10A; MCF-7 ) 8 小时 荧光显微镜 Advanced Therapeutics –
MitoBright   LT Deep Red 细胞 (4T1) 24 小时  荧光显微镜 Advanced Functional Materials 18.808
MitoBright   LT Deep Red 细胞 (SW982) 立即 荧光显微镜 Gene 3.368

荧光特性

MitoBright LT 染料的荧光特性

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常见问题Q&A

Q1：MitoBright LT需要用DMSO溶液配制，反复冻结融化也不会影响试剂质量吗？
A1：我们已经确认可以使用冻融30次的溶液进行染色。
Q2：MitoBright LT和MitoBright的区别。
A2：MitoBright LT是MitoBright具有更强细胞内滞留性性能的产品。另外MitoBright LT是溶于DMSO的产品，可以立即使用，而无需准备染色溶液。

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Q3：用MitoBright LT系列染色后再去极化是否会影响染色效果？
A3：我们确认了去极化和细胞种类对于染色效果的影响，MitoBright LT的每种染料都有不同程度的影响。作为参考，本公司将HeLa细胞用不同的MitoBrightLT试剂进行染色，在以下条件下进行去极化处理，观察荧光染色的变化。

<染色条件>

HeLa细胞用MitoBright LT（100 μmol/l，孵育30分钟）染色，并用HBSS洗涤。

用FCCP（100 μmol/l，孵育60分钟）处理，用HBSS洗涤2次，然后观察荧光。

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<检测条件>

MitoBright LT Green         :Ex 488 nm/Em 500–560 nm

MitoBright LT Red            :Ex 561 nm/Em 560–620 nm

MitoBright LT Deep Red     :Ex 640 nm/Em 650–700 nm

规格性状

性状：本品是黄色液体

吸光度：0.600～0.800(490 nm附近）

线粒体膜电位检测试剂盒—JC-1 MitoMP Detection Kit货号：MT09

线粒体膜电位检测试剂盒—JC-1 MitoMP Detection Kit货号：MT09
线粒体膜电位检测试剂盒
JC-1 MitoMP Detection Kit
商品信息
储存条件：0-5度保存
运输条件：室温
选择规格：
1set

试剂盒内含

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产品概述

细胞中的线粒体作为有氧呼吸产生ATP的主要场所，是体内重要的细胞器之一，常被用于早期细胞毒性、氧化应激、细胞凋亡等研究中1)。线粒体活性的降低与机能失调，已被证实与癌症、衰老、神经退行性疾病 (如阿尔兹海默症、帕金森病等) 等密切相关2)3)。

JC-1是一种被广泛使用的小分子线粒体膜电位探针，依赖于线粒体膜电位在线粒体中聚集，染料伴随聚集过程，荧光从绿色 (530 nm) 变为红色 (590 nm)。当线粒体发生去极化，红/绿荧光强度比值降低。以往的研究者反映，JC-1不易溶于水并有大量沉淀产生。但与其他公司的产品不同，同仁化学研究所研制的JC-1试剂解决了这一问题，避免了沉淀的产生。同时使用试剂盒中配制的成像缓冲液 (Imaging Buffer)，可大幅降低荧光背景并在检测过程中保护细胞不受损伤。

当JC-1工作液的浓度为2 μmol/l, 每次用量为100 μl时，可以检测500次。

产品特点

1.为什么要检测线粒体膜电位

线粒体不仅是细胞内产生能量的场所，它还与癌症、衰老、阿尔兹海默症、帕金森等神经变异性疾病密切相关。因此，针对线粒体状态的研究非常重要，其中线粒体膜电位的变化经常被作为重要的指标之一检测。

当线粒体正常、膜电位差保持不变时，JC-1会聚集并发出红色荧光，而当膜电位降低时，JC-1会作为单体存在并发出绿色荧光。红色和绿色荧光强度的变化可以作为检测线粒体状态的指标。

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2.初次使用也很容易上手

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3.去极化的检测实例

使用去极化剂carbonylcyanide-p-trifluoromethoxyphenylhydrazone（FCCP）对HeLa细胞进行处理，用本试

剂盒进行检测。可以发现与未加药物的细胞相比，加药组细胞的红色荧光明显减少。

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实验条件

JC-1浓度： 2 μmol/l in MEM, 染色时间30 min

FCCP浓度：100 μmol/l， FCCP处理时间1 h

检测条件

Green : Ex 488 nm/ Em 500-550 nm;

Red : Ex 561 nm/ Em 560-610 nm;

标尺: 20 μm

操作步骤

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实验例

1.诱导凋亡的实验例

1.1 荧光显微镜

通过荧光颜色的改变判断由凋亡导致的线粒体膜电位的变化。

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检测条件

Green: Ex 488 nm / Em 500-550 nm

Red : Ex 561 nm / Em 560-610 nm

标尺: 80 μm

1.2 流式细胞仪

定量分析单个细胞的膜电位变化

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检测条件

Green: Ex 488 nm / Em 515-545 nm

Red : Ex 488 nm / Em 564-604 nm

1.3 酶标仪

确认孔板中吸光度来判断线粒体膜电位的变化

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检测条件

Green: Ex 485 nm / Em 525-545 nm

Red : Ex 535 nm / Em 585-605 nm

2.诱导自噬的实验例

使用表达Parkin的HeLa细胞，分别使用线粒体自噬试剂盒（Mitophagy Detection Kit：MD01）和线粒体膜电位检测试剂盒（JC-1 MitoMP Detection Kit： MT09）来观察添加和不添加CCCP（羰基氰化物间氯苯）的线粒体状态的变化。

结果证明在未经CCCP处理的细胞中几乎未检测到线粒体自噬的发生，并且线粒体膜电位正常维持。 而在添加了CCCP的细胞中，证实了线粒体膜电位的降低（JC-1的红色荧光的降低）和线粒体的自噬（Mtphagy染料的荧光的增强）。

<检测条件>

线粒体自噬检测

Ex：561 nm，Em：570-700 nm

线粒体膜电位检测

绿色Ex：488 nm，Em：500-550 nm

红色Ex：561 nm，Em：560-610 nm

实验条件

1.将Parkin质粒导入HeLa细胞

使用HilyMax（货号：H357）将Parkin质粒引入HeLa细胞中（Parkin质粒/HilyMax试剂：0.1 μg/0.2 μl）

然后过夜培养，收集细胞进行以下检测。

2.自噬检测

向表达Parkin的HeLa细胞中添加0.1 μmol/l Mtphagy工作溶液，并在37°C下孵育30分钟。然后将细胞用HBSS洗涤，加入10 μg/ml CCCP/MEM溶液，并在37℃下孵育2小时。荧光显微镜下观察处理后的细胞。

3.线粒体膜电位检测

将10 μg/ml的CCCP/MEM溶液添加至表达Parkin的HeLa细胞中，并在37℃下孵育1.5小时。加入4 μmol/l的JC-1工作溶液使终浓度至2 μmol/l，并将细胞溶液在37℃下孵育30分钟。孵育后将细胞用HBSS洗涤，加入成像缓冲液，在荧光显微镜下观察细胞。

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3.线粒体膜电位与细胞周期关联性

将已知能在细胞周期的G2/M期起作用以终止细胞增殖并诱导细胞衰老的阿霉素（DOX）加入A549细胞后，

使用细胞周期检测试剂盒蓝色（产品代码：C549）/深红色（产品代码：C548）后检测。

结果证实了A549细胞的细胞周期确实发生了变化，同时用细胞衰老检测试剂盒–SPiDER-βGal（产品代码：SG03）证实了细胞产生衰老，实验证实了线粒体膜电位会发生变化。

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Lysosomal Acidic pH Detection Kit货号：L266

Lysosomal Acidic pH Detection Kit货号：L266
溶酶体pH检测试剂盒
Lysosomal Acidic pH Detection Kit
商品信息
储存条件：-80度保存
运输条件：常温

特点：

● 溶酶体特异性高

● 灵敏的检测溶酶体pH

● 试剂盒中包含溶酶体酸性化抑制剂

选择规格：
1set

产品概述

    溶酶体是常见的细胞器之一，由生物膜包裹多种分解酶组成的酸性胞内囊泡。溶酶体可以将细胞内的废物进行分解以维持细胞内各种状态的平衡。溶酶体的功能紊乱会造成或加剧包括神经退行性疾病在内的多种疾患，因此研究溶酶体对相关疾病机理的阐释及相应治疗药物的开发非常重要。

荧光探针活体染色是在研究溶酶体功能时最常用的手段，然而市面上的溶酶体荧光探针一般都存在特异性差和荧光强度随pH变化的问题。同仁化学研究所开发的试剂盒对溶酶体的特异性高并且可以灵敏的检测溶酶体的pH变化，得到更准确的检测结果。此外，由于停留性能好，该荧光探针还可用于需要长时间观察的实验。

检测溶酶体机能

本试剂盒包含两种不同的溶酶体荧光探针：荧光强度随pH变化的pHLys Red和荧光强度不随pH变化的LysoPrime Green。通过组合使用这两种染料可以同时对溶酶体的量和pH变化进行检测，全面的了解溶酶体状态。另外，试剂盒中还包含溶酶体酸性化抑制剂Bafilomycin A1，即使是第一次做相关实验的科研人员也可以轻松上手。

本试剂盒可检测的溶酶体机能指标

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荧光强度随pH变化的荧光探针pHLys Red

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荧光强度不随pH变化的荧光探针LysoPrime Green

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试剂盒内含溶酶体酸性化抑制剂

 用溶酶体酸性化抑制剂Bafilomycin A1(Baf. A1)诱导HeLa细胞后，用本试剂盒同时检测溶酶体的量和pH变化。结果显示，与对照组相比，加药组中溶酶体的pH降低，而溶酶体的量基本没有变化。

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<检测条件>

LysoPrime Green (绿):

Ex = 488 nm, Em = 490 – 550 nm

pHLys Red (红):

Ex = 561 nm, Em = 560 – 620 nm

FAQ

Q：运输温度和长期保存温度(-80℃)存在差异，是否会有问题？
A：本品虽然是常温运输，运输期间的保存温度经过测试不会对产品性能产生影响。您在收到试剂后请在-80℃下保存。

另外，本试剂需要-80℃保存的试剂是LysoPrime Green，有关不同温度下(25℃、4 ℃、

-20 ℃、 -80℃)长期保存对染色效果的影响，请参照同仁化学研究所的产品网页(货号： L261)的FAQ部分。经过测试，在室温(25℃)保存一个月不会对产品性能产生影响。
Q：实验中需要加入对溶酶体pH有影响的药物。有哪些需要注意的地方？
A：请先进行LysoPrime Green染色，再进行药物刺激。而pHLys Red的染色也请在LysoPrime Green染色后再进行。

如果使用试剂盒附带的Bafilomycin A1进行刺激的话，可以将pHLys Red working solution与Bafilomycin A1一起同时加入，或者也可以先进行pHLys Red染色，再加入Bafilomycin A1。
Q：是否可以用含血清的培养基进行染色？
A：由于LysoPrime Green会受到血清的影响，所以请使用不含血清的培养基或者HBSS配制working solution。    pHLys Red可以用含血清的培养基或者HBSS、PBS溶液来配制working solution。
Q:是否可以用一般的的荧光显微镜观察？
A：可以用一般的荧光显微镜观察，但是有个别细胞系可能无法观察。此时建议使用激光共聚焦显微镜。

pHLys Red – Lysosomal Acidic pH Detection货号：L265

pHLys Red – Lysosomal Acidic pH Detection货号：L265
溶酶体pH检测试剂Red
pHLys Red – Lysosomal Acidic pH Detection
商品信息
储存条件：冷暗处保存
运输条件：常温

特点：

 

● 溶酶体特异性高

● 高灵敏度检测溶酶体pH

● 染色后过夜仍可观察到荧光

选择规格：
1tube
3tubes
产品概述

    溶酶体是常见的细胞器之一，由生物膜包裹多种分解酶组成的酸性胞内囊泡。溶酶体可以将细胞内的废物进行分解以维持细胞内各种状态的平衡。溶酶体的功能紊乱会造成或加剧包括神经退行性疾病在内的多种疾患，因此研究溶酶体对相关疾病机理的阐释及相应治疗药物的开发非常重要。

荧光探针活体染色是在研究溶酶体功能时最常用的手段，然而市面上的溶酶体荧光探针一般都存在特异性差和荧光强度随pH变化的问题。同仁化学研究所开发的pHLys Red对溶酶体的特异性高并且可以灵敏的检测溶酶体的pH变化，得到更准确的检测结果。此外，由于停留性能好，该荧光探针还可用于需要长时间观察的实验。

高灵敏度检测溶酶体pH

现有的溶酶体pH检测试剂在准确的溶酶体定位和灵敏度方面存在一定的问题。 用低浓度溶酶体酸度抑制剂Bafilomycin A1（Baf. A1）处理的HeLa细胞用pHLys Red或现有的染料染色，并进行荧光成像。 结果显示，与现有的染料相比，pHLys Red对溶酶体pH值的变化更敏感。

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<检测条件>

pHLys Red:Ex = 561 nm, Em = 560 – 620 nm

Sensor Y/B:Ex = 561 nm, Em = 560 – 620 nm

Sensor G:Ex = 488 nm, Em = 490 – 550 nm

另外，在试管内检测各pH值下，pHLys Red的荧光强度变化。结果显示，pHLys Red在pH4.0-5.5的范围内，荧光强度变化最显著。

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溶酶体特异性高

分别使用传统溶酶体荧光探针与pHLys Red在溶酶体特异性标记物LAMP1-GFP表达的HeLa细胞中进行对比。结果可以看出，传统溶酶体荧光探针在溶酶体以外的地方也有荧光，造成背景荧光高的问题。而pHLys Red可以有效抑制背景荧光(Merged荧光图像)，展现出更高的溶酶体特异性。

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<检测条件>

Green: Ex= 488 nm, Em= 500-570 nm

Red : Ex= 561 nm, Em= 560-620 nm

溶酶体内的停留性高

pHLys Red与市面上的其他产品在相同实验条件下进行对比，其他产品在染色24小时后，荧光强度有明显的下降，而pHLys Red由于在溶酶体内的停留性能高，仍然可以维持高荧光强度。

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<检测条件>

Green: Ex= 488 nm, Em= 490-550 nm

Red: Ex= 561 nm, Em= 560-620 nm

实验例

细胞衰老所引起的溶酶体量和pH的变化

用Doxorubicin(DOX)刺激A549细胞诱导细胞衰老后，检测细胞内衰老相关β-半乳糖苷酶(SA-β-Gal)和溶酶体量与pH的变化。用细胞衰老检测试剂盒—Cellular Senescence Detection Kit – SPiDER-βGal(货号：SG03)检测细胞衰老，分别用pHLys Red和LysoPrime Deep Red(货号：L264)检测溶酶体的量和pH的变化。荧光显微镜的观察结果发现伴随着细胞衰老的发生，三个检测指标均有上升。另外，通过酶标仪的数值化的检测，也得到了相同的检测结果。

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<检测条件>

SA-βGal(绿) : Ex = 488 nm, Em = 490 – 550 nm

溶酶体pH (红) : Ex = 561 nm, Em = 560 – 620 nm

溶酶体的量(紫) : Ex = 633 nm, Em = 640 – 700 nm

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<检测条件>

SA-βGal: Ex = 525 – 535 nm, Em = 550 – 570 nm

溶酶体pH: Ex = 555 – 565 nm, Em = 590 – 610 nm

溶酶体的量: Ex = 645 – 655 nm, Em = 690 – 710 nm

FAQ

Q：是否可以培养基以外的溶液配制working solution

 
A：可以。还可以使用HBSS或PBS配制working solution。
Q：实验中需要加入对溶酶体pH有影响的药物。加入药物的时机需要在pHLys Red染色之前还是之后？
A：请在pHLys Red染色之后再进行药物刺激。由于pHLys Red可以在正常状态的溶酶体处聚集，如果先进行药物刺激导致溶酶体的pH升高到中性附近的话，pHLys Red将无法在溶酶体处聚集。因此请先染色再进行药物刺激。

 

如果使用Bafilomycin A1进行刺激的话，可以将pHLys Red working solution与Bafilomycin A1一起同时加入，或者也可以先进行pHLys Red染色，再加入Bafilomycin A1。
Q：我想同时检测溶酶体的量和pH，是否可以与LysoPrime系列共染色？
A：可以。但是请先染色LysoPrime再染色pHLys Red。
Q：可以检测的仪器和对应的滤光片有哪些？

 
A：

・激光共聚焦显微镜

Ex = 561 nm, Em= 560-620 nm

 

・普通荧光显微镜

TxRed Filter

Ex = 540 – 580 nm, Em: 590 – 670 nm

 

・荧光酶标仪

Ex = 555 – 565 nm, Em = 590 – 610 nm
Q: 在摸索最佳染色条件时，pHLys Red的浓度为多少比较合适？
A：推荐1000倍稀释pHLys Red。如果需要摸索最佳实验条件，请参考下列范围。<如果发现荧光较弱>

请在250-500倍稀释范围内进行摸索。

LysoPrime Deep Red – High Specificity and pH Resistance货号：L264

LysoPrime Deep Red – High Specificity and pH Resistance货号：L264
溶酶体染色试剂Deep Red
LysoPrime Deep Red – High Specificity and pH Resistance
商品信息
储存条件：-20℃避光保存
运输条件：常温

特点：

● 溶酶体特异性高

● 不易受溶酶体pH值变化的影响

● 染色后过夜仍可观察到荧光

选择规格：
1tube
3tubes

产品概述

   溶酶体是常见的细胞器之一，由生物膜包裹多种分解酶组成的酸性胞内囊泡。溶酶体可以将细胞内的废物进行分解以维持细胞内各种状态的平衡。溶酶体的功能紊乱会造成或加剧包括神经退行性疾病在内的多种疾患，因此研究溶酶体对相关疾病机理的阐释及相应治疗药物的开发非常重要。

荧光探针活体染色是在研究溶酶体功能时最常用的手段，然而市面上的溶酶体荧光探针一般都存在特异性差和荧光强度随pH变化的问题。同仁化学研究所开发的LysoPrime Deep Red荧光探针对溶酶体具有高度特异性，并且不易受pH值变化的影响，因此可以更准确的对溶酶体进行研究。另外，由于其细胞内的滞留能力强，还适用于需要长期荧光观察的实验。

溶酶体特异性高

分别使用传统溶酶体荧光探针与LysoPrime Deep Red在溶酶体特异性标记物LAMP1-GFP表达的HeLa细胞中进行对比。结果可以看出，传统溶酶体荧光探针在溶酶体以外的地方也有荧光，造成背景荧光高的问题。而LysoPrime Deep Red可以有效抑制背景荧光(Merged荧光图像)，展现出更高的溶酶体特异性。

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<检测条件>

Green: Ex= 488 nm, Em= 500-570 nm

Deep Red : Ex= 633 nm, Em= 640-700 nm

不易受溶酶体pH变化影响

LysoPrime Deep Red与市面上的其他产品都是在溶酶体集聚的荧光染料。然而随着溶酶体酸性抑制剂Bafilomycin A1的作用，溶酶体pH由酸性向中性变化的过程中，其他产品逐渐离开溶酶体，荧光信号也显著下降。而LysoPrime Deep Red却可以继续保持在溶酶体内，荧光强度几乎不变，与其他产品的荧光减弱形成鲜明的对比。

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＜检测条件＞

Deep Red: Ex= 633 nm, Em= 640-700 nm

Red: Ex= 561 nm, Em= 560-620 nm

溶酶体内的停留性高

LysoPrime Deep Red与市面上的其他产品在相同实验条件下进行对比，其他产品在染色24小时后，荧光强度有明显的下降，而LysoPrime Deep Red由于在溶酶体内的停留性能高，仍然可以维持高荧光强度。

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<检测条件>

Deep Red: Ex= 633 nm, Em= 640-700 nm

Green: Ex= 488 nm, Em= 490-550 nm

Red: Ex= 561 nm, Em= 560-620 nm

实验例

细胞衰老所引起的溶酶体量和pH的变化

用Doxorubicin(DOX)刺激A549细胞诱导细胞衰老后，检测细胞内衰老相关β-半乳糖苷酶(SA-β-Gal)和溶酶体量与pH的变化。用细胞衰老检测试剂盒—Cellular Senescence Detection Kit – SPiDER-βGal(货号：SG03)检测细胞衰老，分别用LysoPrime Deep Red和pHLys Red(货号：L265)检测溶酶体的量和pH的变化。荧光显微镜的观察结果发现伴随着细胞衰老的发生，三个检测指标均有上升。另外，通过酶标仪的数值化的检测，也得到了相同的检测结果。

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<检测条件>

SA-βGal(绿):

Ex = 488 nm, Em = 490 – 550 nm

溶酶体pH (红):

Ex = 561 nm, Em = 560 – 620 nm

溶酶体的量(紫):

Ex = 633 nm, Em = 640 – 700 nm

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<检测条件>

SA-βGal: Ex = 525 – 535 nm, Em = 550 – 570 nm

溶酶体pH: Ex = 555 – 565 nm, Em = 590 – 610 nm

溶酶体的量: Ex = 645 – 655 nm, Em = 690 – 710 nm

FAQ

Q：是否可以用含有血清的培养基进行染色？
A：由于血清会对LysoPrime Deep Red产生影响，因此不能用含有血清的培养基染色。另外，除了无血清培养基以外，还可以用HBSS溶液配制working solution。
Q：实验中需要加入对溶酶体pH有影响的药物。加入药物的时机需要在LysoPrime Deep Red染色之前还是之后？
A：请在LysoPrime Deep Red染色之后再进行药物刺激。LysoPrime Deep Red在溶酶体处积蓄后，即使溶酶体的pH发生变化，仍可停留在溶酶体处。但是，如果先进行药物刺激，溶酶体的pH接近中性的话， LysoPrime Deep Red将无法在溶媒体处聚集。因此，请先进行LysoPrime Deep Red的染色，再进行药物刺激
Q：我想同时检测溶酶体的量和pH，是否可以与pHLys Red共染色？
A：可以。但是请先染色LysoPrime Deep Red再染色pHLys Red
Q：可以检测的仪器和对应的滤光片有哪些？
A：・激光共聚焦显微镜

Ex = 633 nm, Em= 640-700 nm

・普通荧光显微镜

Cy5 Filter

Ex = 590 – 650 nm, Em= 660 – 740 nm

・荧光酶标仪

Ex = 645 – 655 nm, Em= 690 – 710 nm
Q: 在摸索最佳染色条件时，LysoPrime Deep Red的浓度为多少比较合适？
A：推荐1000倍稀释LysoPrime Deep Red。如果需要摸索最佳实验条件，请参考下列范围。<如果发现荧光背景高>

请在2000-5000倍稀释范围内进行摸索。

LysoPrime Green – High Specificity and pH Resistance货号：L261

LysoPrime Green – High Specificity and pH Resistance货号：L261
溶酶体染色试剂Green
LysoPrime Green – High Specificity and pH Resistance
商品信息
储存条件：封入氮气后-80度保存
运输条件：常温

特点：

● 溶酶体特异性高

● 不易受溶酶体pH值变化的影响

● 染色后过夜仍可观察到荧光

选择规格：
10ul
10ul*3
规格性状

<可检测样品数>

每10 μl大约可检测10块35 mm dish或10块 μ-Slide 8 well Chamber Slides。

<保存上的注意事项>

● 长时间保存时，最理想的状态是封入氮气后-80℃保存。

● 本产品在冷冻(-20 ℃)条件下保存也会随时间缓慢变质。

如果没有-80℃的保存条件，建议尽早使用。

● 反复冻融易引发变质，应极力避免。

产品概述

   溶酶体是常见的细胞器之一，由生物膜包裹多种分解酶组成的酸性胞内囊泡。溶酶体可以将细胞内的废物进行分解以维持细胞内各种状态的平衡。溶酶体的功能紊乱会造成或加剧包括神经退行性疾病在内的多种疾患，因此研究溶酶体对相关疾病机理的阐释及相应治疗药物的开发非常重要。

荧光探针活体染色是在研究溶酶体功能时最常用的手段，然而市面上的溶酶体荧光探针一般都存在特异性差和荧光强度随pH变化的问题。同仁化学研究所开发的LysoPrime Green荧光探针对溶酶体具有高度特异性，并且不易受pH值变化的影响，因此可以更准确的对溶酶体进行研究。另外，由于其细胞内的滞留能力强，还适用于需要长期荧光观察的实验。

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溶酶体特异性高

使用LysoPrime Green(本产品)与市面上其他的溶酶体染料进行对比，并用溶酶体标记蛋白LAMP1-RFP表达的HeLa细胞进行验证。结果发现，其他产品在溶酶体以外的部位也有荧光，导致背景高。而LysoPrime Green的荧光背景受到有效控制(荧光图像Merged)。另外，在荧光图像的范围内检测荧光强度发现，LysoPrime Green比其他试剂的溶酶体染色部位的重合度更高。

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不易受溶酶体pH变化

LysoPrime Green(本产品)与市面上的其他产品都是在溶酶体集聚的荧光染料。然而随着溶酶体酸性抑制剂的Bafilomycin A1的作用，溶酶体pH由酸性向中性变化的过程中，其他产品逐渐离开溶酶体，荧光信号也显著下降。而LysoPrime Green却可以继续保持在溶酶体内，荧光强度几乎不变，与其他产品的荧光减弱形成鲜明的对比。

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溶酶体内的停留性高

LysoPrime Green(本产品)与市面上的其他产品在相同实验条件下进行对比，其他产品在染色90分钟后，荧光强度有明显的下降，而LysoPrime Green由于在溶酶体内的停留性能高，仍然可以维持高荧光强度。

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此外，LysoPrime Green和其他产品染色HeLa细胞后，上流式细胞仪检测的结果发现，与“先胰酶消化再染色”的结果相比，其他产品的“先染色再胰酶消化”的结果的荧光强度有明显下降，而LysoPrime Green的胰酶处理前后的染色结果相差很小，说明LysoPrime Green的停留性能更强。

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<检测条件>

Filter: FITC (Ex = 488 nm, Em = 515-545 nm)

实验例

用LysoPrime Green与LysoTrakcerTM Red同时对HeLa细胞染色后，用溶酶体抑制剂Bafilomycin A1处理后进行荧光观察。LysoPrime Green的荧光强度不受Bafilomycin A1作用的影响，而LysoTrackerTM Red的荧光强度伴随着BafilomycinA1的作用而不断降低。同时使用这两种试剂一起染色，使得溶酶体位置与pH变化的同时检测成为可能。另外，通过荧光酶标仪检测的话，还可以得到数值化的检测结果。

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检测例1

将外泌体染料ExoSparkler Exosome Membrane Labeling Kit-Deep Red(货号:EX03)染色后的外泌体加至LysoPrime Green染色的HeLa细胞。随着时间的推进，LysoPrime Green的荧光强度维持不变，而ExoSparkler Deep Red的荧光强度随时间不断增强(左图)。另外，通过添加可以抑制内体向溶酶体转变的抑制剂Bafilomycin A1，与未经抑制剂处理的Control组相比，Bafilomycin A1抑制组的细胞中没有ExoSparkler Deep Red的荧光，说明Bafilomycin A1的添加有效抑制了内体的成熟(右图)。

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检测例2

用细胞自噬检测试剂DAPRed-Autophagy Detection(货号：D677)与LysoPrime Green或其他公司产品共染色HeLa细胞，经氨基酸饥饿处理后检测荧光。由于其他公司产品的荧光强度弱，无法长时间的对溶酶体荧光观察，而LysoPrime Green的荧光强度更高并且可以长时间染色，因此，与DAPRed的共染色结果，可以更准确的检测细胞自噬。

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检测例3

用线粒体自噬检测试剂盒Mitophagy Detection Kit(货号：MD01)与LysoPrime Green或其他公司产品共染色SHSY-5Y细胞，经线粒体自噬诱导后检测荧光。由于其他公司产品的荧光强度弱，无法长时间的对溶酶体荧光观察，而LysoPrime Green的荧光强度更高并且可以长时间染色，因此，与Mtphagy Dye的共染色结果，可以更准确的检测线粒体自噬。

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FAQ

Q：运输温度和保存温度(-80℃)不同是否会对产品性能有影响？
A：本品虽然是常温运输，但是在运输过程中并不会产生对产品性能有影响的变质。请您收到产品后立即-80℃保存。同仁化学研究所经检测确认在常温(25℃)下保存一个月，并不会对产品的性能有影响。

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Q：染色后似乎有溶酶体以外的部位也被染色的情况出现？
A：有可能是LysoPrime Green与细胞核或其他细胞器的非特异性吸附造成的。LysoPrime Green的最佳染色浓度与细胞种类及细胞密度有关，在配制Working solution的时候建议在1,000倍-4,000倍稀释的范围内进行摸索。作为参考，下图是染色HeLa细胞时，分别用1,000倍、2,000倍、4,000倍稀释后的染色结果，其中1,000倍稀释时的结果有观察到非特异性吸附。

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Q：可以用含血清的培养基染色吗？
A：不可以，LysoPrime Green会受血清的影响，请务必使用HBSS或无血清培养基等不含血清的溶液配制working solution。
Q：实验需要用对溶酶体pH值有影响的药物进行刺激，此时先刺激再染色还是先染色再刺激比较合适？
A：推荐先染色再刺激。LysoPrime Green是根据pH值集聚在溶酶体的，在溶酶体处聚集后，即使pH值再变化也会继续停留在溶酶体处。如果先用药物刺激导致溶酶体pH呈中性，会导致LysoPrime Green无法在溶酶体处聚集，因此建议先染色再刺激。
Q：是否可以用一般的荧光显微镜观察？
A：可以用一般的荧光显微镜观察，但是有个别细胞系可能无法观察。此时建议使用激光共聚焦显微镜。

SulfoBiotics- Sodium Polysulfide Set货号：SB13

SulfoBiotics- Sodium Polysulfide Set货号：SB13
SulfoBiotics- Sodium Polysulfide Set
SulfoBiotics- Sodium Polysulfide Set
商品信息
储存条件：4度
运输条件：常温运输
选择规格：
100mg*3

产品包装

Sodium disulfide (Na2S2)  100 mg× 1

Sodium trisulfide (Na2S3)  100 mg× 1

Sodium tetrasulfide (Na2S4)  100 mg× 1

产品概述

最近的研究发现，过硫化物(Persulfide)和多硫化物(Polysulfide)等硫烷硫(Sulfane Sulfur)是生物体内的一种新型信号分子。这一类活性硫烷硫分子可以通过硫化氢释放和储存，并且与蛋白质的硫醇(Thiol)为目标的一系列信号传递(如蛋白质的巯基化等)密切相关，因此受到了广泛关注。不仅如此，过硫化物和多硫化物的还原性甚至高于半胱氨酸(Cysteine)和谷胱甘肽(Glutathione)等生物体内常见的具有还原性的物质，对维持体内的氧化还原平衡也非常重要。

Sodium polysulfide (Na2Sn)是诸多硫烷硫供体中结构最简单的一种，它在水溶液中可以随着pH的变化生成拥有多种结构的多硫化氢(Hydrogen Polysulfide, H2Sn, n≥2)。本产品是专门用于研究过硫化物、多硫化物等活性硫烷硫分子在生物体内相关通路中作用的试剂。

生物体内存在含硫烷硫分子的种类

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※生物体内含有硫烷硫的分子种类会随氧化还原而发生变化。

Sodium polysulfide的构造

供体 Sodium disulfide(Na2S) Sodium trisukfide(Na2S3) Sodium tetrasulfide(Na2S4)
构造 Na+-S-S–Na+ Na+-S-S-S-Na+ Na+-S-S-S–Na+
PKa1 5 4.2 3.8
pKa2 9.7 7.5 6.3
货号 SB02 SB03 SB04

 

※pKa值请参考下面文献：

J. Gun et al., “Electrospray Ionization Mass Spectrometric Analysis of Aqueous Polysulfide Solutions”, Microchim. Acta, 2004, 146, 229

-SulfoBiotics- Sodium tetrasulfide (Na2S4)货号：SB04

-SulfoBiotics- Sodium tetrasulfide (Na2S4)货号：SB04
Sodium disulfide, anhydrous
CAS号：12034-39-8
商品信息
储存条件：4度
运输条件：常温运输
分子量：

174.22

100mg*5

性状： 本产品是黄色~黄褐色固体粉末

纯度：90.0%以上

 

保存条件：避光冷藏；操作时注意防止吸湿

产品概述

最近的研究发现，过硫化物(Persulfide)和多硫化物(Polysulfide)等硫烷硫(Sulfane Sulfur)是生物体内的一种新型信号分子。这一类活性硫烷硫分子可以通过硫化氢释放和储存，并且与蛋白质的硫醇(Thiol)为目标的一系列信号传递(如蛋白质的巯基化等)密切相关，因此受到了广泛关注。不仅如此，过硫化物和多硫化物的还原性甚至高于半胱氨酸(Cysteine)和谷胱甘肽(Glutathione)等生物体内常见的具有还原性的物质，对维持体内的氧化还原平衡也非常重要。

Sodium polysulfide (Na2Sn)是诸多硫烷硫供体中结构最简单的一种，它在水溶液中可以随着pH的变化生成拥有多种结构的多硫化氢(Hydrogen Polysulfide, H2Sn, n≥2)。本产品是专门用于研究过硫化物、多硫化物等活性硫烷硫分子在生物体内相关通路中作用的试剂。

生物体内存在含硫烷硫分子的种类

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※生物体内含有硫烷硫的分子种类会随氧化还原而发生变化。

Sodium polysulfide的构造

供体 Sodium disulfide(Na2S) Sodium trisukfide(Na2S3) Sodium tetrasulfide(Na2S4)
构造 Na+-S-S–Na+ Na+-S-S-S-Na+ Na+-S-S-S–Na+
PKa1 5 4.2 3.8
pKa2 9.7 7.5 6.3
货号 SB02 SB03 SB04

 

※pKa值请参考下面文献：

J. Gun et al., “Electrospray Ionization Mass Spectrometric Analysis of Aqueous Polysulfide Solutions”, Microchim. Acta, 2004, 146, 229

-SulfoBiotics- Sodium trisulfide (Na2S3)货号：SB03

-SulfoBiotics- Sodium trisulfide (Na2S3)货号：SB03
Sodium trisulfide, anhydrous
CAS号：37488-76-9
商品信息
储存条件：4度
运输条件：常温运输
分子量：142.16
选择规格：
100mg*5

性状： 本产品是黄色~黄褐色固体粉末

纯度：90.0%以上

保存条件：避光冷藏；操作时注意防止吸湿

产品概述

最近的研究发现，过硫化物(Persulfide)和多硫化物(Polysulfide)等硫烷硫(Sulfane Sulfur)是生物体内的一种新型信号分子。这一类活性硫烷硫分子可以通过硫化氢释放和储存，并且与蛋白质的硫醇(Thiol)为目标的一系列信号传递(如蛋白质的巯基化等)密切相关，因此受到了广泛关注。不仅如此，过硫化物和多硫化物的还原性甚至高于半胱氨酸(Cysteine)和谷胱甘肽(Glutathione)等生物体内常见的具有还原性的物质，对维持体内的氧化还原平衡也非常重要。

Sodium polysulfide (Na2Sn)是诸多硫烷硫供体中结构最简单的一种，它在水溶液中可以随着pH的变化生成拥有多种结构的多硫化氢(Hydrogen Polysulfide, H2Sn, n≥2)。本产品是专门用于研究过硫化物、多硫化物等活性硫烷硫分子在生物体内相关通路中作用的试剂。

生物体内存在含硫烷硫分子的种类

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※生物体内含有硫烷硫的分子种类会随氧化还原而发生变化。

Sodium polysulfide的构造

供体 Sodium disulfide(Na2S) Sodium trisukfide(Na2S3) Sodium tetrasulfide(Na2S4)
构造 Na+-S-S–Na+ Na+-S-S-S-Na+ Na+-S-S-S–Na+
PKa1 5 4.2 3.8
pKa2 9.7 7.5 6.3
货号 SB02 SB03 SB04

SulfoBiotics- HSip-1试剂货号：SB21

SulfoBiotics- HSip-1试剂货号：SB21
N-​[3′,​6′-Dihydroxy-​3-​oxo-3H-spiro(isobenzofur​an-​1,​9′-​xanthen)-​5-​yl]​-​(1,​4,​7,​10-​tetraazacyclododecan​e-​1-​acetamide-​κN1, κN4, κN7, κN10) ​copper(2+) sulfate
CAS号：1346220-52-7(free base)
商品信息
储存条件：在冷暗处保存
运输条件：室温

分子式：

C30H33CuN5O10S

分子量：

719.22

选择规格：
1mg

 

性状：                          本品为褐色固体

纯度（HPLC）：           90%以上

处理条件

保存方法：                    0~5°C

产品概述

硫化氢 (H2S) 在舒张血管，保护细胞和调节胰岛素分泌方面具有重要的生理作用已经得到广泛的认可。 H2S被认为是一种类似于NO和CO的气体信号分子，但在生理条件下大约80％的H2S是以HS-的状态存在的 (pKa=7)。HS- 很容易转变为各种过硫化物和多硫化物。 -SulfoBiotics- HSip-1 是一种新的特异性检测H2S的荧光探针，当和H2S反应时会发出较强的绿色荧光。 -SulfoBiotics- HSip-1 DA可以穿透细胞膜检测细胞内的H2S。

检测原理

硫化氢 (H2S) 在舒张血管，保护细胞和调节胰岛素分泌方面具有重要的生理作用已经得到广泛的认可。

H2S被认为是一种类似于NO和CO的气体信号分子，但在生理条件下大约80％的H2S是以HS–的状态存在的(pKa=7)。

HS-很容易转变为各种过硫化物和多硫化物。

-SulfoBiotics- HSip-1 是一种新的特异性检测H2S的荧光探针，当和H2S反应时会发出较强的绿色荧光。

-SulfoBiotics- HSip-1 DA可以穿透细胞膜检测细胞内的H2S。

溶解比例

制备10 mmol/l HSip-1储存液，加117 ul超纯水至含有1 mg HSip-1的管子中，用移液器吹打溶解。

*配制好的溶液请在-20℃保存，可以保存1个月。

荧光参数

Ex： 470 ～ 500 nm

Em：500 ～ 550 nm

SB21 荧光土偶.jpg

实验案例

一. 用HSip-1检测硫化氢

1. 用PBS稀释10 mmol/l HSip-1储存液，制成200 umol/l的 HSip-1工作液。

2. 用1 ml 充氮处理过的超纯水溶解7.8 mg Na2S制成 100 mmol/l Na2S溶液。

3. 吸取20 ul 100 mmol/l 的Na2S溶液至980 ul超纯水中，制成2 mmol/l 的Na2S溶液。

4. 吸取100 ul 2 mmol/l 的Na2S溶液至900 ul超纯水中，制成200 umol/l 的Na2S溶液。

5. 用超纯水稀释200 umol/l 的Na2S溶液，制成一个系列浓度的 (200 umol/l, 100 umol/l,

50 umol/l, 25 umol/l, 12.5 umol/l, 6.3 umol/l, 3.2 umol/l, 0 umol/l) 的Na2S标准溶液。

6. 吸取350 ul 200 umol/l的 HSip-1工作液至300 ul的Na2S溶液中，并用涡旋振荡器振荡混匀。

7. 上述溶液在室温培养30 min后，转移至96孔板中 (200 ul/孔)。

8. 用荧光酶标仪测定在516 nm (ex=491 nm)的荧光强度。

SulfoBiotics- Sulfide dibimane试剂货号：SB15

SulfoBiotics- Sulfide dibimane试剂货号：SB15
Bis(2,5,6-trimethylpyrazolo[1,2-a]pyrazole-1,7-dione-3-ylmethyl)sulfide
CAS号：1392113-30-2
商品信息
储存条件：0-5度保存
运输条件：室温
分子式：

C20H22N4O4S

分子量：

414.48

特点：

● HPLC的方法检测H2S

● 灵敏度高

选择规格：
10 nmol*5

产品性状

规格

性状：                          本品为无色或淡黄色固体

纯度（HPLC）：           97%以上

含量               ：           0.540~0.600（370nm）

处理条件

保存方法：                   避光冷藏

产品概述

硫化氢 (H2S) 在舒张血管，保护细胞和调节胰岛素分泌方面具有重要的生理作用已经得到广泛的认可。H2S被认为是一种除了NO和CO以外的第三种气体信号分子，在生理状态下大约80％的硫化氢解离为HS–(pKa=7.0)。Monobromobimane (简称mBBr) 法是硫化氢检测最灵敏和可靠的方法之一。1个分子的H2S可以与2个分子的mBBr反应生成1个分子的Sulfide dibimane.采用高效液相色谱法 (HPLC)可以分析谷胱甘肽或半胱氨酸和mBBr反应生成的Sulfide dibimane， 由于它可以发出荧光，所以检测的灵敏度较高1),2),3)。

检测原理

硫化氢 (H2S) 在舒张血管，保护细胞和调节胰岛素分泌方面具有重要的生理作用已经得到广泛的认可。H2S被认为是一种除了NO和CO以外的第三种气体信号分子，在生理状态下大约80％的硫化氢解离为HS–(pKa=7.0)。Monobromobimane (简称mBBr) 法是硫化氢检测最灵敏和可靠的方法之一。1个分子的H2S可以与2个分子的mBBr反应生成1个分子的Sulfide dibimane 。采用高效液相色谱法 (HPLC)可以分析谷胱甘肽或半胱氨酸和mBBr反应生成的Sulfide dibimane， 由于它可以发出荧光，所以检测的灵敏度较高。

SB15 结构式 .jpg

实验案例

HPLC实验例

样品的预处理

1. 吸取30 ul样品至含有70 ul 100 mmol/l Tris-HCl缓冲液 (pH 9.5,0.1 mmol/l DTPA) 的管子中。

2. 加入50 ul 10 mmol/l的mBBr乙腈溶液。

3. 培养30 min。

4. 加入50 ul 200 mmol/l的 5-磺基水杨酸。

5. 取上清液作为检测样品。

* 有关mBBr法的详细情况，请参见Methods Enzymol.，2015，554，314)。

硫化氢的定量分析

6. 加入100 ul乙腈至含有10 nmol Sulfide dibimane的管子中，用移液器吹打使溶解，制成0.1 mmol/l 的Sulfide dibimane储存液。

7. 用乙腈稀释0.1 mmol/l Sulfide dibimane储存液，稀释成一个系列浓度梯度的溶液。

8. 吸取上述系列浓度梯度的溶液各5 ul注射入HPLC色谱柱，制成一条标准曲线 (下图)。

9. 通过HPLC分析样品 ，计算Sulfide dibimane的峰面积。

10. 用标准曲线计算样品中HS–的浓度。

注意：Sulfide dibimane溶液对光敏感，请避光并在一天内用完。

＜HPLC条件＞

柱：Inersil ODS-3

流动相：A) 0.1% TFA/H2O ，

B) 0.1% TFA/Acetonitrile (TFA: Trifluoroacetic acid) B conc.：

5%-35% (0-5 min)，

35%-55% (5-16 min)，

55%-70% (16-23 min)

检测：荧光 (Ex: 390 nm, Em: 475 nm)

流速：1 ml/min

柱温：40℃

SB15 标准曲线.jpg

单线态氧检测（EPR）—TEMP货号：T511

单线态氧检测（EPR）—TEMP货号：T511
2,2,6,6-Tetramethyl-4-piperidone hydrochloride(TEMP)
TEMP
商品信息
储存条件：室温
运输条件：室温

特点：

•纯度高

•杂质峰少

•灵敏度高

选择规格：
5g

凑单关联产品TOP5

NO.1.    DMPO    超氧阴离子和羟自由基检测   

NO.2.    BMPO    超氧阴离子和羟自由基检测

NO.3.    ROS Assay Kit -Highly Sensitive DCFH-DA-    ROS检测

NO.4.    Calcein-AM/PI Double Staining Kit    活死细胞双染

NO.5.    Cell Counting Kit-8    细胞增殖毒性检测

 

产品概述

单线态氧 (Singlet Oxygen，1O2) 即激发态氧分子，是一种具有强氧化性的活性氧 (ROS)，在环境、化学、生物、医学等学科中具有重要的研究价值。在众多检测手段中，电子顺磁共振 (EPR) 公认为选择性最好，灵敏度最高的方法。

单线态氧分子和捕获剂TEMP本身呈EPR沉默 (EPR-silent)，TEMP捕获单线态氧后，可形成稳定的氮氧自由基TEMPO，通过对TEMPO的EPR信号分析并结合反应进程，可获知单线态氧的生成的速率和浓度变化。

产品特点

同仁化学研究所 (DOJINDO) 研发的TEMP(2,2,6,6-四甲基-4-哌啶酮 盐酸盐)，保持了一贯的高品质、高稳定性捕获剂的产品特点。TEMP基线无TEMPO的干扰EPR信号，稳定性更好。同时盐酸盐结构增强了捕获剂的水溶性，避免沉淀的析出。

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实验例

使用光敏剂Rose Benga (1 mM) 光照后，检测单线态氧。TEMP终浓度100 mM，PBS缓冲液 (PH 7.5) 中进行检测。

备注：

① 由于跃迁高度禁阻，基态氧分子吸收光不能直接产生1O2，可以通过光敏化法、微波放电法和化学方法得到。

② PBS缓冲液可更换为纯水等其他溶剂，实验者可根据实验设计自行选择。

③如信号较弱，可调节PH至8.5-9.5，以提高TEMPO的稳定性，使信号加强。

 

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关联产品

超氧阴离子和羟自由基检测（EPR）—DMPO
5,5-二甲基-1-吡咯啉-N-氧化物
超氧阴离子和羟自由基检测（EPR）—BMPO
5-tert-Butoxycarbonyl-5-methyl-1-pyrroline-N-oxide

超氧阴离子和羟自由基检测（EPR）—BMPO货号：B568

超氧阴离子和羟自由基检测（EPR）—BMPO货号：B568
5-tert-Butoxycarbonyl-5-methyl-1-pyrroline-N-oxide
BMPO
商品信息
储存条件：-20度保存，防潮
运输条件：室温
分子式：

C10H17NO3

分子量：

199.25

特点：

•纯度高

•杂质峰少

•灵敏度高

选择规格：
50mg

 

凑单关联产品TOP5

NO.1.    DMPO    超氧阴离子和羟自由基检测

NO.2.    TEMP    单线态氧检测

NO.3.    Calcein-AM/PI Double Staining Kit    活死细胞双染

NO.4.    ROS Assay Kit    活性氧检测

NO.5.    Annexin V, FITC Apoptosis Detection Kit    细胞凋亡检测

 

产品概述

自旋捕捉技术是当今检测和鉴别不稳定自由基的最可靠的手段之一。顺磁共振波谱 (EPR) 捕捉剂能够成功的检测体内或体外生成的超氧自由基和羟自由基等。

BMPO是同仁化学研究所 (DOJINDO) 自主开发生产的新型高效、高稳定型自由基捕捉剂。它在捕捉自由基能力上优于PBN、DMPO等一般捕获剂，与自由基的结合能力更强，半衰期 (t½=23 min) 更长，ESR谱图能够明显的区别不同的自由基结构如：GS•和•OH。BMPO检测结果可靠性高、重复性强。由于具有高水溶性的特点，更利于水相体系自由基的研究，尤其是生物体系的自由基研究。

应用

自旋捕获剂，EPR（ESR）检测，超氧阴离子，羟基自由基

产品特点

•半衰期长，可检测自由基加合物

•高水溶性

•更高的信噪比

化学结构式

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操作步骤

常规检测步骤 (*本数据仅供参考，具体参数可能因仪器厂家的不同而适当调整)

检测芬顿 (Fenton) 反应所产生的羟自由基：

1. 将1.5 mg的BMPO溶解于5 ml的超纯水。

2. 取15 μl的BMPO溶液，75 μl的1 mM的H2O2和75 μl的100 μM的FeSO4加入到50 μl的超纯水中。

3. 放置一段时间 (例如1 min) 将溶液转入EPR样品管中检测。

4. 通过峰值计算相对强度。

检测黄嘌呤和黄嘌呤氧化酶体系 (XO) 所产生的超氧自由基：

1. 溶液A：将1 mg的BMPO溶解于1 ml的浓度为50 mM的PBS溶液 (pH 7.4)。

2. 溶液B：用50 mM的PBS溶液 (pH 7.4) 配制含有1 mMDTPA和0.4 mM黄嘌呤的混合溶液。

3. 溶液C：用50 mM的PBS溶液 (pH 7.4) 配制含有0.1 U/ml的黄嘌呤氧化酶溶液。

4. 取15 μl溶液A，135 μl溶液B和10 μl溶液C混合。

5. 放置一段时间 (例如 8 min) 将溶液转入EPR样品管中检测。

6. 通过峰值计算相对强度。

实验例

(*本数据仅供参考，具体参数可能因仪器厂家的不同而适当调整)

*本数据均由Bruker公司EPR仪器检测得出，由于BMPO的分子结构在平面上下差异较大，使得图中BMPO/•OH的两种异构体的超精细结构常数较大能够被ESR分辨出来。本实验中BMPO/•OH的两种立体异构体与BMPO/•OOH的构成相似，两种BMPO结合物的适宜条件为：

构象异构体 (conformer)Ⅰ：

aN =13.47 G，aH

aHβ=15.31 G，aH

aHγ1 = 0.62 G

构象异构体 (conformer)Ⅱ：

aN =13.56 G，aH

aHβ=12.3 G，aH

aHγ1 = 0.66 G

超氧化物检测操作流程

1. 用100 mM的PBS溶液 (pH 7.4) 制备浓度为25 μM的DTPA，作为过渡金属螯合剂。

2. 用100 mM PBS (pH 7.4)配制1 mM次黄嘌呤溶液。

3. 配制1 U/ml的黄嘌呤氧化酶溶液。

4. 将10 mg的BMPO溶于200 μl的PBS溶液中。(终浓度约为 250 mM)。

5. 向EP管中加入70 μl缓冲液。

6. 继续添加20 μl浓度为250 mM的BMPO和100 μl步骤2中准备的1 mM的次黄嘌呤溶液。

7. 加入10 μl黄嘌呤氧化酶触发反应，将EP管漩涡震荡后转移到扁平池。

8. 上样并调整参数，获得图谱。

溶液终浓度为：25 mM BMPO， 0.5 mM次黄嘌呤和0.05 U/ml的黄嘌呤氧化酶。

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羟自由基操作流程

1. 分别准备1 mM的FeSO4，10 mM的H2O2和250 mM的BMPO水溶液。

2. 向EP管中加入140 μl的超纯水。

3. 继续加入20 μl浓度为250 mM的BMPO和20 μl浓度为1 mM的FeSO4。

4. 加入20 μl浓度为10 mM的H2O2，触发反应。

5. 混合并迅速转移至扁平池中。

6. 上样并调整参数，获得图谱。

溶液终浓度为：25 mM BMPO，0.1 mM FeSO4和1 mM H2O2

*建议实验人员做背景图片，以在EPR图谱中排除自选杂质的干扰。

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相关参考数据

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超氧化物信号强弱随时间的变化曲线和半衰期时间

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*BMPO检测超氧阴离子O2•-的半衰期 (pH=7.4) 更长。因此更适合长时间观察样品的实验。(如检测生物酶反应)

超氧阴离子和羟自由基检测（EPR）—DMPO货号：D048

超氧阴离子和羟自由基检测（EPR）—DMPO货号：D048
5,5-二甲基-1-吡咯啉-N-氧化物
DMPO
商品信息
储存条件：-20度保存，防潮，避光
运输条件：室温
分子式：

C6H11NO

分子量：

113.16

特点：

• 纯度高

• 杂质峰少

选择规格：
1ml

凑单关联产品TOP5

NO.1.    TEMP    单线态氧检测

NO.2.    BMPO    超氧阴离子和羟自由基检测

NO.3.    ROS Assay Kit    活性氧检测

NO.4.    SOD Assay Kit    超氧化物歧化酶(SOD)检测

NO.5.    Caspase-3 Assay Kit-Colorimetric-    细胞凋亡检测

 

规格性状

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质量约为1.1g

产品概述

由于具有潜在的致癌风险和促进衰老的作用，生物体内的自由基已成为研究的热点。 DMPO是研究自由基最常用的自旋捕获剂。 它适用于捕获氧自由基，尤其是超氧化物，并生成具有特征的EPR信号的加合物。 但是，大多数市售的DMPO包含会引起高背景的杂质。 因此，这些DMPO需要进一步纯化才能在EPR上进行实验。 Dojindo的DMPO实行严格的质量管控，没有杂质引起的背景问题，因此不需要任何预纯化处理。

产品特点

•超高纯度

•更高的信噪比

•无需预纯化

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同仁化学研究所 (Dojindo) 的DMPO没有杂质 (*) 检出

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以羟自由基的Fenton反应(黑色)和空白(蓝色)为例，同仁化学研究所(Dojindo)的峰更清晰，S/N比例更高

应用

自旋捕获剂，EPR（ESR）检测，超氧阴离子，羟基自由基

原理

自旋捕捉ESR技术是一种检测活性氧的最可靠的办法，它能提供具有特征的ESR信号。DMPO采用一种特殊的敏感方法，可以捕捉超氧阴离子和羟自由基等，分别产生独特的ESR光谱。因此它是探测生物系统内ROS的强有力工具。

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操作步骤

SOD清除超氧阴离子的活性检测

1. 将15 μl的DMPO溶液和 50 μl的5 mM的次黄嘌呤加入到35 μl的0.1 M的磷酸盐缓冲液 (pH 7.8) 中。

2. 加入50 μl的待测SOD标准品或待测样品，涡旋振荡 1-2 s。

3. 加入50 μl的0.4 U/ml的黄嘌呤氧化酶之后立即涡旋振荡。

4. 放置一段时间 (例如 1 min) 将溶液转入ESR样品管中检测。

5. 通过峰值计算相对强度(DMPO-O2-/Mn2+)。

1606353195589189.png

C-,N-,S-基自由基的检测

1. 制备100 mM含有25 μM Diethylenetriaminepentaacetic Acid (DTPA)的磷酸盐缓冲液 (pH 7.4)，作为过渡金属螯合剂。

2. 制备以下过氧化物酶底物：A) 100 mM 甲酸钠(HCOONa)；B) 100 mM氰化钾(KCN)；C) 100 mM叠氮钠(NaN3)；D) 含有100 mM亚硫酸钠 (Na2SO3)的100 mM磷酸盐缓冲液 (pH 7.4)。

3. 制备4.0 mg/ml(~100 μM)的辣根过氧化物酶 (HRP)溶液和1 mM H2O2溶液。

4. 制备浓度为1 M的DMPO溶液。

5. 在离心管中加入130 μl的缓冲液，加入20 μl已配好的1 M的DMPO溶液，再加入20 μl底物储存液，10 μl的1 mM H2O2溶液，最后加入20 μl HRP触发反应。

6. 涡旋振荡离心管，加入到进样系统中，检测图谱。

7. 加样后调节光谱并得到图谱。各物质的终浓度为：100 mM DMPO，10 mM的底物，50 μM H2O2，10 μM HRP。

1606353208119174.png

数据和操作流程由Bruker公司友情提供

Carboxy-PTIO试剂货号：C348

Carboxy-PTIO试剂货号：C348
2-(4-Carboxyphenyl)-4,4,5,5-tetramethylimidazoline-1-oxyl-3-oxide, sodium salt
CAS号：148819-93-6
商品信息
储存条件：-20度保存,避光
运输条件：室温
分子式：

C14H16N2NaO4

分子量：

299.28

选择规格：
10mg

关联产品

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ROS检测
氧化型/还原型谷胱甘肽定量试剂盒-GSSG/GSH Quantification Kit II
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细胞脂质过氧化物检测试剂盒
在线小工具

实验工具|稀释计算器|摩尔浓度计算器

NOR 3试剂货号：N390

NOR 3试剂货号：N390
(±)-(E)-4-乙基-2-[(E)-羟基氨基]-5-硝基-3-己烯胺（(±)-(E)-4-Ethyl-2-[(E)-hydroxyimino]-5-nitro-3-hexenamide）
CAS号：138472-01-2
商品信息
储存条件：-20度保存，防潮，避光
运输条件：室温
分子式：

 C8H13N3O4

分子量：

215.21

选择规格：
10 mg

单线态氧检测（EPR）—TEMP货号：T511

单线态氧检测（EPR）—TEMP货号：T511
2,2,6,6-Tetramethyl-4-piperidone hydrochloride(TEMP)
TEMP
商品信息
储存条件：室温
运输条件：室温
分子式：

C9H17NO·HCl

分子量：

191.70

特点：

• 纯度高

• 杂质峰少

• 灵敏度高

选择规格：
5g

凑单关联产品TOP5

NO.1.    DMPO    超氧阴离子和羟自由基检测   

NO.2.    BMPO    超氧阴离子和羟自由基检测

NO.3.    ROS Assay Kit -Highly Sensitive DCFH-DA-    ROS检测

NO.4.    Calcein-AM/PI Double Staining Kit    活死细胞双染

NO.5.    Cell Counting Kit-8    细胞增殖毒性检测

 

产品概述

单线态氧 (Singlet Oxygen，1O2) 即激发态氧分子，是一种具有强氧化性的活性氧 (ROS)，在环境、化学、生物、医学等学科中具有重要的研究价值。在众多检测手段中，电子顺磁共振 (EPR) 公认为选择性最好，灵敏度最高的方法。

单线态氧分子和捕获剂TEMP本身呈EPR沉默 (EPR-silent)，TEMP捕获单线态氧后，可形成稳定的氮氧自由基TEMPO，通过对TEMPO的EPR信号分析并结合反应进程，可获知单线态氧的生成的速率和浓度变化。

产品特点

同仁化学研究所 (DOJINDO) 研发的TEMP(2,2,6,6-四甲基-4-哌啶酮 盐酸盐)，保持了一贯的高品质、高稳定性捕获剂的产品特点。TEMP基线无TEMPO的干扰EPR信号，稳定性更好。同时盐酸盐结构增强了捕获剂的水溶性，避免沉淀的析出。

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实验例

使用光敏剂Rose Benga (1 mM) 光照后，检测单线态氧。TEMP终浓度100 mM，PBS缓冲液 (PH 7.5) 中进行检测。

备注：

① 由于跃迁高度禁阻，基态氧分子吸收光不能直接产生1O2，可以通过光敏化法、微波放电法和化学方法得到。

② PBS缓冲液可更换为纯水等其他溶剂，实验者可根据实验设计自行选择。

③如信号较弱，可调节PH至8.5-9.5，以提高TEMPO的稳定性，使信号加强。

1622617324684255.png

关联产品

ROS Assay Kit -Highly Sensitive DCFH-DA-试剂
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氧化型/还原型谷胱甘肽定量试剂盒-GSSG/GSH Quantification Kit II
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超氧化物歧化酶检测——SOD Assay Kit
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超氧阴离子和羟自由基检测（EPR）—DMPO货号：D048

超氧阴离子和羟自由基检测（EPR）—DMPO货号：D048
5,5-二甲基-1-吡咯啉-N-氧化物
DMPO
商品信息
储存条件：-20度保存，防潮，避光
运输条件：室温
分子式：

C6H11NO

分子量：

113.16

特点：

● 纯度高

● 杂质峰少

选择规格：
1ml

凑单关联产品TOP5

NO.1.    TEMP    单线态氧检测

NO.2.    BMPO    超氧阴离子和羟自由基检测

NO.3.    ROS Assay Kit    活性氧检测

NO.4.    SOD Assay Kit    超氧化物歧化酶(SOD)检测

NO.5.    Caspase-3 Assay Kit-Colorimetric-    细胞凋亡检测

 

规格性状

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质量约为1.1g

产品概述

由于具有潜在的致癌风险和促进衰老的作用，生物体内的自由基已成为研究的热点。 DMPO是研究自由基最常用的自旋捕获剂。 它适用于捕获氧自由基，尤其是超氧化物，并生成具有特征的EPR信号的加合物。 但是，大多数市售的DMPO包含会引起高背景的杂质。 因此，这些DMPO需要进一步纯化才能在EPR上进行实验。 Dojindo的DMPO实行严格的质量管控，没有杂质引起的背景问题，因此不需要任何预纯化处理。

产品特点

•超高纯度

•更高的信噪比

•无需预纯化

1606352986913286.png

同仁化学研究所 (Dojindo) 的DMPO没有杂质 (*) 检出

1606353001794848.png

以羟自由基的Fenton反应(黑色)和空白(蓝色)为例，同仁化学研究所(Dojindo)的峰更清晰，S/N比例更高

应用

自旋捕获剂，EPR（ESR）检测，超氧阴离子，羟基自由基

原理

自旋捕捉ESR技术是一种检测活性氧的最可靠的办法，它能提供具有特征的ESR信号。DMPO采用一种特殊的敏感方法，可以捕捉超氧阴离子和羟自由基等，分别产生独特的ESR光谱。因此它是探测生物系统内ROS的强有力工具。

1606352915471038.png

操作步骤

SOD清除超氧阴离子的活性检测

1. 将15 μl的DMPO溶液和 50 μl的5 mM的次黄嘌呤加入到35 μl的0.1 M的磷酸盐缓冲液 (pH 7.8) 中。

2. 加入50 μl的待测SOD标准品或待测样品，涡旋振荡 1-2 s。

3. 加入50 μl的0.4 U/ml的黄嘌呤氧化酶之后立即涡旋振荡。

4. 放置一段时间 (例如 1 min) 将溶液转入ESR样品管中检测。

5. 通过峰值计算相对强度(DMPO-O2-/Mn2+)。

1606353195589189.png

C-,N-,S-基自由基的检测

1. 制备100 mM含有25 μM Diethylenetriaminepentaacetic Acid (DTPA)的磷酸盐缓冲液 (pH 7.4)，作为过渡金属螯合剂。

2. 制备以下过氧化物酶底物：A) 100 mM 甲酸钠(HCOONa)；B) 100 mM氰化钾(KCN)；C) 100 mM叠氮钠(NaN3)；D) 含有100 mM亚硫酸钠 (Na2SO3)的100 mM磷酸盐缓冲液 (pH 7.4)。

3. 制备4.0 mg/ml(~100 μM)的辣根过氧化物酶 (HRP)溶液和1 mM H2O2溶液。

4. 制备浓度为1 M的DMPO溶液。

5. 在离心管中加入130 μl的缓冲液，加入20 μl已配好的1 M的DMPO溶液，再加入20 μl底物储存液，10 μl的1 mM H2O2溶液，最后加入20 μl HRP触发反应。

6. 涡旋振荡离心管，加入到进样系统中，检测图谱。

7. 加样后调节光谱并得到图谱。各物质的终浓度为：100 mM DMPO，10 mM的底物，50 μM H2O2，10 μM HRP。

1606353208119174.png

数据和操作流程由Bruker公司友情提供

超氧阴离子和羟自由基检测（EPR）—BMPO货号：B568

超氧阴离子和羟自由基检测（EPR）—BMPO货号：B568
5-tert-Butoxycarbonyl-5-methyl-1-pyrroline-N-oxide
BMPO
商品信息
储存条件：-20度保存，防潮
运输条件：室温
分子式：

C10H17NO3&am

分子量：

199.25

特点：

● 纯度高

● 杂质峰少

● 灵敏度高

选择规格：
50mg

凑单关联产品TOP5

NO.1.    DMPO    超氧阴离子和羟自由基检测

NO.2.    TEMP    单线态氧检测

NO.3.    Calcein-AM/PI Double Staining Kit    活死细胞双染

NO.4.    ROS Assay Kit    活性氧检测

NO.5.    Annexin V, FITC Apoptosis Detection Kit    细胞凋亡检测

 

产品概述

自旋捕捉技术是当今检测和鉴别不稳定自由基的最可靠的手段之一。顺磁共振波谱 (EPR) 捕捉剂能够成功的检测体内或体外生成的超氧自由基和羟自由基等。

BMPO是同仁化学研究所 (DOJINDO) 自主开发生产的新型高效、高稳定型自由基捕捉剂。它在捕捉自由基能力上优于PBN、DMPO等一般捕获剂，与自由基的结合能力更强，半衰期 (t½=23 min) 更长，ESR谱图能够明显的区别不同的自由基结构如：GS•和•OH。BMPO检测结果可靠性高、重复性强。由于具有高水溶性的特点，更利于水相体系自由基的研究，尤其是生物体系的自由基研究。

应用

自旋捕获剂，EPR（ESR）检测，超氧阴离子，羟基自由基

产品特点

•半衰期长，可检测自由基加合物

•高水溶性

•更高的信噪比

化学结构式

1606360533446064.png

操作步骤

常规检测步骤 (*本数据仅供参考，具体参数可能因仪器厂家的不同而适当调整)

检测芬顿 (Fenton) 反应所产生的羟自由基：

1. 将1.5 mg的BMPO溶解于5 ml的超纯水。

2. 取15 μl的BMPO溶液，75 μl的1 mM的H2O2和75 μl的100 μM的FeSO4加入到50 μl的超纯水中。

3. 放置一段时间 (例如1 min) 将溶液转入EPR样品管中检测。

4. 通过峰值计算相对强度。

检测黄嘌呤和黄嘌呤氧化酶体系 (XO) 所产生的超氧自由基：

1. 溶液A：将1 mg的BMPO溶解于1 ml的浓度为50 mM的PBS溶液 (pH 7.4)。

2. 溶液B：用50 mM的PBS溶液 (pH 7.4) 配制含有1 mMDTPA和0.4 mM黄嘌呤的混合溶液。

3. 溶液C：用50 mM的PBS溶液 (pH 7.4) 配制含有0.1 U/ml的黄嘌呤氧化酶溶液。

4. 取15 μl溶液A，135 μl溶液B和10 μl溶液C混合。

5. 放置一段时间 (例如 8 min) 将溶液转入EPR样品管中检测。

6. 通过峰值计算相对强度。

实验例

(*本数据仅供参考，具体参数可能因仪器厂家的不同而适当调整)

*本数据均由Bruker公司EPR仪器检测得出，由于BMPO的分子结构在平面上下差异较大，使得图中BMPO/•OH的两种异构体的超精细结构常数较大能够被ESR分辨出来。本实验中BMPO/•OH的两种立体异构体与BMPO/•OOH的构成相似，两种BMPO结合物的适宜条件为：

构象异构体 (conformer)Ⅰ：

aN =13.47 G，aH

aHβ=15.31 G，aH

aHγ1 = 0.62 G

构象异构体 (conformer)Ⅱ：

aN =13.56 G，aH

aHβ=12.3 G，aH

aHγ1 = 0.66 G

超氧化物检测操作流程

1. 用100 mM的PBS溶液 (pH 7.4) 制备浓度为25 μM的DTPA，作为过渡金属螯合剂。

2. 用100 mM PBS (pH 7.4)配制1 mM次黄嘌呤溶液。

3. 配制1 U/ml的黄嘌呤氧化酶溶液。

4. 将10 mg的BMPO溶于200 μl的PBS溶液中。(终浓度约为 250 mM)。

5. 向EP管中加入70 μl缓冲液。

6. 继续添加20 μl浓度为250 mM的BMPO和100 μl步骤2中准备的1 mM的次黄嘌呤溶液。

7. 加入10 μl黄嘌呤氧化酶触发反应，将EP管漩涡震荡后转移到扁平池。

8. 上样并调整参数，获得图谱。

溶液终浓度为：25 mM BMPO， 0.5 mM次黄嘌呤和0.05 U/ml的黄嘌呤氧化酶。

1606360875370516.png

羟自由基操作流程

1. 分别准备1 mM的FeSO4，10 mM的H2O2和250 mM的BMPO水溶液。

2. 向EP管中加入140 μl的超纯水。

3. 继续加入20 μl浓度为250 mM的BMPO和20 μl浓度为1 mM的FeSO4。

4. 加入20 μl浓度为10 mM的H2O2，触发反应。

5. 混合并迅速转移至扁平池中。

6. 上样并调整参数，获得图谱。

溶液终浓度为：25 mM BMPO，0.1 mM FeSO4和1 mM H2O2

*建议实验人员做背景图片，以在EPR图谱中排除自选杂质的干扰。

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相关参考数据

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超氧化物信号强弱随时间的变化曲线和半衰期时间

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*BMPO检测超氧阴离子O2•-的半衰期 (pH=7.4) 更长。因此更适合长时间观察样品的实验。(如检测生物酶反应)

Glutamate Assay Kit-WST试剂盒货号：G269

Glutamate Assay Kit-WST试剂盒货号：G269
谷氨酸的定量检测试剂盒
Glutamate Assay Kit-WST
商品信息
储存条件：0-5度保存，避光，防潮
运输条件：室温

特点：

● 享有显色底物WST专利

● 用于L-Glutamate的定量

选择规格：
1set

凑单关联产品TOP5

NO.1.    FerroOrange    细胞亚铁离子检测   

NO.2.    Glutamine Assay Kit-WST    谷氨酰胺的定量检测

NO.3.    GSSG/GSH Quantification Kit II    氧化型/还原型谷胱甘肽定量

NO.4.    Liperfluo    细胞脂质过氧化物检测

NO.5.    Mito-FerroGreen    铁离子荧光探针

 

试剂盒内含

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产品概述

谷氨酸不仅用于蛋白质和谷胱甘肽的生物合成，而且还作为神经递质发挥重要作用，谷氨酸过多被认为是引起神经退行性疾病如阿尔茨海默氏病的原因。根据文献报道，胱氨酸/谷氨酸的转运蛋白(xCT)具有吸收胱氨酸放出谷氨酸的功能，而抑制xCT会诱导细胞发生铁依赖性的死亡—铁死亡，近年来针对xCT的癌症研究越来越多。

Glutamate Assay Kit-WST是谷氨酸的定量检测试剂盒。细胞培养基中或细胞内的谷氨酸都可以通过WST的还原反应进行定量，谷氨酸定量的最低浓度为5 μmol/l。此外，本试剂盒还可以使用96孔板进行多样品批量检测。

原理

       本试剂盒通过WST的还原反应对细胞和培养基中的谷氨酸进行定量。此外，本试剂盒还包含谷氨酸标准溶液，可用于通过制作标准曲线来定量样品中谷氨酸的浓度。

 

image.png

操作步骤

　只需将细胞培养上清液或组织/细胞裂解溶液转移到孔板中，加入试剂后孵育即可。

image.png

实验例

标准曲线的实验例：

样品中的谷氨酰胺浓度可通过使用该试剂盒的谷氨酰胺标准溶液制作标准曲线来确定。如果谷氨酰胺浓度为0.5 mmol/l或更高，则可以通过稀释样品进行检测。

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谷氨酰胺和谷氨酸的检测实验例：

将A549细胞接种在6孔板中，用Glutamine Assay Kit-WST和Glutamate Assay Kit-WST分别检测细胞培养上清液中谷氨酰胺和谷氨酸浓度随培养时间的变化。

结果，培养基中的谷氨酰胺浓度随培养时间增加而降低，而谷氨酸浓度则升高。

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铁死亡研究中谷氨酸和谷胱甘肽的检测实验例:

据报道通过弹性蛋白，抑制胱氨酸/谷氨酸转运体(xCT)造成铁依赖性的细胞死亡，即细胞铁死亡。在通过弹性蛋白处理后的A549细胞中，确认谷氨酸的释放量和细胞内谷胱甘肽的量。结果显示，通过弹性蛋白处理的细胞中谷氨酸释放的量减少，抑制胱氨酸的摄取，从而导致谷胱甘肽的量减少。

image.png

Sulfasalazine (SSZ) 引起的细胞内代谢变化实验例：

将已知会抑制胱氨酸/谷氨酸转运体(xCT)的Sulfasalazine(SSZ)加入到A549细胞后，确认谷氨酸释放量、细胞内ATP、α-酮戊二酸(α-KG)、谷胱甘肽(GSH)以及ROS的变化。

结果显示，SSZ加入后细胞内ATP、谷胱甘肽(GSH)和谷氨酸释放量减少，细胞内α-酮戊二酸和ROS增加。1612749142364629.png

<使用产品>

· 细胞内GSH：GSSG/GSH Quantification Kit II（货号：G263）⬅电脑浏览点击品名（手机浏览点击此处）

· 细胞内ROS：ROS Assay Kit -Highly Sensitive DCFH-DA-（货号：R252）⬅电脑浏览点击品名（手机浏览点击此处）

· 细胞内ATP：ATP Assay Kit-Luminescence（货号：A550）

· 细胞内α-KG：α-Ketoglutarate Assay Kit-Fluorometric（货号：K261）

<实验条件>

细胞：A549细胞 (1 x 106 cells) 　药物处理时间：48 h

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1622087244529743.png1622087268638819.png

参考文献) Shogo Okazaki et al.,”Glutaminolysis-related genes determine sensitivity to xCT-targeted therapy in head and neck squamous cell carcinoma“.Cancer Sci.,2019,doi:10.1111/cas.14182.

常见问题Q&A

Q1：一个试剂盒可以检测样品的数量是多少？
A1：制备标准曲线和样品(n=3)，可以检测的样品数量如下所示。

100 tests

样品数量(n=3) 24个样品(参照下图)

谷氨酸标准溶液和样品的96孔板排列示意图(n=3)

1609381817863934.png
Q2：配制后的Working solution可以保存多久？
A2：Working solution无法保存，需要现配现用。此外光会影响Working solution的稳定性，所以配制后请避光。

※Working solution配制后，避光室温条件下4 h稳定。当暴露于光线下，溶液的颜色会变成褐色。
Q3：是否可以定量D-Glutamate？
A3：该试剂盒是用于L-Glutamate定量，无法定量D-Glutamate。
Q4：是否可以检测含有还原性物质的样品？
A4：如果样品中含有还原性的物质，则WST染料也会发生显色，此时无法准确定量谷氨酸浓度。实验中如遇到以上情况，可以准备药物对照(不含细胞含药物的培养基+试剂)。
Q5：待测样品可以保存吗？
A5：我们确认过细胞培养上清液样品可以-20°C保存1个月。

细胞裂解样品也可以-20°C保存1个月。 但是，在保存之前请使用试剂盒中的Filtration Tube进行脱蛋白处理。
Q6：为什么我的样品孔没有显色？
A6：样品中的谷氨酸浓度可能低于检测限(5 µmol/l)，谷氨酸浓度低于5 µmol/l的样品无法用该试剂盒检测。

如果待测样品被稀释，则稀释样品中含有的谷氨酸浓度可能低于5 µmol/l。请减少稀释比例，从而将检测样品的谷氨酸浓度调整到最低检测限以上。
Q7：是否可以使用450 nm以外波长的滤光片进行检测？
A7：也可以使用490 nm的滤光片。但是，吸光度会低于在450nm处的吸光度。(见下图)

1622087017370785.png

Glutamine Assay Kit-WST试剂盒货号：G268

Glutamine Assay Kit-WST试剂盒货号：G268
谷氨酰胺定量检测试剂盒
Glutamine Assay Kit-WST
商品信息
储存条件：0-5度保存，避光，防潮
运输条件：室温

特点：

● 享有显色底物WST专利

● 用于L-Glutamine的定量

选择规格：
1set

凑单关联产品TOP5

NO.1.    FerroOrange    细胞亚铁离子检测   

NO.2.    GSSG/GSH Quantification Kit II    氧化型/还原型谷胱甘肽定量

NO.3.    Glutamate Assay Kit-WST    谷氨酸的定量检测

NO.4.    Liperfluo    细胞脂质过氧化物检测

NO.5.    Mito-FerroGreen    铁离子荧光探针

 

试剂盒内含

1607220500456163.png

产品概述

谷氨酰胺是TCA循环的中间体α-酮戊二酸的主要来源，并且是用于核酸和其他氨基酸合成及能量产生的重要物质。根据文献报道特别是在癌细胞中，谷氨酰胺作为底物可促进Glutaminolysis的生成，而Glutaminolysis是产生α-酮戊二酸的途径之一。同时Glutaminolysis还可以消除活性氧并减少氧化型谷胱甘肽。

Glutamine Assay Kit-WST是用于定量检测谷氨酰胺的试剂盒。无论是培养基内还是细胞内的谷氨酰胺均可以通过WST的还原反应进行定量，可检测的最低浓度为5 μmol/l。此外，本试剂盒还可使用96孔板进行多样品批量检测。

原理

本试剂盒通过WST的还原反应对细胞和培养基中的谷氨酰胺进行定量。此外，本试剂盒还包含谷氨酰胺标准溶液，可用于通过制作标准曲线来定量样品中谷氨酰胺的浓度。

1606449794882504.png

操作步骤

*向谷氨酰胺标准溶液和含有谷氨酰胺酶的样品孔中加入谷氨酰胺酶溶液，并在样品(不含谷氨酰胺酶溶液)的每个孔中加Reaction Buffer。

由下式算出检测样品中的谷氨酰胺浓度。

样品中的谷氨酰胺浓度(mmol/l)＝(含有谷氨酰胺酶溶液)-(不含谷氨酰胺酶溶液)

1606455360524924.png

实验例

标准曲线的实验例：

样品中的谷氨酰胺浓度可通过使用该试剂盒的谷氨酰胺标准溶液制作标准曲线来确定。如果谷氨酰胺浓度为0.5 mmol/l或更高，则可以通过稀释样品进行检测。

image.png

谷氨酰胺和谷氨酸的检测实验例：

将A549细胞接种在6孔板中，用Glutamine Assay Kit-WST和Glutamate Assay Kit-WST分别检测细胞培养上清液中谷氨酰胺和谷氨酸浓度随培养时间的变化。

结果，培养基中的谷氨酰胺浓度随培养时间增加而降低，而谷氨酸浓度则升高。

1606455940746088.png

常见问题Q&A

Q1：一个试剂盒可以检测样品的数量。
A1：制备标准曲线和样品(n=3)，可以检测的样品数量如下所示。

100 tests

样品数量(n=3) 12个样品(参照下图)

谷氨酰胺标准溶液和样品的96孔板排列示意图(n=3)

image.png

 

＊当n=3时，至少需要240 μl(每孔40 μl×6孔)。

样品中的谷氨酰胺浓度(mmol/l)＝(含有谷氨酰胺酶溶液)-(不含谷氨酰胺酶溶液)
Q2：配制后的Working solution可以保存多久？
A2：Working solution无法保存，需要现配现用。此外光会影响Working solution的稳定性，所以配制后请避光。
Q3：是否可以定量D-Glutamine？
A3：该试剂盒是用于L-Glutamine定量，无法定量D-Glutamine。
Q4：是否可以检测含有还原性物质的样品？
A4：如果样品中含有还原性的物质，则WST染料也会发生显色，此时无法准确定量谷氨酰胺浓度。实验中如遇到以上情况，可以准备药物对照(不含细胞含药物的培养基+试剂)。
Q5：待测样品可以保存吗？
A5：我们确认过细胞培养上清液样品可以-20°C保存1个月。

细胞裂解液样品也可以-20°C保存1个月。但是，在保存之前请使用试剂盒中的Filtration Tube进行脱蛋白处理。
Q6：为什么我的样品孔没有显色？
A6：样品中的谷氨酰胺浓度可能低于检测限(5 µmol/l)，谷氨酰胺浓度低于5 µmol/l的样品无法用该试剂盒检测。如果待测样品被稀释，则稀释样品中含有的谷氨酰胺浓度可能低于5 µmol/l。请减少稀释比例，从而将检测样品的谷氨酰胺浓度调整到最低检测限以上。
Q7：是否可以使用450 nm以外波长的滤光片进行检测？
A7：也可以使用490 nm的滤光片。但是，吸光度会低于在450nm处的吸光度。(见下图)

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铁离子荧光探针—Mito-FerroGreen货号：M489

铁离子荧光探针—Mito-FerroGreen货号：M489
铁死亡荧光试剂 (Fe2+荧光法)
Mito-FerroGreen
商品信息
储存条件：-20度保存，避光
运输条件：室温

特点：

● 定位线粒体

● 更深层次铁离子探究

选择规格：
50μg*2

产品概述

研究证实铁是生物体内量最多的过渡金属元素。其参与多种生理活动。近几年，细胞内的游离铁离子由于具有很高的反应性，和细胞损伤、死亡有一定的关联而得到了越来越多的关注。在细胞内游离铁离子以稳定的Fe2+和 Fe3+形式存在。从细胞内的还原环境，金属转运体及Fe2+的水溶性考虑，认为揭示细胞内Fe2+的行为比Fe3+更重要。Mito-FerroGreen是一种新型荧光探针，用于检测线粒体 (铁硫簇和血红素蛋白的合成场所) 内亚铁离子Fe2+。

该产品已在岐阜药科大学药物化学实验室的 永澤秀子 和 平山祐 博士的指导下开发。Mito-FerroGreen和Fe2+反应后的荧光强度上升不可逆，与Fluo-3（货号：F019）这类可以实时监测钙离子的荧光探针有所不同。

测定原理

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产品特点

铁离子检测试剂的选择

可以根据自己的实验方法和实验仪器选择检测试剂

 

FerroOrange Mito-FerroGreen
细胞内分布 细胞内 线粒体
荧光特性 λex : 543 nm、λem : 580 nm λex : 505 nm、λem : 535 nm
检测仪器 荧光显微镜 荧光显微镜 （FITC、GFP）
（滤镜）
检测对象 活细胞 活细胞
染色次数 24 μg可染色35 mm dish 17块板 50 μg可染色35 mm dish 5块板
（终浓度 1 μmol/l時） （终浓度 5 μmol/l時）

实验例

1.线粒体定位

为了确认Mito-FerroGreen的是否特异性地在线粒体内定位，与线粒体染色试剂（MitoBright Deep Red※）一同进行染色，实验结果证实了Mito-FerroGreen选择性地染色在线粒体内。

向HeLa细胞中添加5μmol/ l的Mito-FerroGreen和200 nmol/l的线粒体染色探针MitoBright Deep Red，并在CO2培养箱中培养30分钟，然后添加100μmol/ l的硫酸铁铵（II），并将混合后的细胞溶液在CO2培养箱中培养1小时后通过观察荧光。

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Mito-FerroGreen

激发波长：488 nm

发射波长：500-565 nm

MitoBright Deep Red

激发波长：640 nm

发射波长：656-700 nm

2.线粒体内的铁离子荧光成像

在含有血清的MEM培养基中接种HeLa细胞，并加入Mito-FerroGreen，通过荧光检测HeLa细胞众线粒体内的二价铁（左图）。而在添加了铁离子的HeLa细胞中，观察到了Mito-FerroGreen的荧光明显增强（中间图）。在添加了铁螯合剂的细胞中，几乎未观察到Mito-FerroGreen的荧光（右图）。 以这种方式，证实了线粒体中铁含量的差异和荧光强度的差异是成相关性的。

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3.对二价铁离子的高度选择性和高信号

向1ml 50mmol/l HEPES Buffer（pH7.4）中加入2μl 1mol/l Mito-FroGreen、2μl 10mmol/l各种金属以及20μl 1mg/ml酯化酶，在室温下反应1小时后测定荧光强度。

激发波长：500 nm

发射波长：535 nm

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4.适用于通用滤光片

Mito-FerroGreen的激发波长为488nm，最大激发波长可达505nm。

向3ml 50 mmol/l HEPES Buffer (pH7.4) 中加入 6μl 1mol/l Mito-FroGreen、6μl 10mmol/l硫酸铵铁（Ⅱ）以及20μl 1mg/ml酯化酶。在37℃下反应1小时后检测荧光强度。

激发波长：500 nm

发射波长：535 nm

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参考文献

1) T. Hirayama,  S. Kadota, M. Niwa  and  H. Nagasawa, “A mitochondria-targeted fluorescent probe for selective detection of mitochondrial labile Fe(II)”, Metallomics., 2018, DOI: 10.1039/C8MT00049B

2) T. Issitt, E. Bosseboeuf, N. Winter, N. Dufton, G. Gestri, V. Senatore, A. Chikh, A. Randi, C. Raimondi, “Neuropilin-1 controls endothelial homeostasis by regulating mitochondrial function and iron-dependent oxidative stress via ABCB8”, iScience., 2018,DOI: 10.1016/j.isci.2018.12.005 .

3) E. E. Mon, F. Y. Wei, R. N. R. Ahmad, T. Yamamoto, T. Moroishi and K. Tomizawa, “Regulation of mitochondrial iron homeostasis by siderofexin 2 “, J Physiol Sci., 2018,doi:10.1007/s12576-018-0652-2.

4) M. Fujimaki, N. Furuya, S. Saiki, T. Amo, Y. Imamichi and N. Hattori, “Iron supply via NCOA4-mediated ferritin degradation maintains mitochondrial functions”, Mol. Cell. Biol.., 2019,doi: 10.1128/MCB.00010-19.

5) K. Tomita, M. Fukumoto, K. Itoh, Y. Kuwahara, K. Igarashi, T. Nagasawa, M. Suzuki, A. Kurimasa and T. Sato, “MiR-7-5p is a key factor that controls radioresistance via intracellular Fe2+ content in clinically relevant radioresistant cells.”, Biochem Biophys Res Commun.., 2019,doi: 10.1016/j.bbrc.2019.08.117.

6) Y. Wang and M. Tang, “PM2.5 induces ferroptosis in human endothelial cells through iron overload and redox imbalance”, Environ. Pollut., 2019, 264, doi: 10.1016/j.envpol.2019.07.105.

7) KF. Yambire, C. Rostosky, T. Watanabe, D. Pacheu-Grau, S. Torres-Odio,A. Sanchez-Guerrero,O. Senderovich, EG. Meyron-Holtz,I.Milosevic, J. Frahm, AP. West and N. Raimundo, “Impaired lysosomal acidification triggers iron deficiency and inflammation in vivo.”, Elife, 2019, 3, (8), doi:10.7554/eLife.51031.

8) H. Nishizawa, M. Matsumoto, T. Shindo, D. Saigusa, H. Kato, K. Suzuki, M. Sato, Y. Ishii, H. Shimokawa and K. Igarashi, “Ferroptosis is controlled by the coordinated transcriptional regulation of glutathione and labile iron metabolism by the transcription factor BACH1″,  J. Biol. Chem.,  2019,doi: 10.1074/jbc.RA119.009548.

9)Y. akashima, A. Hayano and B. Yamanaka, Metabolome analysis reveals excessive glycolysis via PI3K/AKT/mTOR and RAS/MAPK signaling in methotrexate-resistant primary CNS lymphoma-derived cells.”, Clin. Cancer Res., 2020, DOI:10.1158/1078-0432.

常见问题Q&A

Q1：是否可以对酵母进行染色吗？
A1：我们公司有酵母染色的实验例，染色的具体实验步骤请联系我们公司的销售人员。
Q2：推荐使用的滤光片波长是多少？
A2：检测时推荐的滤光片如下：

激发波长：450~500 nm

发射波长：515~550 nm

规格性状

性状：本品溶于乙腈、甲醇、二甲醇。

纯度（HPLC）：90.0%以上

荧光光谱：适合测试

Iron Assay Kit -Colorimetric-试剂盒货号：I291

Iron Assay Kit -Colorimetric-试剂盒货号：I291
Iron Assay Kit -Colorimetric-组织铁离子定量试剂盒
Iron Assay Kit -Colorimetric-
商品信息
储存条件：0-5度保存
运输条件：室温

特点：

● 适合组织检测

● 配有标准品，可定量二价、三价铁含量

● 吸光度法

选择规格：
50tests

凑单关联产品TOP5

NO.1.    FerroOrange    细胞亚铁离子检测   

NO.2.    Liperfluo    细胞脂质过氧化物检测

NO.3.    Cell Counting Kit-8    细胞增殖毒性检测

NO.4.    ROS Assay Kit -Highly Sensitive DCFH-DA-    ROS检测

NO.5.    GSSG/GSH Quantification Kit II    氧化型/还原型谷胱甘肽

试剂盒内含

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产品概述

铁是生物体内最重要的金属元素之一，生物体内铁元素的含量虽少，但有着重要的生理作用。近年来，随着铁死亡概念的提出，细胞内铁离子的代谢过程的研究逐渐成为了研究热点。同仁化学研究所开发的 Iron Assay Kit-Colorimetric-试剂盒 是一套操作简便的比色法铁离子检测试剂盒。与其他市面上的检测试剂盒 相比 ，可以在更短的时间内进行快速检测。通过比较组织裂解液中的铁离子探针 3-(2-Pyridyl)-5,6-bis(5-sulfo-2-furyl)-1,2,4-triazine, disodium salt的 吸光度与还原成二价铁离子的三价铁标准品的吸光度，即可确定组织样品中的二价铁含量。同时，还可以通过试剂盒中的还原剂将样品中的三价铁还原成二价铁，以确定总铁含量，进而计算出样品中三价铁的含量。

原理

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金属离子选择性

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加标回收实验

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实验例

组织样品中的Fe2+和 Fe3+的检测

1. 称量 100 mg肝脏组织 。

2. 加入 1 ml冷 PBS，移液器吹打 20次， Vortex振荡 10 s 14,000 RPM离心 4 min，去除上清 。

3. 将样品转移至研钵，加入液氮充分研磨成粉末后，加入 1.3 ml Assay Buffer，回收至微管中。

4. 将含有样品的微管置于超声波水浴中 5 min。（为防止样品温度上升，每 1 min间隔置于冰浴上 20 s）。

5. 16,000 g离心 10 min，除去不溶物。

6. 取 1300 μl上清液，每管分别加入 400 μl上清液，制成二价铁样品、总铁样品、样品空白。

7. Standard管 中加入 Reducer solution。 （参考图 2 H管 30 μl、 G~C管 20 μl、 B管 40 μl、 A管 20 μl）。

二价品样品管中加入 20 μl Assay Buffer。

总铁样品管中加入 20 μl Reducer solution。

样品空白管中加入 20 μl Assay Buffer。

将所有的 Standard管、样品管、样品空白管 37 培养 15 min。

8. 参考表 1和表 2，加入至 96孔板中 37 培养 60 min，检测 593 nm处的吸光度。

9. 将酶标仪数据拷贝至 “Iron Assay Kit – Excel表 ”，自动计算 出二价铁和三价铁浓度。

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二价铁离子检测探针—FerroOrange货号：F374

二价铁离子检测探针—FerroOrange货号：F374
细胞亚铁离子检测荧光探针
FerroOrange
商品信息
储存条件：0-5度保存
运输条件：室温

特点：

● 荧光法高敏检测胞内二价铁

● 适合于多种检测仪器

● 铁死亡常见指标之一

选择规格：
1tube
3tubes

规格性状

性状：可溶于乙腈，甲醇和二甲基亚砜。

纯度（HPLC）：92.0%以上

荧光光谱：符合一致性

产品概述

铁是生物体内最丰富的过渡金属元素，它参与各种生理过程活动。 近年来，活细胞中的游离铁受到广泛关注， 游离铁最常以其稳定的氧化还原态存在，即亚铁离子 (Fe2+) 和铁离子 (Fe3+)。对研究者来说，在研究细胞内的还原环境，金属转运蛋白和Fe2+的水溶性时，了解Fe2+的行为比了解Fe3+的行为更为重要。FerroOrange作为一种新型的荧光探针，可对活细胞内的Fe2+进行荧光成像。FerroOrange和Fe2+反应后的荧光强度上升不可逆，与Fluo-3（货号：F019）这类可以实时监测钙离子的荧光探针有所不同。

原理

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FerroOrange检测胞内Fe2+

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图为将2 μl的1 mmol/l FerroOrange和2 μl的10 mmol/l的各种金属离子添加到1 ml的50 mmol/l HEPES缓冲液（pH 7.4）中，并在室温下反应1小时后测量的荧光强度。

荧光特性

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Ex：543 nm   Em：580 nm

与其他染料共染

FerroOrange与各种细胞内的染色试剂共染

用各种染色试剂染色HeLa细胞，清洗细胞。然后将FerroOrange添加到细胞中，并用荧光显微镜观察。

与ER染色试剂共染 

＜检测条件＞

FerroOrange: Ex: 561 nm、Em: 570-620 nm

ER Tracker Green（ER染色试剂）: Ex: 488 nm、Em: 510-555 nm

标尺: 10 μm

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与线粒体染色试剂共染

＜检测条件＞

FerroOrange: Ex: 561 nm、Em: 570-620 nm

MitoBright Deep Red（线粒体染色试剂）: Ex: 640 nm、Em: 650-700 nm

标尺: 10 μm

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与高尔基体染色试剂的共染

＜检测条件＞

FerroOrange: Ex: 561 nm、Em: 570-620 nm

BODIPY FL（高尔基体染色试剂）: Ex: 488 nm、Em: 510-555 nm

标尺: 10 μm

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铁离子试剂的选择

           FerroOrange          Mito-FerroGreen
 存在部位                      细胞内                      线粒体
 荧光特性    λex : 543 nm、λem : 580 nm    λex : 505 nm、λem : 535 nm
 检测仪器    荧光显微镜、荧光酶标仪（Cy3）       荧光显微镜（FITC、GFP）
 测定对象                   活细胞                  活细胞
 检测次数      24μg可染色17次35mm dish
（终浓度为1μmol/l）		      50μg可染色5次35mm dish
（终浓度为5μmol/l）

操作步骤

1.细胞接种于荧光培养皿中，在37℃，5% CO2培养箱中孵育过夜。

2.弃去上清液，并用HBSS或无血清培养基洗涤细胞3次。

3.更换含有药物的培养基，在37℃，5% CO2培养箱中孵育。

* 请根据药物特性优化孵育时间。

4.加入浓度为1 μmol/l的FerroOrange工作液，在37℃，5% CO2培养箱中孵育。

* 加入FerroOrange染色剂后请立即观察，不要洗涤。

5.在荧光显微镜下观察细胞。

高灵敏度检测胞内铁离子

使用HeLa细胞，通过FerroOrange确认细胞内Fe2+的变化

与对照组的细胞相比，用硫酸亚铁 (II) 铵处理的HeLa细胞的FerroOrange荧光强度增加。 相反，在用Bpy处理的细胞中，其荧光强度降低。

因此，证明FerroOrange与细胞内Fe2+反应。

 

A: 对照组

B: 铁剂·硫酸亚铁(II) 铵（终浓度100umol/l）处理

C: 铁螯合剂·2,2′-Bipyridyl (Bpy)（终浓度100umol/l）处理

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检测条件 Ex/Em = 561 nm/570-620 nm  比例尺：20 μm

常见问题Q&A

Q1:FerroOrange由于是活细胞荧光探针，如果铁死亡发生，导致细胞膜破裂后，荧光是否存在？
A1:由于FerroOrange是活细胞探针，对死细胞无法发挥出探针的正常性能。
Q2: FerroOrange只会检测游离铁吗？还是某些如铁硫蛋白里的结合铁，都可以检测吗？
A2：FerroOrange只检测游离的二价铁
Q3: 铁死亡研究中，Fe2+和Fe3+的检测哪个更重要。铁死亡的时候，总Fe都会变吗？还是说只有Fe2+/Fe3+之间的转化。
A3:二价铁作为线粒体的所需物质在细胞质的“铁池”内积蓄，它在DNA合成，细胞周期调控，线粒体内ATP的产生等起重要作用。为了防止损伤细胞,多余的二价铁会与铁蛋白结合生成没有氧化还原性的三价铁并储存。或者通过膜铁转运蛋白排出到细胞外。
Q4: FerroOrange能否用于固定处理之后的样本?
A4:不能用于石蜡切片。

试剂能尝试于温和条件下固定处理之后的样本，如多聚甲醛（PFA，终浓度3%）在4°C中培养10 min。与未固定的样本相比，固定20 min以上或室温固定后的样本的荧光强度会明显降低。请注意本探针可能很难于固定样本中使用，必须先进行染色，然后做尝试。
Q5:本探针适合于什么检测方式？
A5:见表格

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我们建议使用绿色激光（Ex:532 nm）激发FerroOrange
Q6:染色时需要注意什么？
A6：注意如下，

1.FerroOrange染色后的对培养基的更换。

染色后无需清洗工作液，通常血清中含有铁离子，请注意使用不含血清的培养基，所以染色后即使细胞外有残留的FerroOrange，但是因为细胞外没有血清中铁离子的影响，也不会产生背景荧光的问题。

2.对照实验。

为了检查铁检测的实验条件，我们建议准备加入铁螯合试剂Bpy(2,2`-bipyridine)或铁(硫酸铵铁(II))的样品,并观察FerroOrange荧光强度的变化。

3.细胞难以染色(灵敏度低)时的办法。

根据细胞种类的不同，染色程度也有差异。

使FerroOrange working solution浓度高于推荐的1 µmol/l进行染色。建议在1-5 µmol/l范围内染色。
Q7:使用荧光酶标仪的操作步骤
A7：请参考下面的实验例子进行测量。

<测定样品>。

样品A：无添加剂(仅HeLa细胞)。

样品B：添加了铁螯合试剂2,2`-bipyridyl(Bpy)的HeLa细胞。

样品C：添加铁(硫酸铵铁)的HeLa细胞。

<测量操作>。

1.在96孔黑板(透明底)上接种100 µl HeLa细胞悬液，使其达到10,000 cells/well，在37℃  5%CO2 培养箱中过夜培养。

2.样品C的细胞用MEM(不含FBS)100 µl洗涤3次。

3.向样品C中添加100 μl硫酸铵铁(II)/MEM(不含FBS) (最终浓度: 100 µmol/l)，在37℃  5%CO2培养箱中静置30分钟。

4.用100 µl HBSS洗涤所有孔的细胞3次。

5.向样品A和C中添加100 μl的1 µmol/l FerroOrange working solution ，向样品B中添加100 μl含有FerroOrange(最终浓度:1 µmol/l)和Bpy(最终浓度:100 µmol/l)的HBSS溶液，在37℃ 5%CO2培养箱中培养30分钟。

6.用多功能读板器检测各样品的荧光强度(Ex:543 nm,Em:580 nm)。

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Q8：推荐的滤光片
A8: 激发滤光片:530-565 nm

发射滤光片:570-620 nm

MitoPeDPP试剂货号：M466

MitoPeDPP试剂货号：M466
3-[4-(Perylenylphenylphosphino)phenoxy]propyltriphenylphosphonium iodide
MitoPeDPP
商品信息
储存条件：0-5度保存，避光
运输条件：室温

特点：

● 定位线粒体

● 更深层次脂质过氧化探究

选择规格：
5μg*3

产品概述

MitoPeDPP是一种新型荧光染料，由于其具有三苯基膦结构，因此可以穿过细胞膜并在线粒体中聚集。

聚集在线粒体内膜上的MitoPeDPP可以被脂质过氧化物氧化而释放出强荧光。由于氧化的MitoPeDPP

(Ox-MitoPeDPP) 的激发和发射波长分别是452 nm和470 nm，可以减小样品的光损伤和自发荧光，因此利用

荧光显微镜MitoPeDPP可以检测活细胞中的脂质过氧化物。

特点

1.特异性的在细胞中线粒体内聚集

2.可以检测线粒体膜内的脂质过氧化物

3.可以在488 nm和535 nm的荧光波长下进行检测

* 本产品由福冈大学化学系的Dr. Shioji开发

*由于MitoPeDPP量极少不宜看到，可以通过观察MitoPeDPP DMSO溶液的颜色是否为黄色来判断。

检测原理

MitoPeDPP可以穿过细胞膜并在线粒体中聚集。聚集在线粒体内膜上的MitoPeDPP可以被脂质过氧化物氧化而释放出强荧光。

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实验例

1.MitoPeDPP和线粒体染色试剂MitoBright共同染色的实施例

在HeLa细胞中添加t-BHP（氢过氧化叔丁基），检测脂质过氧化物

波长（wavelength/band pass）

MitoPeDPP：470/40（Ex），525/50（Em）

MitoBright DeepRed：600/50（Ex），685/50（Em）

结果证实在HeLa细胞内的线粒体中，MitoPeDPP受t-BHP氧化后会发出荧光。另外通过与线粒体染色试剂（MitoBright Deep Red:MT08）的共染色，确认了MitoPeDPP的荧光是定位在线粒体中。

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2.检测添加Rotenone产生的脂质过氧化物

向HeLa细胞[μ-slide，8孔（由Ibidi制造）]中添加MitoPeDPP之后，添加Rotenone溶液并使用荧光显微镜观察。实验结果证实，添加Rotenone后，检测到细胞中产生了脂质过氧化物。

Rotenone的刺激时间：0 min(左)，90 min(中)，180 min(右)

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上部）荧光图，下部）明场图

3.神经细胞使用MitoPeDPP的实验例

A.荧光显微镜检测

向NIE-115细胞（小鼠神经芽细胞瘤）添加异黄素，诱导Ca2+流入细胞内，并通过MitoPeDPP的荧光染色来观察线粒体膜内的脂溶性过氧化物的产生。实验结果证实添加了异霉素的实验组相比对照组来说荧光更强。

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B. 平均荧光强度数据比较

为了量化对照组细胞和添加了离子霉素的细胞的荧光强度，对两组数据进行基于平均荧光强度的比较。

结果证实，加入离子霉素后30分钟的细胞对比对照组的细胞，观察到的荧光强度显着增加。

数据提供（Free Radical Research, in press)

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参照芝浦工业大学系统理工学院 福井浩二副教授、中村沙希[参考文献3]

4.MitoPeDPP反应的选择性

在不含细胞的反应体系中，MitoPeDPP可以与各种过氧化物如H2O2，t-BHP和ONOO- 反应，但是在细胞中，积

累在线粒体中的MitoPeDPP可以被t-BHP氧化而释放出较强荧光 (图3A)，却和其它ROS或RNS反应很弱 (图3B)。

A) 在HepG2细胞中加入MitoPeDPP培养15 min，然后用100 μmol / l的t-BHP处理。

B) 在HepG2细胞中加入MitoPeDPP培养15 min后，加入ROS、RNS诱导剂。

分别加入100 μmol / l (H2O2，NO和ONOO-诱导剂)和10  μmol / l  PMA（O2-.诱导剂） 。

左边为明场图，右边为荧光图

* t-BHP：tert-Butylhydroperoxide; PMA, Phorbol myristate acetate;

SIN-1, 3-(Morpholinyl)sydnonimine, hydrochloride;

NOC 7, 1-Hydroxy-2-oxo-3-(N-methyl-3-aminopropyl)-3-methyl-1-triazene

波长/带通滤波器：470/40 (Ex), 525 /50 (Em)

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Liperfluo-细胞脂质过氧化物检测货号：L248

Liperfluo-细胞脂质过氧化物检测货号：L248
细胞脂质过氧化物检测试剂盒
Liperfluo
商品信息
储存条件：0-5度保存，避光，充氮气
运输条件：室温

特点：

● 特异性检测铁死亡相关的脂质过氧化

● 比BODIPY C11更适合于胞内定位

● 铁死亡常见指标之一

选择规格：
50μg
50μg*5

 

凑单关联产品TOP5

NO.1.    Lipid Peroxidation Probe -BDP   脂质过氧化探针BDP 

NO.2.    FerroOrange    细胞亚铁离子检测

NO.3.    GSSG/GSH Quantification Kit II    氧化型/还原型谷胱甘肽

NO.4.    Mito-FerroGreen    线粒体内亚铁离子检测

NO.5.    ROS Assay Kit    活性氧检测 

 

规格性状

性状：深红色结晶粉末或固体。

纯度（HPLC）：90.0%以上

核磁共振谱：符合一致性

<使用次数>每50µg可用5-50次

产品概述

Liperfluo是Spy-LHP的类似物，可用于检测脂质过氧化物 (LPO)，Liperfluo会被脂质过氧化物特异性氧化而在乙醇等有机溶剂中发出很强的荧光。由于氧化型Liperfluo的激发和发射波长分别为524 nm和535 nm (均为长波长)，因此可以减轻光对测定样品的损伤和降低样品的自发荧光。由于Liperfluo在二异喹啉环的一个末端连接有四乙二醇基团，因此提高了它在水溶液中的分子分散性。虽然它的氧化型在水溶液中几乎没有荧光，但是在细胞膜等脂溶性高的部位会产生较强的荧光。因此Liperfluo适用于活细胞中脂质过氧化物的荧光成像或流式分析。

特点：

1）能够成像和检测细胞中的脂质过氧化物

2）长波长激发，可以减少光损伤和自发荧光对细胞的影响

3）高度脂质过氧化物特异性

研究领域

在铁死亡研究中：

作为细胞死亡形式之一，在铁死亡研究中使用到Liperfluo

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      细胞种类

(铁死亡诱导剂）

                                     论文信息
人支气管上皮细胞（RSL3） Pseudomonas aeruginosa utilizes host polyunsaturated phosphatidylethanolamines to trigger theft-ferroptosis in bronchial epithelium.
小鼠成纤维细胞(RSL3) Oxidized arachidonic and adrenic PE s navigate cells to ferroptosis.
HeLa细胞(添Erastin或Brefeldin A) Golgi stress   mediates redox imbalance and ferroptosis in human cells.

原理

Liperfluo是Spy-LHP的类似物，可用于检测脂质过氧化物 (LPO)，Liperfluo会被脂质过氧化物特异性氧化而在乙醇等有机溶剂中发出很强的荧光。由于氧化型Liperfluo的激发和发射波长分别为524 nm和535 nm (均为长波长)，因此可以减轻光对测定样品的损伤和降低样品的自发荧光。由于Liperfluo在二异喹啉环的一个末端连接有四乙二醇基团，因此提高了它在水溶液中的分子分散性。虽然它的氧化型在水溶液中几乎没有荧光，但是在细胞膜等脂溶性高的部位会产生较强的荧光。因此Liperfluo适用于活细胞中脂质过氧化物的荧光成像或流式分析。

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荧光特性

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激发波长Ex：488 nm，发射波长Em：500-550 nm

操作步骤

1.在dish等容器中接种细胞并培养。

2.去除培养基后，用无血清培养基清洗一次。

3.加入合适浓度的Liperfluo工作液，在37℃培养30 min。

※请根据细胞种类，诱导药物等实验条件，摸索最佳的Liperfluo工作液浓度。

4.去除上清液后，用无血清培养基清洗2次。

5.用荧光显微镜或流式细胞仪进行检测。

实验例

用激光共聚焦荧光显微镜观察HeLa细胞

1) 在 μ-slide 8孔板中 (ibidi公司) 接种HeLa细胞 (3.0×104个/孔、含血清MEM培养基)，在37℃ 5%的CO2培养箱中过夜培养。

2) 去除培养基，用无血清MEM培养基清洗细胞1次。

3) 将200 μl用无血清MEM培养基稀释的1 μmol/l的Liperfluo溶液加入8孔板中，在37℃ 5%的CO2培养箱中培养30 min。

4) 去除溶液，用200 μl HBSS清洗2次。

5) 均匀地加入200 μl用HBSS稀释的500 μmol/l的 t-BHP(tert-Buthyl Hydroperoxide) 溶液，在37℃ 5%的CO2培养箱中培养60 min。

6) 用共焦荧光显微镜观察 (激发波长：488 nm，发射波长：500-550 nm)。

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用流式细胞仪检测HeLa细胞

1) 将HeLa细胞 (1.0×105个/孔、含血清MEM培养基) 接种至6孔板(Thermo公司) 中，在37℃ 5%的CO2培养箱中过夜培养。

2) 去除培养基，用无血清MEM培养基清洗细胞1次。

3) 将2 ml用无血清MEM培养基稀释的1 μmol/l的Liperfluo溶液加入6孔板中，在37℃ 5%的CO2培养箱中培养30 min。

4) 去除溶液，用2 ml HBSS清洗2次。

5) 均匀地加入2 ml用HBSS稀释的500 μmol/l的t-BHP (tert-Buthyl Hydroperoxide) 溶液，在37℃ 5%的CO2培养箱中培养60 min。

6) 用胰酶消化细胞后，用含有血清的MEM培养基重悬细胞，移至管中并将培养基更换为HBSS。

7) 用流式细胞仪检测 (激发波长：488 nm，发射波长：515-545 nm)。

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用Erastin诱导铁死亡细胞的荧光成像

1) 在 μ-slide 8孔板中 (ibidi公司) 接种A549细胞 (1.0×105个/孔、含血清DMEM培养基)，在37℃ 5%的CO2培养箱中过夜培养。

2) 去除培养基，加入200 μl用无血清DMEM培养基稀释的50 μmol/l的Erastin溶液，在37℃ 5%的CO2培养箱中过夜培养。

3) 去除培养基，用200 μl HBSS清洗2次。

4) 去除HBSS，加入200 μl用HBSS稀释的1 μmol/l的Liperfluo溶液，在37℃ 5%的CO2培养箱中培养30 min。

5) 去除溶液，用200 μl HBSS清洗2次。

6) 用激光共焦荧光显微镜观察 (激发波长：488 nm，发射波长：500-550 nm)。

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常见问题Q&A

Q1.文献实验方法：先加Liperfluo，后加药；说明书实验方法：先加药，后加探针， 哪种方法比较好？
A1: 都可以。

先加Liperfluo再加药

用共聚焦荧光显微镜观察HeLa细胞

（1）在μ-slide 8孔板中（ibidi公司）接种HeLa细胞（3.0×104个/孔、含血清MEM培养基），在37℃ 5%的CO2培养箱中过夜培养。

（2）去除培养基，用无血清MEM培养基清洗细胞一次。

（3）将200 μl无血清MEM培养基稀释后的1 μmol/l的Liperfluo溶液加入8孔板中，在37℃ 5%的CO2培养箱中培养30 min。

（4）去除溶液，用200 μl HBSS清洗2次。

（5）均匀地加入200 μl用HBSS稀释的500 μmol/l的t-BHP(tert-Buthyl Hydroperoxide) 溶液，在37℃ 5%的CO2培养箱中培养60 min。

（6）用共焦荧光显微镜观察 (激发波长：488 nm，发射波长：500-550 nm)。

先加药再加Liperfluo

（1）在 μ-slide 8孔板中 (ibidi公司) 接种A549细胞 (1.0×105个/孔、含血清DMEM培养基)，

在37℃ 5%的CO2培养箱中过夜培养。

（2）去除培养基，加入200 μl用无血清DMEM培养基稀释的50 μmol/l的Erastin溶液，

在37℃ 5%的CO2培养箱中过夜培养。

（3）去除培养基，用200 μl HBSS清洗2次。

（4）去除HBSS，加入200 μl用HBSS稀释的1 μmol/l的Liperfluo溶液，

在37℃ 5%的CO2培养箱中培养30 min。

（5）去除溶液，用200 μl HBSS清洗2次。

（6）用激光共焦荧光显微镜观察 (激发波长：488 nm，发射波长：500-550 nm)。
Q2. Liperfluo如果按照文献进行，先加探针，后加药，荧光淬灭时间为2小时可能无法满足实验，希望延长荧光时间，是否有好的方法？或者是否可以加荧光防淬灭剂？
A2: 关于荧光抗淬灭剂：由于抗淬灭剂的作用原理，有可能无法在实验中使用。

其他的改善方法：

(1)如果褪色的原因是由光源照射造成的褪色。可以尝试减小光源强度进行观测。

(2)清洗操作后长时间放置可能会造成探针向细胞外漏出。可考虑不清洗直接观察。
Q3.Liperfluo由于是活细胞荧光探针，如果铁死亡发生，导致细胞膜破裂后，荧光是否存在？
A3:由于Liperfluo是活细胞探针，对死细胞无法发挥出探针的正常性能。
Q4：培养基中酚红或血清对实验有没有影响？此外，在背景高或荧光弱的情况下有没有改善意见？
A4:可用于酚红或含血清培养基。但是，如果背景高，请用PBS替换。     此外，当背景较高时，Liperfluo可能会被光自然氧化，培养时也请尽量遮光。

(溶解后请务必用铝箔等遮光)。

荧光强度弱的情况下，即使反应时间延长，背景也会变高，所以不推荐。

因此，建议调整设备 (荧光观察)的条件。

1.增强激发光的强度。

2.延长曝光时间。
Q5：悬浮和贴壁细胞都可以使用Liperfluo染色吗？是否可以染色固定细胞
A5:悬浮和贴壁细胞，都可以使用。

有实验经验的：HL-60细胞(悬浮细胞)，CHO细胞·SH-SY5Y细胞(贴壁细胞)等，固定的细胞不能染色。

NA损伤定量试剂盒——DNA Damage Quantification Kit -AP Site Counting货号：DK02

NA损伤定量试剂盒——DNA Damage Quantification Kit -AP Site Counting货号：DK02
DNA损伤定量试剂盒
DNA Damage Quantification Kit -AP Site Counting
商品信息
储存条件：0-5度保存
运输条件：室温

特点：

•可以检测基因组DNA样品的碱基位点数量

•采用方便的比色法检测

•检测范围：40个碱基位点/ 1×105 碱基对DNA

选择规格：
20 samples

订购满5000元，200元礼品等你拿

凑单关联产品TOP5

NO.1.    Caspase-3 Assay Kit-Colorimetric-    细胞凋亡检测

NO.2.    Cell Viability Assay Kit    细胞增殖/毒性检测

NO.3.    ECGreen-Endocytosis Detection    外泌体细胞膜检测

NO.4.    Cellular Senescence Detection Kit    细胞衰老检测

NO.5.    Cellular Senescence Plate Assay Kit    细胞衰老培养板检测

 

试剂盒内含

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产品概述

DNA的氧化损伤是由于DNA与活性氧 (ROS) 尤其是羟自由基之间的相互作用造成的。由超氧阴离子和过氧化氢通过Fenton反应产生的羟自由基在DNA中产生多重修饰。羟自由基对脱氧核糖基团的氧化攻击将导致DNA释放自由碱基，产生链断裂、各种糖修饰以及单个无碱基位点 (AP位点) 。事实上AP位点是由ROS产生的损伤的主要类型。醛反应性探针 (ARP；N’-氨氧基甲基羰基肼-D-生物素) 特异性地与AP位点的开环上的醛基反应。通过这个反应可以检测到导致醛基形成的DNA修饰。用过量ARP试剂反应后，DNA上的所有AP位点均用生物素做了标签。可以用亲和素-生物素法，用连接到亲和素上的过氧化物酶或碱性磷酸酶做比色法检测来对这些带有生物素标签的AP位点进行计数。DNA损伤定量试剂盒包含用于检测每1×105个碱基对中1-40个AP位点的所有必需溶液。

＊本试剂盒仅适用于基因组DNA中无碱基位点 (Abasic Sites)的检测。

原理

DNA损伤在除了复制过程中的DNA聚合酶错误外，保留有机体遗传信息的DNA在体内还受到环境辐射，紫外线，化学物质（如烷基化剂）和代谢物（如活性氧）的破坏，接收。如果这些错误和伤害得不到适当的修复，它们将导致突变，从而导致癌症和衰老。

DNA损伤部位有修复结构，其中之一就是去除碱修复。此时，将出现一个称为AP位点的基础位点（apurinic/apyrimidinic位点）。换句话说，AP位点的检测是可以测量DNA损伤位点的有效方法。

ARP（N’-氨基氧基甲基羰基肼基-D-生物素）是已知可以与该AP位点进行生物素特异结合的试剂。-Nucleostain-DNA Damage Quantification Kit-AP Site Counting-是一种可以通过使用ARP将DNA生物素化并固定在96孔微板上，可以简单地定量样品DNA中的AP 位点的试剂盒。

该试剂盒包含具有与AP位点的标准DNA，并且可以使用HRP标记的链霉亲和素通过生物素检测方法对AP位点进行定量。

使用方法请看实验例。

*冷藏保存中或恢复到室温时，有时会在管状管中看到水滴状的液粒。

这是由干燥防止剂液粒化而成的，产品的性能没有问题。

＊本套装中含有加入了溶液的试剂组件。

溶液可能会粘附在试管或瓶盖的内壁上，因此在打开前应先摇匀

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技术信息

除试剂盒以外必要的物品

・10μl，200μl，1 ml微量移液器（可变型）

・200μl多通道移液器（可变型）

・培养箱（37℃）

・酶标仪

・0.5 ml，1.5 ml离心管

・离心机

・DNA纯化试剂盒

・纸巾

本公司出售各种DNA纯化试剂盒。

Get pureDNA Kit-Cell, Tissue(Code：GK03)

关于DNA提纯的问题，请咨询同仁化学。

操作方法

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常见问题Q&A

Q1: 是否可以创建40个以上AP位点/ 100,000个标准溶液？
A1:该试剂盒的标准DNA是0-40个AP位点/ 100,000ARP-DNA。但我们已经准备了多达50个AP站点/ 100,000个的ARP-DNA（暂时没有做到更多）。从理论上讲，可以制备更多的ARP-DNA，但这么做的话我们无法保证和保持校准线的线性程度。

如果要检测更高浓度的碱基损伤，但样品DNA没有相同浓度的损伤，您可以用0AP 位点-DNA（测定范围内稀释）后再进行测定，之后再换算实际AP数比较好。
Q2: AP位点是DNA的一个基本损伤位点，被用作氧化应激的指标，除了AP位点之外，还有其他氧化应激指标吗？
A2：我们创建了一个文档，概述了氧化应激的各种标记物。

从实验者的角度，描述了每种氧化应激标记的特性和检测样品的处理方法，因此请参考以下文档（日文）。

https://www.dojindo.co.jp/technical/beginner/stressmarker.pdf
Q3:建议在DNA的纯度为吸光度为1.8以上进行检测。是否能够测量至1.5？
A3:因为吸光度在1.5内没有做过类似实验，所以暂时无法确认。

我们用吸光度为1.6～1.7的DNA进行检测，但不能看到很大的变化。

所以推荐1.8或更高。

纯度低的话可能意味着蛋白质污染。低纯度蛋白质具有阻断作用，可能使DNA粘附在板上。

请使用尽可能高的纯度，因为它可能会阻止这种情况
Q4:是否可以存储提取的DNA而无需将其转换为ARP？
A4:存储是不可取的，因为这会增加AP位点的数量。 （冷藏和冷冻）

如果要在不进行ARP化的情况下进行存储，请使用乙醇沉淀，制粒并冷冻保存。AP站点确实是容易发生剪切的部位。

但是，如果以catallist free的状态保存的话，即使在3’侧有断开也不会影响ARP的检测。

相反，如果提取的DNA储存在非冷冻状态的环境中，

由自然产生的去除碱形成的AP位点是一个更重要的问题。

所以在这种情况下，如果你的样品在正确存储标准DNA是可以进行修饰的。

ARP修饰后AP位点稳定，建议提取后迅速进行APR处理。
Q5:这个试剂盒可以检测什么？
A5：您可以定量DNA中的AP位点。AP位点是[apurinic / appyrimidinic site]的缩写，作用于受损的DNA。一般在去除碱修复过程中会出现。DNA的损伤除了复制时DNA polymerase的错误之外，还受到紫外线，化学物质（如烷基化剂）和代谢物（如活性氧）的影响。

通过测定AP位点可以检测DNA损伤。
Q6:这个试剂盒能测定的样品数量是多少？
A6：20samples为20个样品。

每个Filtration Tube都有20个samples。

因为一个样品一般使用一个Filtration Tube，所以这个Tube的数量即是可测定的样品数。

20samples的测定用的板也是1块板。
Q7:96孔板和过滤管中有溶液剩余，请告诉我废弃的方法
A7:多余的溶液请在确认以下成分信息后，按照政策规定的废弃规则废弃。

<配套试剂成分>

・ARP-DNA standard solution（稀释水后废弃，不含有害成分）

・ARP solution（稀释后作废，不含有害成分）

・DNA binding solution（稀释水后废弃，不含有害成分）

・Washing buffer（稀释水后废弃，不含有害成分）

・HRP-Striptavidin（稀释水后废弃，不含有害成分）

・TE buffer（可溶于水，EDA・2NA 0.1%以下）

・Substrate solution（稀释水后废弃，不含有害成分）

氧化型/还原型谷胱甘肽定量试剂盒-GSSG/GSH Quantification Kit II货号：G263

氧化型/还原型谷胱甘肽定量试剂盒-GSSG/GSH Quantification Kit II货号：G263
氧化型/还原型谷胱甘肽定量试剂盒
GSSG/GSH Quantification Kit II
商品信息
储存条件：0-5度保存
运输条件：室温

特点：

● 细胞、组织样品均可检测

● 操作更加简单

● 试剂盒稳定性高

选择规格：
100 test
氧化应激与自由基检测方案

凑单关联产品TOP5

NO.1.    Liperfluo    细胞脂质过氧化物检测

NO.2.    FerroOrange    细胞亚铁离子检测

NO.3.    Cell Counting Kit-8    细胞增殖毒性检测

NO.4.    ROS Assay Kit -Highly Sensitive DCFH-DA-    ROS检测

NO.5.    Calcein-AM/PI Double Staining Kit    活死细胞双染检测

概述

谷胱甘肽 (γ-L-谷氨酰-L-半胱氨酰-甘氨酸) 是体内的一种三肽化合物，它参与抗氧化和药物代谢的过程，还是谷胱甘肽过氧化物酶、谷胱甘肽S-转移酶、巯基转移酶等的底物。谷胱甘肽通常以还原型状态(GSH) 存在，但是GSH在氧化应激的作用下会转化为氧化型状态 (GSSG)。因此GSH/GSSG的比值被认为是氧化应激研究的一个重要指标。

优势

1）可以进行氧化型谷胱甘肽（GSSG）、还原型谷胱甘肽（GSH）的分类定量。

2）操作简单，且可以同时检测多个样品。

操作步骤

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详见说明书

注意事项

试剂开封后各溶液的保存方法及保存时间

Substrate Working Solution：溶解后在-20℃可保存2个月

GSH Standard Solution：溶解后在-20℃可保存2个月

GSSG Standard Solution：溶解后在-20℃可保存2个月

Enzyme Working Solution：稀释后在4℃可保存2个月

Coenzyme Working Solution：用超纯水溶解后在-20℃可保存2个月

Masking Solution：用乙醇溶解后在4℃可保存2个月

其他材料

酶标仪（405或415 nm）、20 µl和200 µl移液器，多通道移液器、 96孔板、 5-磺基水杨酸 (SSA) 溶液 （点击购买）、 乙醇

常见问题Q&A

Q1:如何计算GSH浓度？
A1:根据标准曲线得到总谷胱甘肽（GSH+GSSG）的浓度，使用以下公式计算GSH浓度。
GSH浓度=总谷胱甘肽浓度-GSSG浓度×2
GSSG（氧化型谷胱甘肽）相当于两分子的GSH（还原型谷胱甘肽）。
因此，通过将GSSG浓度加倍从而得到GSH浓度。
Q2:是否可以通过添加Masking Reagent来掩盖源自GSSG的GSH？
A2:加入酶/辅酶之后，由GSSG产生的GSH先与DTNB反应，而还原为GSSG。GSSG生成的GSH不会被屏蔽。
Q3:本试剂盒与谷胱甘肽定量试剂盒（货号：T419）有什么区别？
A3:本试剂盒可以分别检测GSSG和GSH，而总谷胱甘肽定量试剂盒（T419）则无法实现。作为氧化应激指标的GSH和GSSG的比例更加受引研究人员关注。
Q4:显色效果弱怎么办？
A4:考虑以下原因：

原因1）本试剂盒的测量范围是0.5 μmol/l及以上，测量样品中所含的谷胱甘肽的量可能小于该值。

对策）本试剂盒无法测量不符合测量范围的样品，请考虑其他方法检测。例如HPLC方法。

也可以通过降低预处理的稀释率或增加样品量来增加检测样品的浓度。

注意：为了加强显色效果而延长显色时间，则无法获得标准曲线。

原因2）可能含有抑制荧光的物质。例如：与SH基团反应的化合物（马来酰亚胺）会干扰测量结果。

对策）由于无法通过预处理等去除这些化合物，因此请在不含有此类物质的情况下再检测。

原因3）反应中的pH值低，有可能抑制显色。

对策）1、测量时，请确保SSA浓度为1％或更低。当SSA浓度为1％或更高时，会抑制显色效果。

2、如果含有其他酸性物质，则在测量前用三乙醇胺等将其中和至pH 7，或将它们稀释至约1％或更低的酸浓度下进行反应。
Q5:该试剂盒可以检测多少样品？
A5:本试剂盒可以进行100次检测（使用1块96孔板）
当n=3时，可以检测9个样品。（样品未染色）
如果仅测量谷胱甘肽的总量，可以检测25个样品。
样品的布局例：通道1～6是GSSG浓度测定，通道7～12是总谷胱甘肽浓度测定。

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Q6:样品中有大量谷胱甘肽，如何稀释样品？
A6:用0.5％5-磺基水杨酸（SSA）水溶液稀释。
测量时样品中的SSA浓度应为0.5至1％。
如果SSA浓度高，则反应过程中的pH值会呈酸性，这可能会影响吸光度。
Q7:通过测量GSSG与GSH的比例可以得到什么？
A7:谷胱甘肽通常在体内以还原形式（GSH）存在，
因为它通过刺激（例如氧化应激）转化为氧化形式（GSSG）
GSH与GSSG之比是氧化应激的指标。

ROS Assay Kit -Highly Sensitive DCFH-DA-试剂货号：R252

ROS Assay Kit -Highly Sensitive DCFH-DA-试剂货号：R252
ROS检测
ROS Assay Kit -Highly Sensitive DCFH-DA-
商品信息
储存条件：-20度保存
运输条件：室温
选择规格：
100tests

 

凑单关联产品TOP5

NO.1.    Cell Counting Kit-8     细胞增殖毒性检测   

NO.2.    FerroOrange    细胞亚铁离子检测

NO.3.    Annexin V, FITC Apoptosis Detection Kit    细胞凋亡检测

NO.4.    GSSG/GSH Quantification Kit II    氧化型/还原型谷胱甘肽

NO.5.    Liperfluo    细胞脂质过氧化物检测

 

试剂盒内含

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产品概述

    ROS Reactive Oxygen Species 主要是在线粒体中合成 ATP时所产生的高活性氧簇。ROS对细胞内的信号传导和吞噬作用等免疫机能起着重要的作用。另一方面， ROS对DNA和蛋白质的氧化作用也是各种疾病和细胞衰老的原因之一。

最近的研究发现，由二价铁所诱发的芬顿反应所引起的一种新的细胞死亡方式（铁死亡，Ferroptosis）的研究领域里 ROS也被广泛关注，检测 ROS的需求和意义也在不断升高 1)。目前在检测 ROS时，使用最多的试剂是DCFH-DA。但是 DCFH-DA往往有灵敏度低、样品荧光与背景的差别不明显等问题 。本试剂盒是一种高灵敏度的ROS检测试剂盒，而且配套使用本试剂盒内附带的 Buffer，可以在相对更低的细胞毒性下对 ROS进行高灵敏度检测。

荧光特性

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技术信息

与市面现有试剂的比较

活性氧反应的选择性

高灵敏度DCFH-DA与常规DCFH-DA对活性氧（ROS）的反应性相同。
另外，由于具有与DCFH-DA相同的荧光特性（λex：505nm，λem：525nm），因此能够以相同的激发/荧光波长进行检测。

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检测灵敏度的比较

用DCFH-DA和ROS检测试剂盒-高灵敏度DCFH-DA-分别对过氧化氢（1×10 4细胞/ ml）处理的HeLa细胞进行染色，并比较细胞内ROS的荧光结果。结果显示，在任何检测仪器中，同仁化学ROS检测试剂盒-高灵敏度DCFH-DA都以比DCFH-DA拥有更高的灵敏度。

（1）荧光显微镜检测

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<检测条件>
Ex.488 nm / Em.500 -560 nm
细胞种类：HeLa细胞

（2）使用荧光酶标仪检测

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<检测条件>
Ex.490-520 nm / Em.510-540 nm
细胞种类：HeLa细胞

（3）使用流式细胞仪检测

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<检测条件>
FITC激发电压：215 V
细胞种类：HeLa细胞

实验例

一.Erastin处理的A549细胞的内在性ROS的检测

1. 向 ibidi 8-well plate中接种A549细胞 (1××104 cells/ml, DMEM, 10% fetal bovine serum, 1% penicillin-37°C 、 5% CO2培养箱内过夜培养 。

2. 去除培养基，加入用 DMEM培养基 稀释好的 50 μμmol/l的 Erastin溶液， 37°C 、 5% CO2培养箱过夜培养 。

3. 去除上清，HBSS清洗 2次 ，加入 Highly Sensitive DCFH-DA Dye working solution 37°C 、 5% CO2培养箱培养 30 min。

4. 去除Working solution HBSS清洗 2次 ，再次加入 HBSS，用荧光显微镜观察。

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二.LPS处理的巨噬细胞内源性ROS的检测

用LPS（脂多糖）处理的RAW264.7细胞中细胞内ROS的变化的荧光成像结果显示，LPS处理可增加细胞内ROS。

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<检测条件>
细胞内ROS（高灵敏度DCFH-DA染料）：Ex. 488 nm / Em.500 -560 nm

<实验操作>
1.在ibidi 8孔板中接种RAW264.7细胞（3×104细胞，DMEM，10％胎牛血清，1％青霉素-链霉素）
2.培养箱（37℃，5％）过夜培养
3.除去培养基，用HBSS洗涤细胞两次，然后添加用DMEM培养基稀释的500 ng / ml LPS
4.培养箱（37°C，5％CO2） 孵育20小时
5.除去上清液，用HBSS洗涤细胞两次，然后添加高灵敏度DCFH-DA染料工作液。
6.培养箱（37°C，5％CO2）培养30分钟
7.培养30分钟后除去工作溶，用HBSS洗涤细胞两次后再添加HBSS并用荧光显微镜观察。

三.柳氮磺吡啶(SSZ)引起的细胞内代谢变化

向A549细胞添加已知抑制胱氨酸/谷氨酸转运蛋白（xCT）的柳氮磺吡啶（SSZ）之后，确认了细胞内的ROS、ATP、α-谷氨酸（α-KG）、谷胱甘肽（GSH）的变化和谷氨酸释放量的变化。

结果显示，由于SSZ的添加，细胞内的ATP、谷胱甘肽（GSH）以及谷氨酸的释放量减少，细胞内的α-谷氨酸和ROS增加。

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常见问题Q&A

Q1:请告诉我一个试剂盒可以测多少个样品？
A1:可以测量的样品数量请参考以下内容。
・96-well plate：1块
・ibidi8-well   plate：6块
・35mm dish：5块
・6-well plate：5孔
Q2:有没有可以用作阳性对照的实验例？
A2：使用说明书上记载了经过过氧化氢处理的HeLa细胞的检测实验例。
Q3:Highly Sensitive DCFH-DA   working solution可以用Loading Buffer以外的溶液配置吗?
A3:为了减轻染色时对细胞的损伤，推荐使用附带的Loading   Buffer配置，Hanks’HEPES和HBSS也可以进行制备。如果用培养基进行制备时请使用无血清培养基。
Q4:染色后的清洗可以使用PBS代替HBSS吗？
A4：为了减轻对细胞的损伤推荐HBSS。如果手头没有HBSS的话，建议用培养基清洗。
Q5:用荧光显微镜检测时有什么注意事项吗？
A5：染料与ROS反应并氧化后发出荧光。如果激发光持续照射，则染料会被氧化，背景会上升，因此，在获取荧光成像图像时，请先调整明场环境下的焦点和参数，然后再获取荧光图像。

ROS Assay Kit -Photo-oxidation Resistant DCFH-DA-货号：R253

ROS Assay Kit -Photo-oxidation Resistant DCFH-DA-货号：R253
耐光型活性氧(ROS)检测试剂盒
ROS Assay Kit -Photo-oxidation Resistant DCFH-DA-
商品信息
储存条件：0-5度保存
运输条件：常温

特点：

● 可长时间持续观测ROS水平

● 染色后可PFA固定和免疫共染色

● 可用于多种仪器的检测

选择规格：
100tests

 

规格性状

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产品概述

ROS（Reactive Oxygen Species）主要是在线粒体中合成ATP时所产生的高活性氧簇。适量的ROS对细胞内的信号传导以及免疫机能都有促进作用，而过量的ROS对DNA和蛋白质所造成的氧化作用是导致多种疾病和细胞衰老的原因之一。

常见的细胞内ROS检测方法是利用DCFH-DA进入细胞内被ROS氧化后会发出荧光的特性进行检测。然而，DCFH-DA有灵敏度较低、染色后易从细胞内漏出、观察光所引起的自发荧光1)等问题。

ROS Assay Kit -Photo-oxidation Resistant DCFH-DA-克服了上述问题， 是一种比DCFH-DA灵敏度更高、进入细胞后可以与蛋白质结合抑制向细胞外漏出的荧光探针。更重要的是，它可以抑制由观察光所引起的自发荧光，可以更准确的反映细胞内ROS水平。另外，使用试剂盒内附带的Buffer进行观察，可以在尽量不伤害细胞的状态下检测细胞内的ROS。

1) M. Afzal, et al., “Method to overcome photoreaction, a serious drawback to the use of dichlorofluorescin in evaluation of reactive oxygen species” BBRC, 2003, 304, 619–624.

常见问题

相同实验条件下，检测结果的重现性差、由观察光引起荧光探针自发荧光的假阳性等问题是ROS检测的常见问题。而本试剂盒可以有效地解决上述问题。

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选择性对比

        Photo-oxidation Resistant DCFH-DA对各种活性氧(ROS)的选择性与DCFH-DA的选择性基本相同。另外，由于荧光特性（λex：505 nm; λem：525 nm）也相同，可以使用DCFH-DA相同的检测波长或Filter。

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性能比较表

同仁化学研究所的ROS荧光探针与市面上常见的ROS荧光探针的性能比较。

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关联产品：ROS Assay Kit -Highly Sensitive DCFH-DA-试剂  ←

抑制观察光造成的自发氧化

在未经任何刺激的正常HeLa细胞中，使用Photo-oxidation Resistant DCFH-DA染色细胞后，每5分钟观察一次细胞。结果显示，与一般的DCFH-DA相比，Photo-oxidation Resistant DCFH-DA可以改善观察光所引起的荧光探针的自氧化(假阳性)。

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<实验条件>

细胞系：HeLa(未经任何刺激，正常状态)

荧光显微镜(BZ-X800, KEYENCE)

GFP Filter: Ex= 450 – 490 nm, Em = 500 – 550 nm

拍摄时间间隔: 5 min

拍摄曝光时间: 1.5 sec

染色后的细胞固定

    一般的荧光探针在细胞固定后容易泄漏到细胞外造成荧光强度降低，而用本试剂盒染色HeLa细胞并加入过氧化氢后，用PFA进行细胞固定，然后通过荧光观察发现固定后的荧光强度几乎没有变化，而且染料基本都滞留在细胞内。

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检测灵敏度的比较

利用LPS诱导RAW264.7细胞炎症模型，比较Photo-oxidation Resistant DCFH-DA与一般的DCFH-DA检测ROS的区别。从实验结果可以看出，同仁化学研究所的探针的灵敏度更高。

① 荧光显微镜检测

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<检测条件>

GFP Filter: Ex = 450 – 490 nm, Em = 500 – 550 nm)

 

② 荧光酶标仪检测

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<检测条件>

Ex = 490 – 520 nm, Em = 510 – 540 nm

③ 流式细胞仪检测

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<检测条件>

Ex = 488 nm, Em = 515 – 545 nm)

检测例

LPS诱导后，细胞内ROS水平的监测

用ROS Assay Kit –Photo-oxidation Resistant DCFH-DA-染色RAW264.7细胞后，加入脂多糖(LPS)刺激细胞并开始实时监测细胞内的ROS水平。通过对检测结果的数值化分析可以看出，在LPS诱导10小时后，胞内的ROS水平明显开始升高。

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<检测条件>

细胞内ROS Photo-oxidation Resistant DCFH-DA Dye）

GFP Filter (Ex = 450 – 490 nm, Em = 500 – 550 nm)

 

<实验步骤>

1. 将RAW264.7细胞(2×105 cells/ml, DMEM, 10% fetal bovine serum, 1% penicillin-streptomycin)接种于黑色96-well孔板中。

2. 37℃、5% CO2培养箱过夜培养。

3. 去除培养基，用HBSS清洗细胞2次，添加Photo-oxidation Resistant DCFH-DA Dye Working solution。

4. 37℃、5% CO2培养箱内培养30 min。

5. 去除培养基，用HBSS清洗细胞2次，添加Highly Sensitive DCFH-DA Dye Working solution。

6. 37℃、5% CO2培养箱内培养30 min。

7. 去除培养基，用HBSS清洗细胞2次。添加含有500 ng/ml LPS的DMEM培养基，用荧光显微镜观察。

8. 每隔1小时检测荧光强度并绘制荧光强度/时间的曲线图。

 

与线粒体标记物Tom 20的共染色

使用本试剂盒染色HeLa细胞后加入过氧化氢，与Tom 20抗体进行免疫共染色，实现了胞内ROS水平与线粒体的形态的同时观察。该实验证明了本试剂盒可以完美解决传统ROS荧光探针无法用于免疫荧光染色的问题。

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<检测条件>

激光共聚焦显微镜

(蓝) DAPI: Ex = 405 nm, Em = 450-495 nm

(绿) Photo-oxidation Resistant DCFH-DA: Ex = 488 nm, Em = 500-550 nm

(紫) Alexa Fluor 647: Ex = 633 nm, Em = 640-700 nm

Scale bar：10 µｍ

FAQ

Q：每个试剂盒可以检测多少个样品？
A：可检测的样品数请参考下列信息： 

・ 96-well plate：1块板
・ ibidi 8-well plate：6块板
・ 35 mm dish：5块
・ 6-well plate：5个孔
Q：是否有可作为“阳性对照”的实验例？
A：产品的使用说明书中的“实验例2”有过氧化氢刺激HeLa的检测实例。请参考说明书实验例2的步骤1-5。
Q：是否可以使用Loading buffer以外的缓冲液来配制Working solution？
A：为了减小观测时对细胞的损伤，建议尽量使用Loading buffer来配制。另外，也可以使用 Hanks’ HEPES或HBSS来配制。如果需要用培养基配制，请使用无血清培养基。
Q：清洗细胞时，是否可以用PBS替代HBSS？
A：为了减小对细胞的损伤，建议尽量使用HBSS。如果手头没有HBSS，建议用培养基清洗细胞。
Q：在使用流式细胞仪检测时，建议在哪一步将贴壁细胞剥落？
A：参照使用说明书，建议在步骤6(药物刺激后并用HBSS清洗细胞之后)，将细胞剥离(胰酶消化)。胰酶消化后重新加入培养基，离心后用HBSS清洗1次，再次离心去上清之后，用HBSS重悬细胞用于检测

MDA检测试剂盒货号：M496

MDA检测试剂盒货号：M496
MDA检测
MDA Assay Kit
商品信息
储存条件：-20度保存，避光
运输条件：常温

特点：

● 细胞、组织样品均可检测

● 操作更加简单

● 采用荧光法灵敏度更高

选择规格：
100tests

产品概述

丙二醛(MDA)是脂质过氧化物分解后形成的一种化合物。因此，MDA 是检测细胞和组织中脂质过氧化物的最常见的指标之一，在氧化应激、铁死亡等领域的研究中被广泛使用。MDA Assay Kit 可以检测样品中的 MDA 浓度，通过硫代巴比妥酸（TBA）与水解产生的 MDA 反应形成的 TBA 复合体的吸光度或荧光强度来检测样品中的丙二醛（MDA）。试剂盒中配有抗氧化剂(Antioxidant)，可以防止样品在反应过程中发生不必要的氧化，从而确保获得准确的实验结果。

试剂盒内含

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测定原理

本试剂盒采用经典的TBA法，通过检测MDA/硫代巴比妥酸(TBA)复合体的荧光或吸光度来检测细胞或组织中的MDA浓度。此外，试剂盒中还附带MDA标准溶液，以便通过标准曲线检测样品中的MDA。

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产品特点

简化操作步骤

一般的MDA检测试剂盒(TBA法)，作为底物的硫代巴比妥酸(TBA)需要天平称量和高温加热溶解的步骤。而同仁化学研究所的MDA试剂盒中的TBA无需称量和加热溶解的操作，从而减少由于称量等造成的误差，使得实验结果的孔间差更小。同时，还可大幅缩短操作所需的时间。

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细胞、组织样品均可检测

细胞样品通过荧光法检测。组织样品可以根据样品中MDA的含量在荧光法和吸光度法之间自由选择。具体可参考下表。

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实验例

由于Erastin可以抑制xCT（胱氨酸/谷氨酸转运体），是最常见的铁死亡诱导剂之一。使用同仁化学研究所的MDA试剂盒检测Erastin处理的HepG2(人肝癌细胞)中MDA的变化。通过标准曲线(用BCA法蛋白定量校准后)，计算样品中MDA的浓度。可以发现，Erastin处理的细胞中，MDA含量明显上升。

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超氧化物歧化酶检测——SOD Assay Kit货号：S311
超氧化物歧化酶(SOD)检测试剂盒-WST
SOD Assay Kit
商品信息
储存条件：0-5度保存
运输条件：室温

特点：

● 可以检测细胞、组织等多种样品

● 准确性和灵敏度高

● 可以测定100%SOD抑制率

选择规格：
100tests

凑单关联产品TOP5

NO.1.    Cell Counting Kit-8     细胞增殖毒性检测   

NO.2.    ROS Assay Kit -Highly Sensitive DCFH-DA-    ROS检测

NO.3.    GSSG/GSH Quantification Kit II    氧化型/还原型谷胱甘肽

NO.4.    Caspase-3 Assay Kit -Colorimetric    细胞凋亡检测

NO.5.    DMPO    超氧阴离子和羟自由基检测

产品概述

超氧化物歧化酶 (SOD) 是一种重要的抗氧化酶，它可以催化超氧阴离子 (O2–) 的歧化反应，生成过氧化氢和单质氧。目前有很多种直接或间接地测量SOD活性的方法，在这些方法中，使用硝基蓝四唑 (氮蓝四唑NitroblueTetrazolium ，简称NBT) 的一种间接测量方法因其便捷、简单的使用方法而被广泛应用。但是NBT法存在一些缺点，例如生成的甲臜 (Formazan dye) 的水溶性较低，会和黄嘌呤氧化酶的还原型发生反应等问题。SOD检测试剂盒-WST®提供了更为简便的检测SOD的方法，它是利用同仁学研究所研发的高度水溶性四唑盐WST®-1(2-(4-碘苯基)-3-(4-硝基苯)-5-(2,4-二磺酸苯基)-2氢-四唑盐,二钠盐)，能与超氧阴离子(O2–) 反应生成一种水溶性的染料。WST®-1被超氧阴离子还原的比率与黄嘌呤氧化酶的活性线性相关，并且会被SOD所抑制 (见下图，即红色区域SOD反应优先发生，SOD反应完后蓝色区域WST®-1反应才能发生)。因此SOD或者SOD类似物的IC50(50%的抑制浓度)就能用比色法来测定。

特点
1)可以测定100%SOD抑制率。
2)不需要甲醛溶解操作，操作简单。
3)一次可以进行多样本的测定。
4)由于灵敏度高，可以提高样品的稀释倍率，所以可以抑制干扰物质带来的影响。

检测原理

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所需设备和材料

2-20 µl和20-200 µl的可调式移液器、多通道移液器，酶标仪（450 nm）、96孔板、37℃培养箱

操作步骤

用96孔板，制作样品到检测可在1小时内完成

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抑制曲线

                               Cu,Zn-SOD的抑制曲线

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实验例

高知大学的岛村等人对石茶制作的每一步都测定了其SOD活性。据报道，在制造过程中和微生物相关的需氧发酵和厌氧发酵极大地增加了SOD样活性，并且在发酵过程中抗氧化能力随着茶提取物成分的变化而改变。

“ 石茶生产过程中儿茶素含量和超氧阴离子清除活性的变化”，日本食品科学技术学会学报，55（12），640

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L：    新鲜树叶

SL： 蒸煮的树叶

PFL：预发酵（有氧条件下发酵几天）树叶

FL： 发酵（在厌氧条件下发酵数天）树叶

DL： 晒干（数天）树叶

食品抗氧化能力的检测

我们知道，许多由呼吸和各种外在因素产生的活性氧，会降低机体功能，促进各种疾病的发病和老化。
有越来越多对这此类现象的防御机制(抗氧化能力)的文章出现，关于利用食品所具有的抗氧化能力维持健康、预防疾病的研究也备受关注。

常见问题Q&A

Q1：“1 Unit”的定义是什么？
A1：1 Unit是指样品中的还原性染料（如细胞色素C，WST-1，NBT或XTT）与超氧阴离子之间的比色反应，50%被抑制时的点。例如如果不含任何SOD的样品溶液的O.D.值为1.0的话，那么另一个O.D.值为0.5的样品则被定义为具有1个单位的酶活性。可以使用这个单位来确定样品中的

SOD活性。使用不同染料或方法检测SOD活性，它们之间不具有可比性。
Q2：我能使用SOD标准品来确定样品溶液的SOD活性吗？
A2：可以。制备标准曲线，确定样品溶液的SOD活性。SOD Bovine Erythrocytes

（CAS# 9054-89-1，EC 1.15.1.1）能够从Sigma（Catalog# S2525）购得。
Q3：是否可以用动力学法来测定SOD活性？
A3：可以。因为在20分钟内的生色比率是保持一致的，可以测量直线上升阶段5分钟内的斜率来测定SOD活性。
Q4：如果样品自身带有较深的颜色，这样的样品可以使用吗？
A4：可以。稀释样品可以减小干扰，将样品孔的O.D.值减去Blank  2的O.D.值就可以扣除本底的颜色。但是如果样品溶液的SOD活性过低是不能检测出的。
Q5：如何能够制备更多的Dilution Buffer？
A5：Dilution Buffer为PBS。请按以下浓度配制：137 mM NaCl，2.7 mM KCl，

1.47 mM KH2PO4， 8.1 mM Na2HPO4，pH 7.4。
Q6：使用该试剂盒能否分别检测Mn-SOD和Cu/Zn-SOD？
A6：可以。要单独检测Mn-SOD活性，可以添加KCN阻断Cu/Zn-SOD活性。向样品中加入

1 mM的KCN可以完全阻断Cu/Zn-SOD活性。要测定Cu/Zn-SOD的活，可以用总的SOD活性减去Mn-SOD活性，就可以得到。
Q7：怎样保存样品？
A7：在-80℃可以保存1年。
Q8：能否使用该试剂盒检测超氧化物阴离子的水平？
A8：不必用这个试剂盒，可以使用WST-1来检测超氧化物。但是必须有一个检测样品溶液中超氧化物量的标准。因为超氧化物不稳定，而且会和其它物质反应，要确定系统中生成的超氧化物的总量是比较困难的。试剂盒中的黄嘌呤-黄嘌呤氧化酶体系可以被用作检测每个样品中超氧化物相对生成量的标准。

抗氧化能力检测试剂盒 (DPPH法 )货号：D678

抗氧化能力检测试剂盒 (DPPH法 )货号：D678
DPPH Antioxidant Assay Kit
DPPH Antioxidant Assay Kit
商品信息
储存条件：0-5度保存
运输条件：常温

特点：

● 即用型试剂盒、数据重现性好

● 配制试剂所需的时间大幅缩短

● 检测结果不易受pH, 溶剂等因素影响

选择规格：
100tests
500tests

规格性状

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产品概述

近年来的研究发现，人体内的抗氧化能力的降低与各种疾病的产生息息相关，因此人们对于具有抗氧化能力的功能食品的需求越来越高。 根据日本高知大学岛村等人的文献报道 1)，使用稳定的自由基 DPPH (2,2-Diphenyl-1-picrylhydrazyl)作为底物的抗氧化能力检测法是数据重现性最好的一种方法。本试剂盒依据岛村老师的检测方法，将DPPH法的过程进行了改良和标准化，解决了以往实验中孔间差较大、试剂配制过程繁冗等问题。

本试剂盒在日本高知大学农林海洋学部的岛村智子老师的指导下开发而成 。

1) T. Shimamura et al., Anal. Sci., 2014, 30, 717-721

操作时间大幅缩短

DPPH和Trolox在溶液状态下都不稳定，需要现配现用。特别是作为底物的DPPH，一般还需要检测吸光度来确定含量，因此操作的步骤和时间都十分冗长。本试剂盒已经将所需的试剂准备好并分成小份单独包装，检测前只需要溶解定容即可开始实验，大幅缩短了操作步骤和时间。(DPPH的溶解需要超声波振荡发生器)

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检测原理

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检测步骤

将试剂盒样品加至96孔板，培养30分钟后即可上机检测。

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将试剂盒样品加至96孔板，培养30分钟后即可上机检测。

检测结果不受各因素影响

用DPPH法检测抗氧化能力的时候，溶液中的pH以及溶剂的浓度等因素会对检测结果产生影响。本试剂盒通过优化操作步骤、调整溶液添加顺序等方法最大程度抑制pH和溶剂浓度对检测结果的影响。

pH对检测结果的影响                                                样品溶剂对检测结果的影响

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试剂盒内含的Assay Buffer可以保证检测反应在一定         样品量只占检测溶液体积的1/10(20 μl)，因此样品的

的pH下进行。                                                                 溶剂无论是水还是无水乙醇，都不影响最终检测结果。

IC50值的复孔差

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如果只用样品的抗氧化能力IC50值来评价，比较容易出现检测结果的波动。用标准物质(Trolox)和样品同时检测，通过Trolox等价活性值(TEAC)来评价的话，可以得到重现性高的检测结果。

TEAC（ μg TE/μg）= Trolox IC50 （μg/ml）/ Sample IC50（ μg/ml）

检测例

不同检测机构之间的检测结果的差异

下面3个不同的检测机构，使用本试剂盒检测已知的抗氧化物：没食子酸、儿茶酸、桑色素。用比色皿通过分光光度计检测Trolox等价活性值(TEAC)，结果显示3个检测机构之间的检测结果基本上没有差异。

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参考文献：T. Shimamura et al., NipponShokuhin Kagaku Kogaku Kaishi, 2007, 54, 482 – 487

分光光度计和酶标仪检测结果的一致性

按照上面的实验的同样的方法，改用酶标仪和96孔板进行检测并计算Trolox等价活性值(Trolox)，检测结果也高度一致。

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