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G267/DNA Damage Detection Kit – γH2AX- Deep Red

G267/DNA Damage Detection Kit – γH2AX- Deep Red,DNA损伤检测试剂盒,检测衰老细胞DNA损伤,DNA损伤中经常会出现DNA双链断裂，H2AX（一种组蛋白H2X的亚种），当出现DNA双链断裂时，会迅速而大量地被磷酸化。这种磷酸化的H2AX（γH2AX），作为DNA损伤的标志物，有望被用来作为评估化学物质，活性氧，紫外线，辐射等的遗传毒性和致癌性。近年来，γH2AX的检测也被用来作为评价细胞衰老的一种指标。该产品使用单克隆抗体实验室生产的抗γH2AX抗体。

货号：G267
DNA损伤检测试剂盒- – γH2AX　-深红色
Cellular Senescence Detection Kit – SPiDER-βGal共染，检测衰老细胞DNA损伤
储存条件：0-5°C，注意防止吸潮
运输条件：常温

选择规格：1 set

试剂盒内含

1 set
Anti yH2AX antibody x1
Secondary antibody -Green ×1
Blocking Solution 22 ml×1

性质

该试剂盒，可通过二抗的方法轻松检测出作为DNA损伤的指标γH2AX。本试剂盒内包含了实验所需的所有试剂，即使是第一次使用的人操作起来也很方便，并且我们还将介绍使用γH2AX作为指标的文献及实验例以供参考。

DNA损伤检测原理

DNA损伤中经常会出现DNA双链断裂，H2AX（一种组蛋白H2X的亚种），当出现DNA双链断裂时，会迅速而大量地被磷酸化。这种磷酸化的H2AX（γH2AX），作为DNA损伤的标志物，有望被用来作为评估化学物质，活性氧，紫外线，辐射等的遗传毒性和致癌性。近年来，γH2AX的检测也被用来作为评价细胞衰老的一种指标。

该产品使用单克隆抗体实验室生产的抗γH2AX抗体。

试剂盒特点

<试剂盒内已包含所有需要试剂>

所有试剂均已包含在试剂盒内，您可以马上检测并获得数据。

*对于多次染色和组织染色，请先查看常见问题中的“多次染色的注意事项”和“组织染色的注意事项”。

<操作简便>

细胞固定和膜渗透处理后，只需添加试剂盒中包含的试剂并进行洗涤即可进行染色。

<3色可选>

细胞固定和膜渗透处理后，只需添加试剂盒中包含的试剂并进行洗涤即可进行染色。

产品名称	荧光	激发发射波长
DNA Damage Detection Kit – γH2AX　- Green	绿色	λex : 494 nm、λem : 518 nm
DNA Damage Detection Kit – γH2AX　- Red	红色	λex : 550 nm、λem : 566 nm
DNA Damage Detection Kit – γH2AX　- Deep Red	深红色	λex : 646 nm、λem : 668 nm

细胞衰老实验例

在评估细胞衰老时，应使用多种衰老指标进行分析。

<细胞衰老实验例>

概要	检测指标	论文
在自噬不足的卫生细胞中检测到细胞衰老，相反，通过添加自噬诱导剂后，细胞衰老被抑制。	γH2AX、SA-β-gal、p16、p21	Laura Garcia-Prat, et. al., Nature, 2016, 529, 37.
在2型糖尿病模型中，证实了衰老指标活性增加，DNA损伤水平增加。	γH2AX、SA-β-gal、p21	Milad S. Bitar, et. al., Am J Physiol Endocrinol Metab, 2013, 305(8), E951.
在缺乏特定蛋白质（BRE）的小鼠成纤维细胞中，观察到细胞衰老明显增强。	γH2AX、SA-β–gal	W. Shi, M. K. Tang, Y. Yao, C. Tang, Y. L. Chui and K. K. Lee Sci Rep. , 2016, 6, 23506.
在棕榈酸处理的HepG2细胞中，染色质结构突变复合物之一SMARCD1减少，所有衰老指标的活性均得到增强。	γH2AX、SA-β-gal、p16、p21	I. Chisato, et. al., NPJ Aging Mech Dis., 2017, 3, 11.
在参与DNA修复的Ercc1基因缺陷小鼠中，证实了仅通过自发DNA损伤即会导致ROS水平升高和衰老诱导。	γH2AX、SA-β-gal、p16	R. R. Andria, et. Al., Redox Biology, 2018, 17, 259.

<结合其他指标的细胞实验例>

<染色条件>

将不同代数的WI-38细胞固定后，用细胞衰老检测试剂盒-SPiDER-βGal对其进行染色。

使用0.1％Triton-X / PBS进行膜渗透处理后，用该试剂盒对γH2AX进行染色。

<检测条件>

H2AX（深红色）：Ex.590-650 nm / Em.663-738 nm

SA-β-gal：Ex.533-557 nm / Em.570-640 nm

DAPI：Ex.340-380 nm / Em.435-485 nm

常见问题Q&A

Q：抗γH2AX抗体工作液和二抗工作液是否可以保存？
A：无法保存，请当天使用。
Q：可以使用试剂盒内含的封闭液以外，其他的试剂进行稀释抗体吗？
A：我们建议使用试剂盒内含的封闭液进行稀释。
用其他溶液稀释可能会增加背景。

Q：多重染色的注意点
A：由于该试剂盒使用源自小鼠的一抗，因此在共染色其他抗原时，请选择小鼠来源的一抗以外的一抗。
Q：组织染色的注意点
请注意，不能用于小鼠组织的组织染色。

当需要对小鼠组织进行染色时，抗小鼠抗体（荧光标记的二抗）会对小鼠组织中IgG的非特异性吸附，从而增加背景。

<试剂盒中包含的抗体信息>

	来源	交叉性
一抗	小鼠	人、小鼠
荧光标记的二抗	山羊	小鼠IgG

SG05/Cellular Senescence Plate Assay Kit – SPiDER-βGal试剂盒

SG05/Cellular Senescence Plate Assay Kit – SPiDER-βGal试剂盒,预先准备的细胞在该试剂盒随附的缓冲液中裂解。只需将荧光底物SPiDER-βGal加到细胞裂解液中，即可根据SA-β-gal活性检测荧光强度。即使在10 cm培养皿或其它容器中制备细胞，也可以通过在细胞裂解后将细胞裂解液转移到96孔板上来检测荧光强度。

货号：SG05
细胞衰老培养板检测试剂盒（SPiDER-βGal）
Cellular Senescence Plate Assay Kit – SPiDER-βGal
储存条件：0-5度保存
运输条件：室温

特点：

可用于SA-β-gal活性的定量和多个样品的评估
使用酶标仪检测

选择规格：20tests,100tests

关联产品TOP5

NO.1. Cellular Senescence Detection Kit 细胞衰老检测
NO.2. Cell Cycle Assay Kit 细胞周期检测
NO.3. Annexin V, FITC Apoptosis Detection Kit 细胞凋亡检测
NO.4. BCECF-AM 细胞内pH值检测
NO.5. Caspase-3 Assay Kit-Colorimetric- 细胞凋亡检测

试剂盒内含

20 tests	SPiDER-βGal Lysis Buffer Assay Buffer Stop Solution	×1 40 ml×1 1.5 ml×1 3ml×1
100 tests	SPiDER-pGal Lysis Buffer Assay Buffer Stop Solution	×5 100 ml×2 7.5ml×1 15ml×1

原理

该产品是一种试剂盒，可通过细胞培养板轻松检测SA-β-gal（细胞衰老相关的β-半乳糖苷酶）活性，SA-β-gal是衰老细胞的指标。 SPiDER-βGal是一种β-半乳糖苷酶检测试剂，只需将试剂添加到96孔板中，即可用于SA-β-gal活性的定量和多个样品的评估。
根据细胞数的SA-β-gal活性可以通过计算该细胞数，测量核酸（相关产物）的量或蛋白质的量来校正。并通过该试剂盒获得的测量值来评估衰老程度。

操作步骤

轻松量化衰老细胞

预先准备的细胞在该试剂盒随附的缓冲液中裂解。只需将荧光底物SPiDER-βGal加到细胞裂解液中，即可根据SA-β-gal活性检测荧光强度。
即使在10 cm培养皿或其它容器中制备细胞，也可以通过在细胞裂解后将细胞裂解液转移到96孔板上来检测荧光强度。

实验例

与荧光成像结果的相关性：

用平板分析法和细胞衰老检测试剂盒-SPiDER-βGal对不同传代水平的WI-38细胞进行荧光成像实验结果。

结果证实了在2种试剂盒中，SA-β-gal染色在高传代的WI-38细胞中荧光强度有明显增强。

请注意尽管初始细胞接种密度是相同的，但由于较高传代水平下衰老细胞的增殖率较低，因此平板分析时的细胞密度会有所不同。在本实验中我们用检测细胞核的细胞计数标准化试剂盒（货号：C544）获得的结果来校正SA-β-gal活性。
平板测定<检测条件>
EX:535 nm/Em:580nm
荧光数据<检测条件>
绿色：EX:488 nm/Em:500-600nm
（用细胞衰老检测试剂盒(货号SG03)对SA-β-Gal进行染色
蓝色：EX:405 nm/Em:450-495 nm
（用DAPI溶液进行核染色（货号：D523））

加药实验：

加入阿霉素后，我们使用该试剂盒对WI-38细胞进行了分析，阿霉素会增加线粒体活性氧（ROS）的产生。结果证实由于DNA损伤诱导的衰老，向WI-38细胞中添加阿霉素会引起SA-β-gal的染色强度增加。

＜检测条件＞

Ex:535 nm/Em:580 nm

注意事项

用微孔板分析细胞时，会由于孔中细胞的数量不同导致结果可能不同。在此情况下，有必要通过对细胞进行计数并检查蛋白质总量来校正（标准化）获得的测量值。使用细胞计数标准化试剂盒，只需将试剂加到细胞培养基中，即可通过对细胞核染色获得的荧光强度轻松检测细胞数量。

有关细胞计数标准化试剂盒（货号：C544）的产品信息请点击这里

常见问题Q&A

Q1：1个试剂盒可检测多少样品？
A1：

	20 tests	100 tests
检测数量	96孔板20个孔	1块96孔板
当n=3时	6个样品	30个样品

Q2：是否可以先诱导衰老然后在96孔板上进行检测？
A2：建议先用培养皿诱导细胞衰老，然后将细胞转移到96孔板中进行检测。
将未诱导衰老的细胞（对照）和诱导衰老的细胞（样品）放在同一块板上进行比较，如果在96孔板上诱导衰老时（取决于衰老诱导的天数），会发生细胞过度生长并导致细胞融合的情况。
另外即使预先接种少量细胞以避免融合，已经进行了衰老诱导处理的衰老细胞也可能不具有平板测定所需的灵敏度（细胞数）。
Q3：在96孔板上应接种多少细胞？
A3：最佳细胞数取决于细胞类型。
我们曾经在每个孔中接种1╳104个WI-38细胞进行实验。
更多详细操作，请参照说明书中的“实验例”。

SG03/Cellular Senescence Detection Kit – SPiDER-βGal-细胞衰老检测试剂盒

SG03/Cellular Senescence Detection Kit – SPiDER-βGal-细胞衰老检测试剂盒,本试剂盒检测SA-β-gal灵敏度高，方法简便。SPiDER-βGal是一种检测β-gal的新型试剂，具有细胞透膜性高，胞内荧光维持时间长的特点。本试剂盒不仅可以特异性地检测到活细胞中的SA-β-gal(用Bafilomycin A1抑制内源性β-galactosidase的活性)，也可以检测到固定细胞中的SA-β-gal(用McIlvaine缓冲液 (pH 6.0)。由于SPiDER-βGal和SA-β-gal反应后会产生很强且持续的荧光，因此SPiDER-βGal可被用于流式细胞仪来进行定量分析。

货号：SG03
细胞衰老检测试剂盒SPiDERβGal
Cellular Senescence Detection Kit – SPiDER-βGal
储存条件：0-5度保存
运输条件：室温

特点：

活细胞和固定细胞均可染色
可用共聚焦显微镜或流式细胞仪检测
可固定后与抗体共染色

选择规格：5assays

凑单关联产品TOP5

NO.1. Cell Counting Kit-8 细胞增殖毒性检测
NO.2. Mitophagy Detection Kit 线粒体自噬
NO.3. Cell Cycle Assay Kit 细胞周期检测
NO.4. Caspase-3 Assay Kit -Colorimetric 细胞凋亡检测
NO.5. Cellstain- Hoechst 33342 solution 细胞核染色检测

试剂盒内含
5 assays
[5 assays: 35 mm dish]
SPiDER-BGal X1
Bafilomycin A1 X1

产品概述

正常细胞的DNA损伤是由细胞的不断分裂和氧化应激引起。在没有修复DNA损伤的情况下，为了抑制细胞的癌化，需要不可逆地终止DNA损伤细胞的分裂。细胞衰老是一种可以不可逆地终止DNA损伤细胞分裂的状态，它可以抑制DNA受损细胞的生长。SA-β-gal (细胞衰老β-半乳糖苷酶)在衰老细胞中过表达，被广泛作为细胞衰老的标识之一。用X-gal染色检测SA-β-gal是一种常用的方法，但此方法存在几个缺点：

1)由于细胞透膜性差，需要固定细胞。

2)由于很难区分染色细胞和未染色细胞，所以定量困难。

3)染色时间长。

本试剂盒检测SA-β-gal灵敏度高，方法简便。SPiDER-βGal是一种检测β-gal的新型试剂，具有细胞透膜性高，胞内荧光维持时间长的特点。本试剂盒不仅可以特异性地检测到活细胞中的SA-β-gal(用Bafilomycin A1抑制内源性β-galactosidase的活性)，也可以检测到固定细胞中的SA-β-gal(用McIlvaine缓冲液 (pH 6.0)。由于SPiDER-βGal和SA-β-gal反应后会产生很强且持续的荧光，因此SPiDER-βGal可被用于流式细胞仪来进行定量分析。

原理

由于该试剂盒中的β-半乳糖苷酶检测试剂SPiDER-βGal具有细胞膜通透性，因此无需特别的细胞膜通透性处理或固定细胞，即可直接检测活细胞。穿透细胞膜的SPiDER-βGal通过与SA-β-gal反应发出荧光，并会与附近的蛋白质共价结合。另外，通过在加SPiDER-βGal之前，添加试剂盒内含的Bafilomycin A1，可抑制活细胞中内源性β-半乳糖苷酶的活性，并且抑制背景的状态下检测到SA-β-gal的荧光。

荧光特性

SPiDER-βGal和β-半乳糖苷酶反应的激发和发射光谱图

<推荐波长>

Ex：500~540 nm

Em：530~570 nm

用共聚焦显微镜或流式细胞仪（请选择488 nm激发波长）

操作步骤

产品优势

特点1：适用于活细胞和固定细胞

检测固定化细胞时，不需要添加Bafilomycin A1，按照说明书记载的操作流程检测SA-βgal。

*活细胞添加Bafilomycin A1的原因：请参阅常见问题“为什么添加Bafilomycin A1？”。

特点2：可定量检测

细胞衰老与细胞周期

细胞衰老与细胞周期之间的关系

阿霉素（DOX）会作用于细胞周期的G2/M期，抑制细胞增殖，并诱导细胞衰老。将DOX加入A549细胞后，G2/M期的峰值升高 (Cell Cycle Assay Solution Blue and Deep Red)衰老指标SA-β-gal增强（细胞衰老检测试剂盒-SPiDER-βGal）以及细胞线粒体膜电位降低(JC-1 MitoMP Detection Kit)。

实验例

与其他细胞衰老标记物的共染色

本实验是使用本试剂盒对细胞衰老的常用模型多次传代的Wl38细胞 (Passage 的 SA-βgal 进行检测的实例^a）。与其他的细胞衰老标记物γH2AX DNA损伤标记物）的免疫染色^b），以及全细胞的核染色（DAPI）^c）。SA-βgal和γH2AX两种细胞衰老标记物的实验结果相关性得到了验证。^d）

1）将传代1次和10次的Wl 38细胞按照本试剂盒的说明书的“活细胞检测”步骤进行SA-βgal染色。

2）添加4% PFA/PBS，室温培养15 min。

3）PBS清洗细胞3次。

4）加入0.1% Triton X 100/PBS，室温培养30 min。

5）PBS清洗细胞3次。

6）添加1% BSA/PBS，室温培养1 h。

7）用1% BAS/PBS稀释过的抗γH2AX抗体（兔源）加入至细胞后，过夜培养。

8）PBS清洗细胞3次。

9）用1% BAS/PBS稀释过的抗兔二抗（Alexa Fluor 647）加入至细胞后，室温培养2 h。

10）PBS清洗细胞3次。

11）用PBS稀释至 2μg/ ml 的 DAPI 溶液同仁货号： D523]加入到细胞中，室温培养10 min 。

12）PBS 清洗细胞3 次，用激光共聚焦显微镜观察。

固定WI-38细胞中SA- β-gal与DNA损伤标记物共染

SPiDER-βGal工作液配制

用pH 6.0的McIlvaine 缓冲液稀释SPiDER-βGal DMSO储存液2,000倍。

*固定操作和细胞膜通透性可能会导致灵敏度降低（图1），如果您需要更高的信号，可以将McIlvaine buffer稀释SPiDER-βGal DMSO储存液的倍数调整为500-1000倍（图2）。

McIlvaine buffer（pH6.0）的制备

将3.7ml 0.1 mol/l的柠檬酸溶液和6.3ml 0.2 mol/l的磷酸钠溶液混合。确认pH为6.0，如pH不是6.0，则可通过添加柠檬酸溶液或磷酸钠溶液来调价pH。使用超纯水将该缓冲液稀释5倍。

染色步骤（35 mm 培养皿）

1. 在35 mm 培养皿中接种细胞后，在37℃，5％ CO2培养箱中过夜培养。

2. 去除培养基，用2 ml PBS洗涤1次后，加入2 ml 4％的多聚甲醛(PFA)/PBS溶液，在室温固定3 min。

*避免延长培养时间，否则容易导致SA-β-gal活性降低

3. 去除上清液，用2 ml HBSS洗涤3次。

4. 加入2 ml SPiDER-βGal工作液后，在37℃培养30 min。

＊用固定细胞检测SA-β-gal时，请不要使用5％ CO2培养箱。如果使用5％ CO2培养箱，SPiDER-βGal工作液会变成酸性，与内源性β-galactosidase发生反应，背景会上升，很难区分正常细胞和衰老细胞。

5. 去除上清液，用2 ml PBS洗涤2次。

6.在细胞中加入0.1% Triton X-100/PBS，并在室温下培养30分钟。

7.用PBS洗涤细胞2次。

8.向细胞中加入1% BSA/PBS，并在室温中培养1小时。

9.向细胞中加入1% BSA/PBS稀释的抗γ-H2AX抗体（小鼠），并在4℃孵育过夜。

10.用PBS洗涤细胞3次。

11.向细胞中加入1％BSA/PBS稀释的抗小鼠二抗（Cy5），并在室温下孵育1小时。

12.用PBS洗涤细胞两次，并在荧光显微镜下观察。

SA-β-gal检测T细胞（悬浮细胞）

爱媛大学医学院Masakatsu Yamashita教授的研究小组表明，一种叫做menin的蛋白质可以控制T细胞的衰竭和衰老，并维持其正常的免疫功能。

这次通过使用的SPiDER-βGal染色结果确认，我们证实了在白细胞介素2（IL-2）的存在下，对敲除Menin蛋白的CD8阳性细胞通过刺激TCR（T细胞受体），会发生细胞衰老。

染色条件：

① SPiDER-βGal 方法

② X-gal 方法

*数据由爱媛大学医学系Masakatsu Yamashita教授提供

用共聚焦成像细胞仪进行定量用

用共聚焦成像细胞仪（横河电机株式会社CQ1 ）进行衰老细胞定量分析。

■与其他细胞衰老标记物共染色用

SPiDER-βGal 对 SA-β-gal 进行活细胞染色并进行细胞固定和膜透过处理后，对DNA损伤标志物γH2AX进行免疫荧光染色的 WI-38 细胞，通过共聚焦定量成像细胞仪进行定量和分析。

定量解析

散点图（Scatter Plot）

使用SPiDER-βGal对SA-β-gal 进行染色，其荧光强度作为 Y 轴，以 γ H2AX 的面积与每个细胞核的面积的比值作为 X 轴做成散点图的定量分析。

活细胞荧光染色的分析

X-gal法需要用目视观察总细胞数和衰老细胞的个数，并人工计算衰老细胞的阳性比率。

而使用共聚焦定量成像细胞仪时，用核染色剂（Hoechst 33342）来计数总细胞数 SPiDER-βGal对 SA-β-gal 进行染色来计算衰老细胞数，即可获得衰老细胞的阳性比率。

横河电机

CQ01 拍摄条件

使用孔板：96 孔板

物镜：10 倍

拍摄波长：405 nm Hoechst 33342 Cyan

488 nm （SPiDER-βGal Green）

视野：8视野

*SA-β-gal阳性Wl-38细胞（红色轮廓）

WI-38细胞中的SA-β-gal阳性细胞比例的差异取决于传代次数。与使用X-gal染色方法的手动计数操作相比，使用共聚焦可以快速分析数据。

SA-β-gal的荧光成像

1. 在35 mm μ-Dish（ibidi公司) 中分别接种传代数为0代和12代的Wl-38细胞 (5×10^4 个/dish、 10％ FBS、1％青霉素-链霉素的MEM培养基) 后，在37℃、5％ CO2培养箱中过夜培养。

2. 去除培养基，用2 ml HBSS洗涤1次。

3. 加入1 ml Bafilomycin A1工作液后，在37℃，5％ CO2培养箱中培养1 h。

4. 将1 ml SPiDER-βGal 工作液和1 μl浓度为1 mg/ml 的Hoechst 33342溶液混合后加入培养皿中，在37℃、5％ CO2培养箱中培养30 min。

5. 去除上清液，用2 ml HBSS洗涤2次.

6. 加入2 ml HBSS后，用共聚焦荧光显微镜观察(激发波长：488 nm，发射波长：500-600 nm)。

用流式细胞仪定量分析SA-β-gal阳性细胞

1. 在35 mm μ-Dish (ibidi公司) 中分别接种传代数为1代和12代的Wl-38细胞(1×10⁵ 个/dish，含有10％ FBS，1％青霉素-链霉素的MEM培养基)后，在37℃、5％ CO₂培养箱中过夜培养。

2. 去除培养基，用2 ml HBSS洗涤1次。

3. 加入1 ml Bafilomycin A1工作液后，在37℃、5％ CO₂培养箱中培养1 h。

4. 加入1 ml SPiDER-βGal工作液后，在37℃，5％ CO₂培养箱中培养30 min。

5. 去除上清液，用2 ml HBSS洗涤2次。

6. 用胰蛋白酶消化细胞，将细胞用MEM培养基 (含有10%的FBS、1%的青霉素-链霉素)重悬。

7. 用流式细胞仪检测 (激发波长：488 nm，发射波长：515-545 nm)。

常见问题Q&A

Q1: 本试剂盒的大概可以检测多少次？
A1:大概的检测次数，请参考下表中不同的使用容器：

	35mm dish	Micro Plate	Chamber Slide
使用次数	5 dishes	2 plates	7 slides

*使用次数会随着每孔添加的染色溶液量的变化而变化。使用前请先确认每孔的必要的染色溶液量。
Q2: 为什么要添加Bafilomycin A1？
A2：很多细胞内部都存在内源性β-半乳糖苷酶 (β-galactosidase)，由于SPiDER-βGal与内源性β-半乳糖苷酶和细胞衰老的标记物SA-β-Gal都会发生反应。即使在没有衰老的细胞中，背景也较高，妨碍了SA-β-Gal的检测。

Bafilomycin A1可以抑制溶酶体中的ATPase活性，并将溶酶体中的pH从酸性变为接近中性，从而降低了内源性β-半乳糖苷酶的活性。因此，在添加SPiDER-βGal之前先用Bafilomycin A1处理细胞，使得SPiDER-βGal可以与SA-β-gal反应，并对衰老细胞进行荧光染色。

下图显示了添加和不添加Bafilomycin A1时检测SA-β-gal的差异。

由于Bafilomycin A1也被用作自噬的抑制剂。使用时，请考虑是否会对实验体系有影响，如果有影响，建议固定细胞。细胞固定时，缓冲液会控制细胞内的pH，所以不需要使用Bafilomycin A1。可以参照操作说明书中的步骤进行染色。

Q3: DMSO stock solution 可以稳定保存多久？
A3: SPiDER-βGal DMSO stock solution和Bafilomycin A1 DMSO stock solution配制后，-20℃可以稳定保存1个月。
Q4: Working solution可以稳定保存多久？
A4: SPiDER-βGal working solution和Bafilomycin A1 working solution无法长期保存，请现配现用。
Q5: 做细胞衰老的荧光观察时有哪些注意事项？
A5: 随着细胞的衰老，被称为脂褐素(Lipofuscin)的不溶性物质会在细胞中积聚。脂褐素自身会产生荧光，进而增加荧光背景。在这种情况下，我们建议您准备不含SPiDER-βGal的样品，以准确评估衰老细胞中的SA-β-gal活性。
流式细胞仪检测
・测定“衰老细胞”和“正常细胞”的平均荧光强度（MFI）
①添加了SPiDER-βGal的细胞
②未添加SPiDER-βGal的细胞 (背景)
・“①的平均荧光强度”减去“②的平均荧光强度”
用扣除背景后的SA-β-gal的荧光来表征SA-β-gal的活性。
a：SA-β-gal活性（衰老细胞）：＝①的平均荧光强度 – ②的平均荧光强度
b：SA-β-gal活性（正常细胞）：＝①的平均荧光强度 – ②的平均荧光强度
・通过比较上述a和b的值来评价SA-β-gal的活性。
另外，通过a减去b的差值可以确定细胞衰老所引起的SA-β-gal活性的变化。
荧光显微镜检测
・首先，使用未添加SPiDER-βGal的衰老细胞进行荧光观察。
・调整灵敏度（Gain等），直至来生自脂褐素的荧光（背景）不影响荧光图像为止。
・在相同的成像条件下，再对添加了SPiDER-βGal的细胞或正常细胞进行荧光观察。
Q6: 细胞固定后还可以对SA-β-gal进行染色吗？
A6: 可以。如果固定细胞，则不需要用Bafilomycin A1预处理细胞，但是需要制备pH调节至6的Mcllvain Buffer。详细的操作请参考操作说明书。
Q7: 请问是否有细胞固定后进行流式细胞仪操作的具体步骤？
A7: 可以。但是请注意细胞固定可能会影响SA-β-gal（请参考下面的*2）
以下的实验例供作参考。
WI-38细胞固定后，进行SA-β-gal检测和γ-H2AX (DNA损伤标志物)的免疫染色。
<实验操作>
(1) 将WI-38细胞播种至35 mm dish，37℃，5% CO2培养箱中过夜培养。
(2) 去除上清，加入2 ml 4% Paraformaldehyde/PBS溶液，室温培养3 min*1。
(3) 用2 ml PBS清洗细胞3次。
(4) 添加2 ml SPiDER-βGal working solution *2, 37℃培养30 min*3。
(5) 用2 ml PBS清洗细胞2次。
(6) 加入2 ml 0.1% Tritox X-100/PBS, 室温培养30 min。
(7) 用2 ml PBS清洗细胞2次。
(8) 加入 2ml 1% BSA/PBS溶液，室温培养1 h。
(9) 用1% BSA/PBS溶液稀释过的抗γ-H2AX IgG(小鼠来源)，加入至细胞后室温培养1 h (10) 用2 ml PBS清洗细胞3次。

(11) 用1% BSA/PBS溶液稀释过的抗小鼠IgG(Cy5标记)，加入至细胞后室温培养1 h。

(12)去除上清，用2 ml PBS清洗细胞2次后进行荧光显微镜观察。

*1 细胞固定时间越长，对SA-β-gal活性的影响越高。
*2 细胞固定操作有可能会降低SA-β-gal的活性。如果检测SA-β-gal时，荧光强度较弱，请尝试将SPiDER-βGal DMSO stock solution 稀释500-1000倍使用。通常SPiDER-βGal DMSO stock solution 建议用Mcllvaine buffer (pH 6.0)稀释2,000倍使用。
*3 培养时不使用5% CO2培养箱。细胞固定后使用5% CO2培养箱的话，缓冲液会变为酸性，从而使得内在性β-galactosidase的活性上升，导致背景升高，无法辨别衰老细胞和年轻细胞的内的SA-β-gal活性的差值。
<实验数据>

图1. 免疫染色前后SPiDER-βGal染色的荧光强度变化
通过比较免疫染色前后的SPiDER-βGal的荧光强度，可以发现固定后的免疫染色过程中SPiDER-βGal的荧光强度降低了。

图2. 不同稀释倍率的SPiDER-βGal染色结果 (免疫染色后)

红色：SPiDER-βGal 蓝色：γ-H2AX <曝光时间: 1.5 s>
通过将SPiDER-βGal工作溶液的稀释比从2000倍更改为666倍，可以确认通过免疫染色（固定化）降低的SPiDER-βGal荧光强度与免疫染色前的强度相当。
Q8: 染色操作后发现荧光很弱，无法观察，请问是否有改善的方法？
A8: 请确认如下三个注意事项。
①使用的滤光片是否与染色试剂匹配。
<推荐的滤光片>
· 荧光显微镜：激发(500-540 nm)，荧光(530-570 nm)
· 流式细胞仪：激发(488 nm), 荧光(500-540 nm)
②各working solution是否为现配现用。
③延长染色时间
添加SPiDER-βGal working solution后，培养30 min后无法观察到荧光的话，考虑延长至45-60 min再进行荧光观察。
Q9: 确认含有SA-β-Gal的细胞染色后，是否可以进行细胞固定？
A9: 可以。建议使用4%的多聚甲醛进行细胞固定。
Q10: 培养基中的血清和酚红是否会影响检测？
A10: 培养基中的血清和酚红对SA-β-gal的检测没有影响。
Q11：衰老细胞和正常细胞没有差异时，应该怎么确认？
A11： STEP1：优化显微镜的观察条件。

STEP2：如果优化观察条件仍无法解决，请对染色条件进行优化。
STEP1＜优化显微镜的观察条件＞
如果衰老细胞和对照组细胞之间的荧光强度没有差异，请按照以下步骤进行调整。
1. 观察对照组细胞，通过降低激发光强度，Gain值或缩短曝光时间等条件将仪器调节至可以观察到微弱荧光的状态。
(共聚焦显微镜：调整Gain值、激发光强度落射型显微镜：调整曝光时间)
2. 慢慢增强激发光强度，延长曝光时间，观察衰老细胞的荧光变化，寻找到衰老细胞和对照组细胞之间的最大荧光差异的条件。
·如果两者荧光没有差异，请参考STEP2。
※请使用玻璃底的培养皿容器观察。
STEP2<染色条件的优化>
根据不同的细胞种类，可能需要调整SPiDER-βGal的染色时间和工作液浓度。
以下为最佳条件的参考数据。
染色时间：10-60 min
染色浓度：说明书中1/2-2倍的浓度
分别加入不同浓度的工作液，并调整不同的染色时间，寻找到衰老细胞和对照组细胞之间的最大荧光差异的条件。
*如果观察的细胞数少的话，有可能灵敏度不够。必要时，需要调整细胞数量

Q12.如何准备药物阳性对照组
A12：参考如下案例

衰老诱导（阿霉素处理的WI-38细胞）

1.将第3代的WI-38细胞（1×10^6细胞/皿，MEM，10％胎牛血清，1％青霉素-链霉素）接种在10 cm培养皿中，并在5％CO2中于37℃培养箱中培养过夜。
2.除去培养基，并用10 ml PBS洗涤细胞一次。
3.用无血清MEM制备0.2μmol/ L的阿霉素。如果没有无血清的培养基，可以使用含血清的培养基。
4.向培养皿中加入阿霉素（10 mL），并在5％CO2培养箱中于37℃培养3天。
5.除去上清液，并用10 ml PBS洗涤细胞一次。
6.向培养皿中加入MEM（10％胎牛血清，1％青霉素-链霉素），并在5％CO2恒温箱中于37℃培养3天。
7.除去培养基，并用10 ml PBS洗涤细胞一次。
8.胰酶消化细胞，分别用阿霉素和不用阿霉素处理。
固定细胞成像
1.在8孔ibidi中准备细胞进行测定，并在5％CO2恒温箱中于37℃过夜培养细胞。
2.除去培养基。用PBS洗涤细胞一次。向细胞中加入4％多聚甲醛（PFA）/ PBS溶液，并在室温下孵育3分钟。
3.除去上清液。用PBS洗涤细胞两次。
4.混合SPiDER-βGal工作溶液（2 mL）和1mg / mL Hoehst 33342（2μl）。将混合溶液（200μl）加入孔中，并在37℃孵育30分钟。
*我们建议不要在固定细胞实验中使用5％CO2培养箱。如果在5％CO2培养箱中进行培养，则缓冲液的pH值可能会呈酸性。酸性pH导致内源性β-半乳糖苷酶活性的背景升高，因此很难区分正常细胞和衰老细胞。
5.除去上清液。用PBS洗涤细胞两次。
6.在荧光显微镜下观察细胞。

SG02/SPiDER-βGal试剂

SG02/SPiDER-βGal试剂,SPiDER-βGal透过细胞膜后，在β-半乳糖苷酶的酶促反应下迅速生成醌甲基化物，该产物是一种亲电子化合物，可以和带有-SH等亲核功能基团的蛋白质结合产生荧光，并可以自我固定在细胞内的蛋白质上而滞留在细胞内。

货号：SG02
(2S,3R,4S,5R,6R)-2-{[3′-(Diethylamino)-5′-(fluoromethyl)-3H-spiro(isobenzofuran-1,9′-xanthen)-6′-yl]oxy}-6-(hydroxymethyl)tetrahydro-2H-pyran-3,4,5-triol
CAS号：1824699-57-1
储存条件：0-5度保存
运输条件：室温
分子式：C31H34FNO8
分子量：567.6

特点：

活细胞和固定细胞均可染色
可用共聚焦显微镜或流式细胞仪检测
可染色组织切片

选择规格：20μg*3

关联产品TOP5

NO.1. FerroOrange 细胞亚铁离子检测
NO.2. Glucose Assay Kit-WST 葡萄糖检测
NO.3. Liperfluo 细胞脂质过氧化物检测
NO.4. Lactate Assay Kit-WST 乳酸检测
NO.5. Lipi-Green 脂滴检测（绿色）

性质

源自大肠杆菌的β-半乳糖苷酶基因（lacZ）被广泛用作报告基因分析标记。X-gal染色被广泛用作检测β-半乳糖苷酶的典型方法，但是由于细胞膜通透性差，必须固定细胞和组织。另外由于常规的β-半乳糖苷酶检测荧光剂仅具有较低的细胞内滞留性，所以存在不能清楚地区分不表达β-半乳糖苷酶的细胞和表达β-半乳糖苷酶的细胞的问题。
为了克服这些问题，浦野、神谷等研究者成功开发出了具有细胞膜穿透性和细胞内滞留性的新荧光试剂SPiDER-βGal 。该试剂通过与β-半乳糖苷酶的酶促反应形成中间体醌甲基化物，并与蛋白质中的SH基等亲核基团形成稳定的共价键，并发出荧光。以此方式，将反应的试剂固定在细胞内蛋白上并具有优异的细胞内滞留性，结果证明可以在单个细胞水平上清楚地检测到表达β-半乳糖苷酶的细胞。

原理

SPiDER-βGal的细胞染色原理

SPiDER-βGal透过细胞膜后，在β-半乳糖苷酶的酶促反应下迅速生成醌甲基化物，该产物是一种亲电子化合物，可以和带有-SH等亲核功能基团的蛋白质结合产生荧光，并可以自我固定在细胞内的蛋白质上而滞留在细胞内。

操作步骤

加入试剂培养15分钟观察

用缓冲液清洗细胞后，在避光条件下培养15分钟，用荧光显微镜或流式细胞仪

加入SPiDER-βGal染色液。用缓冲液清洗细胞。观察。

实验例

组织的荧光成像

果蝇组织的实时成像
（数据由东京大学大学院医学系研究科浦野泰幸教授提供）

活细胞和固定细胞的荧光成像

SPiDER-βGal对HEK/LacZ细胞和细胞数比为1:1的HEK细胞的染色图
A.活细胞，B.固定细胞（4％PFA/PBS）
（绿色：SPiDER-βGal，蓝色：Hoechst 33342）

将HEK293细胞和β-半乳糖苷酶稳定表达的HEK/LacZ细胞以1:1的比例混合培养，分别在固定前和固定后用SPiDER-βGal染色，用共聚焦显微镜观察。证实了由于SPiDER-βGal具有很好的膜通透性和能在细胞内长时间滞留，可以在固定前和固定后进行荧光成像。

用流式细胞仪检测表达β-半乳糖苷酶的细胞

使用SPiDER-βGal通过流式细胞仪对HEK/LacZ细胞和HEK细胞分别进行检测。

将HEK293细胞和β-半乳糖苷酶稳定表达的HEK/LacZ细胞以1:1的比例混合并培养，并在用SPiDER-βGal染色后用流式细胞仪进行检测。通过在细胞中滞留的SPiDER-βGal，可以区分β-半乳糖苷酶稳定表达菌株（绿色）和非表达菌株（灰色）。

组织样品中的SA-β-gal检测

有研究人员发表了一篇论文，其中使用糖尿病模型小鼠的组织样本通过SPiDER-βGal检测到了SA-β-gal。

<组织样本的染色条件>
将快速冷冻的组织切片后，将其浸入4％多聚甲醛中，并在室温下培养20分钟。然后将20 μmol/l SPiDER-βGal加到用PBS洗涤过的样品中，并在37℃培养1小时。最后将样品用PBS洗涤并观察。

有关实验操作和数据的详细信息，请参阅以下参考文献中的5）。

荧光特性

SPiDER-βGal与β-半乳糖苷酶反应后的激发/发射光谱

<推荐滤波片>
激发：500-540 nm
荧光：530-570 nm
使用共聚焦激光显微镜和流式细胞仪
我们有使用488 nm激发进行检测的记录。

常见问题Q&A

Q：与现有方法相比是否有相关性以及这个方法的优点。
A：①可用于活细胞。我们证实与同样用于活细胞的GFP融合蛋白表达细胞的方法存在相关性。
（2）与GFP方法相比，即使固定后也可以观察到荧光。
（3）与现有的小分子量β-半乳糖苷酶荧光检测试剂相比，具有优异的“细胞膜通透性”和“细胞内滞留性”，因此可以在单个表达β-半乳糖苷酶的细胞上染色。
Q：除了Hanks’ HEPES以外，还可以用其它工作液吗？
A：可以使用PBS，HBSS等。
Q：工作液稳定吗？
A：不能长时间保存，需要现配现用。
Q：可以用流式细胞仪检测吗？
A：可以，用流式细胞仪可以检测β-半乳糖苷酶表达和未表达的HEK细胞的混合样品并分离。在说明上有操作步骤和实验条件。
Q：是否可以固定后再对样品染色？
A：可以，即使用4%的多聚甲醛或甲醇固定，也可以进行荧光观察。由于固定会降低β-半乳糖苷酶的活性，请摸索最佳固定条件。
Q：推荐的滤光片。
A：建议使用以下滤光片。
・荧光显微镜：激发（500-540 nm），荧光（500-540 nm）
・流式细胞仪：激发（488 nm），荧光（500-540 nm）
请参考说明书中的“激发/发射光谱”和实验例。
Q：样品染色后是否可以固定？
A：可以。即使将其固定在4％多聚甲醛或甲醇中，也可以观察到荧光。
Q：是否可以染组织？
A：可以。与细胞染色相比，组织染色需要增加工作液的浓度（例如10-20 μmol/l），我们有组织染色的实验例。

参考文献

1) Detection of LacZ-Positive Cells in Living Tissue with Single-Cell Resolution,Angew. Chem. Int. Ed. Engl.,2016,doi:10.1002/anie.201603328

2) Changes in expression of C2cd4c in pancreatic endocrine cells during pancreatic development,FEBS Lett.,2016,doi:10.1002/1873-3468.12271

3) A topically-sprayable, activatable fluorescent and retaining probe, SPiDER-βGal for detecting cancer; Advantages of anchoring to cellular proteins after activation ,Oncotarget,2017,doi:10.18632/oncotarget.17080.

4) Developmental vascular remodeling defects and postnatal kidney failure in mice lacking Gpr116 (Adgrf5) and Eltd1 (Adgrl4),PLoS ONE.,2017,10.1371/journal.pone.0183166.

5) Treatment of diabetic mice with the SGLT2 inhibitor TA-1887 antagonizes diabetic cachexia and decreases mortality,NPJ. Aging Mech. Dis.,2017, DOI:10.1038/s41514-017-0012-0.

6) Ecrg4 deficiency results in extended replicative capacity of neural stem cells in a Foxg1-dependent manner,Development,2019,doi:10.1242/dev.168120 .

7) Activity and intracellular localization of senescence-associated β-galactosidase in aging Xenopus oocytes and eggs,Exp. Gerontol.,2019,119,157.

8) β-Hydroxybutyrate Prevents Vascular Senescence through hnRNP A1-Mediated Upregulation of Oct4,Molecular Cell,2019,71,1064-1078.

9) Endothelial progeria induces adipose tissue senescence and impairs insulin sensitivity through senescence associated secretory phenotype,Nature Commun.,2020,11,481.

N512/Nucleolus Bright Red试剂

N512/Nucleolus Bright Red试剂,Nucleolus Bright是一种选择性与RNA结合并产生荧光的小分子荧光染料，只需在固定细胞中加入试剂即可成像。虽然Nucleolus Bright也会和在核仁以外存在的RNA反应，不过核仁作为细胞内RNA最多存在rRNA的产生场所，荧光尤为强烈。

货号：N512
核仁荧光染色试剂-红色
Nucleolus Bright Red
储存条件：冷暗处保存
运输条件：室温

特点：

高特异性核仁定位
可通过共聚焦定量细胞成像仪进行定量分析
两种颜色可供选择

选择规格：60 nmol

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NO.1. Cell Counting Kit-8 细胞增殖毒性检测
NO.2. Cytotoxicity LDH Assay Kit-WST 乳酸脱氢酶(LDH)检测
NO.3. Fura2-AM 细胞内钙离子检测
NO.4. FerroOrange 细胞亚铁离子检测
NO.5. Lactate Assay Kit-WST 乳酸检测

产品概述

Nucleolus Bright是一种选择性与RNA结合并产生荧光的小分子荧光染料，只需在固定细胞中加入试剂即可成像。虽然Nucleolus Bright也会和在核仁以外存在的RNA反应，不过核仁作为细胞内RNA最多存在rRNA的产生场所，荧光尤为强烈。

成像时，通过与核染色试剂DAPI[产品货号：D523]共染色，可以更清楚地确认核仁。有关详细信息，请参阅使用说明书中的实验例。

原理

核仁是不带膜的核内结构体，也是核糖体生物合成的起点。核仁中存在许多核糖体RNA(rRNA)，并且是 rRNA基因转录以及合成加工的场所。由于蛋白质合成的早期阶段在核仁中进行，因此核仁的变化被认为与多种细胞活动有关。核仁的形态变化已被公认为判断癌症的指标之一，近年来也有一系列的报道论述了核仁应激与DNA损伤、自噬、病毒感染和细胞衰老的关系，因此核仁在这些方面的研究也受到越来越多的关注。

核仁染色试剂的比较

※希望通过活细胞进行评价时，请咨询公司技术支持

产品特点

特点1：清晰地观察核仁

用4％ PFA或MeOH固定HeLa细胞后，用PBS洗净后用1％ Triton X-100进行破膜处理，加入Nucleolus Bright Green或Red和核染色

试剂 (DAPI) 并培养，然后用共聚焦荧光显微镜观察。

结果证实DAPI染色的细胞核内 (蓝色)有数个核仁存在。

<染色条件>

・PFA 固定

细胞在4％PFA室温下浸泡5 min，再用Triton X-100在室温下浸泡20 min，加入各种荧光探针后培养5 min。

・MeOH 固定

细胞在冷的MeOH中浸泡1 min，再用Triton X-100在室温下浸泡20 min，加入各种荧光探针后培养5 min。

<检测条件>

Nucleolus Bright Red Ex: 561 nm / Em: 565-650 nmNucleolus Bright Green Ex: 488 nm / Em: 500-600 nm

DAPI Ex: 405 nm / Em: 450-495 nm

特点2：核仁定位

用4％PFA固定WI-38细胞后，用抗Fibrillarin一抗和荧光标记的二抗免疫染色，并加入Nucleolus Bright Green或Red和核染色试剂

(DAPI) ，培养后，用落射式荧光显微镜 (Keyence，BZ-X710) 观察。

结果证实Nucleolus Bright Green和Nucleolus Bright Red与核仁标记物(Dense Fibrillar Component)的染色部位一致。

＜检测条件＞

Nucleolus Bright Green：Ex: 450-490 nm / Em: 500-550 nm

Nucleolus Bright Red：Ex: 533-548 nm / Em: 570-640 nm

DAPI：Ex: 340-380 nm / Em: 435-485 nm

Anti-Fibrillarin 抗体：Ex: 590-650 nm / Em: 668-733 nm

衰老细胞的评价例

将不同传代数的WI-38细胞用4％ PFA固定后，用PBS洗净并用1％ Triton X-100进行破膜处理，然后加入Nucleolus Bright Green或

Red和核染色试剂 (DAPI)，培养后用共聚焦荧光显微镜观察。

结果证实第3代细胞 (P3) 中的一个细胞核内存在多个核仁，而第18代细胞 (P18) 中核仁变大并成为一体。

<染色条件>

细胞在4％ PFA室温下浸泡5 min，再用Triton X-100在室温下浸泡20 min，加入各种荧光探针后培养5 min。

＜检测条件＞

Nucleolus Bright Green Ex: 488 nm / Em: 500-600 nm

Nucleolus Bright Red Ex: 561 nm / Em: 565-650 nm

DAPI Ex: 405 nm / Em: 450-495 nm

产品实验例

实验例：通过共聚焦定量细胞成像仪进行定量分析

使用共聚焦定量细胞成像仪 (横河电机株式会社 CQ1)对衰老细胞的定量分析。

将传代数不同的WI-38细胞固定后，分别用Nucleolus Bright Green和DAPI染色核仁，并用共聚焦定量细胞成像仪进行定量分析

通过图像对核仁进行分析

用共聚焦定量细胞成像仪在405nm处拍摄细胞核图像，在488nm处拍摄核仁体像，通过分析软件Cell Pathfinder识别各个细胞核内的核仁，并计算出其数量。

横河电机CQ1拍摄条件

使用板：96孔板

物镜：40倍

激发波长：

405nm（DAPI）：蓝色

488nm（Nucleolus Bright Green）：绿色

视野：16视野

<解析图像>

蓝框线：核

红框线：核仁

核仁数分析

在传代数较多的细胞中，得到了1个细胞核中只有1个核仁的比例增加，而2个及以上核仁的比例减少的结果。该结果与下述论文中衰老的WI-38细胞中核仁数的减少(论文中的Table3)^*1，以及通过SETD8敲低诱导衰老的细胞核仁的变化(论文中的Figure4D)^*2得到了相同的结果。

*1 P. M. Bemiller, L. Lee, “Nucleolar changes in senescing WI-38 cells”, Mech. Ageing Dev., 1978, 8 , 417.

*2 H. Tanaka, S. Takebayashi, A. Sakamoto, T. Igata, Y. Nakatsu, N. Saitoh, S. Hino, M. Nakao, “The SETD8/PR-Set7 Methyltransferase Functions as a Barrier to Prevent Senescence-Associated Metabolic Remodeling.”, Cell Rep., 2017, 18(9), 2148.

荧光特性

常见问题Q&A

Q1：可以染色活细胞吗？
A1：本试剂建议用于固定细胞染色，不建议用活细胞染色。如果您想用活细胞染色，请联系我们的技术支持。

SG05/Cellular Senescence Plate Assay Kit – SPiDER-βGal试剂盒

SG05/Cellular Senescence Plate Assay Kit – SPiDER-βGal试剂盒,该产品是一种试剂盒，可通过细胞培养板轻松检测SA-β-gal（细胞衰老相关的β-半乳糖苷酶）活性，SA-β-gal是衰老细胞的指标。 SPiDER-βGal是一种β-半乳糖苷酶检测试剂，只需将试剂添加到96孔板中，即可用于SA-β-gal活性的定量和多个样品的评估。

货号：SG05
细胞衰老培养板检测试剂盒（SPiDER-βGal）
Cellular Senescence Plate Assay Kit – SPiDER-βGal
储存条件：0-5度保存
运输条件：室温

特点：

可用于SA-β-gal活性的定量和多个样品的评估
使用酶标仪检测

选择规格：20tests,100tests

关联产品TOP5

试剂盒内含

20 tests	SPiDER-βGal Lysis Buffer Assay Buffer Stop Solution	×1 40 ml×1 1.5 ml×1 3ml×1
100 tests	SPiDER-pGal Lysis Buffer Assay Buffer Stop Solution	×5 100 ml×2 7.5ml×1 15ml×1

原理

操作步骤

轻松量化衰老细胞

实验例

与荧光成像结果的相关性：

用平板分析法和细胞衰老检测试剂盒-SPiDER-βGal对不同传代水平的WI-38细胞进行荧光成像实验结果。

结果证实了在2种试剂盒中，SA-β-gal染色在高传代的WI-38细胞中荧光强度有明显增强。

加药实验：

＜检测条件＞

Ex:535 nm/Em:580 nm

注意事项

有关细胞计数标准化试剂盒（货号：C544）的产品信息请点击这里

常见问题Q&A

Q1：1个试剂盒可检测多少样品？
A1：

20 tests	100 tests
检测数量	96孔板20个孔	1块96孔板
当n=3时	6个样品	30个样品

2：是否可以先诱导衰老然后在96孔板上进行检测？
A2：建议先用培养皿诱导细胞衰老，然后将细胞转移到96孔板中进行检测。
将未诱导衰老的细胞（对照）和诱导衰老的细胞（样品）放在同一块板上进行比较，如果在96孔板上诱导衰老时（取决于衰老诱导的天数），会发生细胞过度生长并导致细胞融合的情况。
另外即使预先接种少量细胞以避免融合，已经进行了衰老诱导处理的衰老细胞也可能不具有平板测定所需的灵敏度（细胞数）。
Q3：在96孔板上应接种多少细胞？
A3：最佳细胞数取决于细胞类型。
我们曾经在每个孔中接种1╳104个WI-38细胞进行实验。
更多详细操作，请参照说明书中的“实验例”。

G265/DNA Damage Detection Kit – γH2AX- Green

G265/DNA Damage Detection Kit – γH2AX- Green,该试剂盒，可通过二抗的方法轻松检测出作为DNA损伤的指标γH2AX。本试剂盒内包含了实验所需的所有试剂，即使是第一次使用的人操作起来也很方便，并且我们还将介绍使用γH2AX作为指标的文献及实验例以供参考。

货号：G265
DNA损伤检测试剂盒- – γH2AX　-绿色
Cellular Senescence Detection Kit – SPiDER-βGal共染，检测衰老细胞DNA损伤
储存条件：0-5°C，注意防止吸潮
运输条件：常温

选择规格：1 set

试剂盒内含
1 set
.Anti yH2AX antibody X1
.Secondary antibody – Green X1
.Blocking Solution 22 mlX1

性质

DNA损伤检测原理

该产品使用单克隆抗体实验室生产的抗γH2AX抗体。

试剂盒特点

<试剂盒内已包含所有需要试剂>

所有试剂均已包含在试剂盒内，您可以马上检测并获得数据。

*对于多次染色和组织染色，请先查看常见问题中的“多次染色的注意事项”和“组织染色的注意事项”。

<操作简便>

细胞固定和膜渗透处理后，只需添加试剂盒中包含的试剂并进行洗涤即可进行染色。

<3色可选>

细胞固定和膜渗透处理后，只需添加试剂盒中包含的试剂并进行洗涤即可进行染色。

产品名称	荧光	激发发射波长
DNA Damage Detection Kit – γH2AX　- Green	绿色	λex : 494 nm、λem : 518 nm
DNA Damage Detection Kit – γH2AX　- Red	红色	λex : 550 nm、λem : 566 nm
DNA Damage Detection Kit – γH2AX　- Deep Red	深红色	λex : 646 nm、λem : 668 nm

细胞衰老实验例

在评估细胞衰老时，应使用多种衰老指标进行分析。

<细胞衰老实验例>

概要	检测指标	论文
在自噬不足的卫生细胞中检测到细胞衰老，相反，通过添加自噬诱导剂后，细胞衰老被抑制。	γH2AX、SA-β-gal、p16、p21	Laura Garcia-Prat, et. al., Nature, 2016, 529, 37.
在2型糖尿病模型中，证实了衰老指标活性增加，DNA损伤水平增加。	γH2AX、SA-β-gal、p21	Milad S. Bitar, et. al., Am J Physiol Endocrinol Metab, 2013, 305(8), E951.
在缺乏特定蛋白质（BRE）的小鼠成纤维细胞中，观察到细胞衰老明显增强。	γH2AX、SA-β–gal	W. Shi, M. K. Tang, Y. Yao, C. Tang, Y. L. Chui and K. K. Lee Sci Rep. , 2016, 6, 23506.
在棕榈酸处理的HepG2细胞中，染色质结构突变复合物之一SMARCD1减少，所有衰老指标的活性均得到增强。	γH2AX、SA-β-gal、p16、p21	I. Chisato, et. al., NPJ Aging Mech Dis., 2017, 3, 11.
在参与DNA修复的Ercc1基因缺陷小鼠中，证实了仅通过自发DNA损伤即会导致ROS水平升高和衰老诱导。	γH2AX、SA-β-gal、p16	R. R. Andria, et. Al., Redox Biology, 2018, 17, 259.

<结合其他指标的细胞实验例>

<染色条件>

将不同代数的WI-38细胞固定后，用细胞衰老检测试剂盒-SPiDER-βGal对其进行染色。

使用0.1％Triton-X / PBS进行膜渗透处理后，用该试剂盒对γH2AX进行染色。

<检测条件>

H2AX（深红色）：Ex.590-650 nm / Em.663-738 nm

SA-β-gal：Ex.533-557 nm / Em.570-640 nm

DAPI：Ex.340-380 nm / Em.435-485 nm

常见问题Q&A

当需要对小鼠组织进行染色时，抗小鼠抗体（荧光标记的二抗）会对小鼠组织中IgG的非特异性吸附，从而增加背景。

<试剂盒中包含的抗体信息>

	来源	交叉性
一抗	小鼠	人、小鼠
荧光标记的二抗	山羊	小鼠IgG

G266/DNA Damage Detection Kit – γH2AX- Red

货号：G266
DNA损伤检测试剂盒- – γH2AX　-红色
Cellular Senescence Detection Kit – SPiDER-βGal共染，检测衰老细胞DNA损伤
储存条件：0-5°C，注意防止吸潮
运输条件：常温

选择规格：1 set

试剂盒内含
1 set
.Anti yH2AX antibody x1
. Secondary antibody -Green ×1
.Blocking Solution 22 ml×1

性质

DNA损伤检测原理

该产品使用单克隆抗体实验室生产的抗γH2AX抗体。

试剂盒特点

<试剂盒内已包含所有需要试剂>

所有试剂均已包含在试剂盒内，您可以马上检测并获得数据。

*对于多次染色和组织染色，请先查看常见问题中的“多次染色的注意事项”和“组织染色的注意事项”。

<操作简便>

细胞固定和膜渗透处理后，只需添加试剂盒中包含的试剂并进行洗涤即可进行染色。

<3色可选>

细胞固定和膜渗透处理后，只需添加试剂盒中包含的试剂并进行洗涤即可进行染色。

产品名称	荧光	激发发射波长
DNA Damage Detection Kit – γH2AX　- Green	绿色	λex : 494 nm、λem : 518 nm
DNA Damage Detection Kit – γH2AX　- Red	红色	λex : 550 nm、λem : 566 nm
DNA Damage Detection Kit – γH2AX　- Deep Red	深红色	λex : 646 nm、λem : 668 nm

试剂盒实验例

在评估细胞衰老时，应使用多种衰老指标进行分析。

<细胞衰老实验例>

概要	检测指标	论文
在自噬不足的卫生细胞中检测到细胞衰老，相反，通过添加自噬诱导剂后，细胞衰老被抑制。	γH2AX、SA-β-gal、p16、p21	Laura Garcia-Prat, et. al., Nature, 2016, 529, 37.
在2型糖尿病模型中，证实了衰老指标活性增加，DNA损伤水平增加。	γH2AX、SA-β-gal、p21	Milad S. Bitar, et. al., Am J Physiol Endocrinol Metab, 2013, 305(8), E951.
在缺乏特定蛋白质（BRE）的小鼠成纤维细胞中，观察到细胞衰老明显增强。	γH2AX、SA-β–gal	W. Shi, M. K. Tang, Y. Yao, C. Tang, Y. L. Chui and K. K. Lee Sci Rep. , 2016, 6, 23506.
在棕榈酸处理的HepG2细胞中，染色质结构突变复合物之一SMARCD1减少，所有衰老指标的活性均得到增强。	γH2AX、SA-β-gal、p16、p21	I. Chisato, et. al., NPJ Aging Mech Dis., 2017, 3, 11.
在参与DNA修复的Ercc1基因缺陷小鼠中，证实了仅通过自发DNA损伤即会导致ROS水平升高和衰老诱导。	γH2AX、SA-β-gal、p16	R. R. Andria, et. Al., Redox Biology, 2018, 17, 259.

<结合其他指标的细胞实验例>

<染色条件>

将不同代数的WI-38细胞固定后，用细胞衰老检测试剂盒-SPiDER-βGal对其进行染色。

使用0.1％Triton-X / PBS进行膜渗透处理后，用该试剂盒对γH2AX进行染色。

<检测条件>

H2AX（深红色）：Ex.590-650 nm / Em.663-738 nm

SA-β-gal：Ex.533-557 nm / Em.570-640 nm

DAPI：Ex.340-380 nm / Em.435-485 nm

常见问题Q&A

当需要对小鼠组织进行染色时，抗小鼠抗体（荧光标记的二抗）会对小鼠组织中IgG的非特异性吸附，从而增加背景。

<试剂盒中包含的抗体信息>

	来源	交叉性
一抗	小鼠	人、小鼠
荧光标记的二抗	山羊	小鼠IgG

D677/DAPRed – Autophagy Detection 细胞自噬检测试剂

D677/DAPRed – Autophagy Detection 细胞自噬检测试剂,DAPRed是一种小分子荧光染料，可以用来检测自噬体及自噬溶酶体。由于其特殊的结构，在自噬体形成双层膜结构时染料可以进入其中，并在疏水环境中产生荧光。

货号：D677
细胞自噬检测试剂盒
DAPRed – Autophagy Detection
储存条件：0-5度保存，避光
运输条件：室温

特点：

操作流程简便
与LC3结果高度一致
可以动态观察细胞自噬

关联产品TOP5

NO.1. DALGreen – Autophagy Detection 细胞自噬检测
NO.2. Cell Counting Kit-8 细胞增殖毒性检测
NO.3. Caspase-3 Assay Kit-Colorimetric- 细胞凋亡检测
NO.4. Liperfluo 细胞脂质过氧化物检测
NO.5. Mitophagy Detection Kit 线粒体自噬检测

产品概述

细胞自噬是细胞内损坏的蛋白质或细胞器降解和循环利用的过程。
DAPRed是一种小分子荧光染料，可以用来检测自噬体及自噬溶酶体。由于其特殊的结构，在自噬体形成双层膜结构时染料可以进入其中，并在疏水环境中产生荧光。
DAPRed可以进入自噬体膜而发出荧光；而DALGreen可以在自噬溶酶体产生阶段发出荧光。因此DAPRed，DALGreen可以检测从自噬体的形成到自噬溶酶体的融合以及内容物分解的整个过程。

原理

当形成自噬体膜时，DAPRed可以掺入其中，并在脂溶性环境中产生荧光。

DAPRed的检测结果与细胞自噬标志物LC3的结果有很高的相关性。

试剂概要

使用前，请确认所用仪器可以检测到的荧光特性。

操作简便

操作流程只有一步-加入试剂
无需基因转染。只需向准备好的细胞加入DAPRed染料，即可方便快捷的进行荧光检测。

实验例

DAPRed和DAL Green的共染
用自噬体荧光试剂DAPRed和自噬溶酶体荧光试剂DALGreen对HeLa细胞进行共染后，通过饥饿培养诱导自噬。

·结果

在不含氨基酸的培养基中培养的HeLa细胞，DAPRed和DALGreen荧光增强。

·检测条件
DAPRed：EX. 561 nm / Em. 600-700 nm
DALGreen：EX. 488 nm / Em. 500-563 nm
比例尺：20 μm

·自噬诱导条件
用DAPRed和DALGreen染色后的HeLa细胞分别在增殖型培养基和不含氨基酸的培养基中培养5 h后，用共聚焦显微镜观察。

DAPRed荧光光谱

常见问题Q&A

Q1: DAPRed Working Solution的稳定性如何？

A1: 无法长期保存，需要现配现用
Q2: DAPRed DMSO Stocking Solution的稳定性如何？

A2: 配制后请于-20℃保存，一个月内可保持稳定。另外建议根据用量分装保存。
Q3: 推荐使用的滤光片？

A3: 推荐的滤光片如下：
激发波长：500-560 nm

发射波长：690-750 nm

Q4: 如何确定细胞自噬探针DAPRed的最佳浓度？

A4:由于本试剂的特性，如果试剂的浓度太高或太低都会导致诱导自噬的样品组与未诱导自噬的对照组之间的差别不明显。建议参考以下信息摸索试剂的最佳浓度：

探针的最佳浓度根据细胞的种类而不尽相同。以DAPRed为例可以考虑从最低浓度(可以以0.05μmol/l作为参考)开始分别多个梯度至摸索至最高浓度(可以以0.4 μmol/l作为参考)的步骤进行摸索。

参考例

我们公司对HeLa, HepG2, CHO细胞的最佳浓度进行了摸索。DAPRed以下列浓度进行染色，并在无氨基酸的培养基中培养以诱导自噬。下表中红色字体的浓度可明显观察到实验组与空白组的差异。

[HeLa细胞]

[HepG2细胞]

[CHO细胞]

<检测条件>放大倍率：20倍；激发波长：Ex：561 nm；发射波长：Em：600-700 nm

Q5: 自噬有哪些途径？DAPRed可以检测到哪些状态？

A5: 众所周知，自噬根据其分子机制可以分为两种：一种是依赖于ATG5的传统自噬(LC3发生变化），另一种则是非依赖于ATG的选择性自噬（LC3形式的转化并未发生）。
当形成自噬体膜时，DAPRed可以掺入其中，并在脂溶性环境中产生荧光。因此DAPRed可以检测自噬体的状态。

*参考资料：发现新的自噬机制Shigeomi Shimizu

https://www.dojindo.co.jp/letterj/160/review/01.html

文献链接：http://dx.doi.org/10.14348/molcells.2018.2215

▶对于首次检测的细胞类型和实验条件，请参考FAQ[如何确定细胞自噬探针DAPRed的最佳浓度]。

参考文献

No.	检测样品	检测仪器	引用(含链接)
1)	细胞 (HUVEC)	荧光显微镜	X. Chen, X. Yan, J. Liu and L. Zhang, ” Chaiqi decoction ameliorates vascular endothelial injury in metabolic syndrome by upregulating autophagy.”, Am. J. Transl. Res., 2020,12(9), 4902.
2)	细胞 (HeLa)	荧光显微镜	H. Fang , S. Geng, M. Hao, Q. Chen, M. Liu, C. Liu, Z. Tian, C. Wang, T. Takebe, J-L Guan, Y. Chen, Z. Guo, W. He and J. Diao, “Simultaneous Zn2+ tracking in multiple organelles using super-resolution morphology-correlated organelle identification in living cells “, Nat Commun, 2021, 12(1), 109. 10.1016/j.envpol.2019.07.105.
3)	细胞 (HCT116; HCT8)	荧光显微镜	H. Sun, R. Wang, Y. Liu, H. Mei and X. Liu , “USP11 induce resistance to 5-Fluorouracil in Colorectal Cancer through activating autophagy by stabilizing VCP”, J Cancer , 2021, 12(8), 2317.
4)	细胞 (MEF)	荧光显微镜	M. Yagi, T. Toshima, R. Amamoto, Y. Do, H. Hirai, D. Setoyama, D. Kang and T. Uchiumi, “Mitochondrial translation deficiency impairs NAD+-mediated lysosomal acidification”, EMBO J, 2021, doi:10.15252/embj.2020105268.

MD01/Mitophagy Detection Kit-线粒体自噬

MD01/Mitophagy Detection Kit-线粒体自噬,线粒体 (Mitochondria) 是细胞中重要的细胞器之一，可以为细胞活力提供能量。近年有报道去极化线粒体的积累引起的阿尔茨海默病 (Alzheimer’s Disease) 与帕金森病(Parkinson’s Disease)，可能与线粒体自噬有关。线粒体自噬是一种清除机制，可以通过自噬，将氧化应激、DNA损伤因素导致功能失调的线粒体隔离包裹成自噬体(Autophagosome)，再与溶酶体 (Lysosome) 融合后降解。本试剂盒内含Mtphagy Dye (用于检测线粒体自噬) 和Lyso Dye (溶酶体染料)。Mtphagy Dye通过化学结合，固定在细胞内的线粒体上，会发出较弱的荧光。当线粒体发生自噬，损伤的线粒体会与溶酶体融合，pH会下降，变成酸性，此时Mtphagy Dye会产生较强的荧光。如想直观观察Mtphagy Dye标记的线粒体和溶酶体的结合，可联合应用试剂盒中的Lyso Dye (标记溶酶体) 进行双染。

货号：MD01
线粒体自噬检测试剂盒
Mitophagy Detection Kit
储存条件：0-5度保存
运输条件：室温

特点：

只需添加小分子量荧光试剂即可轻松检测线粒体
可以使用荧光显微镜进行活细胞成像
可以与附着的溶酶体染色剂同时染色

选择规格：1set

凑单关联产品TOP5

NO.1. Cell Counting Kit-8 细胞增殖毒性检测
NO.2. FerroOrange 细胞亚铁离子检测
NO.3. Cellular Senescence Detection Kit 细胞衰老检测
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NO.5. DAPGreen – Autophagy Detection 细胞自噬检测

试剂盒内含

1 set

.Mtphagy Dye
. Lyso Dye

×1管
×1管

产品概述

线粒体 (Mitochondria) 是细胞中重要的细胞器之一，可以为细胞活力提供能量。近年有报道去极化线粒体的积累引起的阿尔茨海默病 (Alzheimer’s Disease) 与帕金森病(Parkinson’s Disease)，可能与线粒体自噬有关。线粒体自噬是一种清除机制，可以通过自噬，将氧化应激、DNA损伤因素导致功能失调的线粒体隔离包裹成自噬体(Autophagosome)，再与溶酶体 (Lysosome) 融合后降解。本试剂盒内含Mtphagy Dye (用于检测线粒体自噬) 和Lyso Dye (溶酶体染料)。Mtphagy Dye通过化学结合，固定在细胞内的线粒体上，会发出较弱的荧光。当线粒体发生自噬，损伤的线粒体会与溶酶体融合，pH会下降，变成酸性，此时Mtphagy Dye会产生较强的荧光。如想直观观察Mtphagy Dye标记的线粒体和溶酶体的结合，可联合应用试剂盒中的Lyso Dye (标记溶酶体) 进行双染。

特点：

1）只需添加小分子量荧光试剂即可轻松检测线粒体

2）可以使用荧光显微镜进行活细胞成像

3）可以与附着的溶酶体染色剂同时染色

原理

记载了本产品的检测原理和实验例的论文请看MD01论文实验例中第四篇：Live Cell Imaging of Mitochondrial Autophagy with a Novel Fluorescent Small Molecule

实验例

1.用羰基氰化物间氯苯腙 (CCCP，一种线粒体解偶联剂) 诱导Parkin表达的HeLa细胞线粒体自噬，并通过荧光显微镜进行检测。另外，通过与线粒体染色试剂（MitoBright Deep Red:MT08）一同染色，能够区分出已发生自噬的的线粒体（白色）和未发生自噬的线粒体（紫色）（照片：右侧）。

波长：

Mtphagy Dye:561 nm (Ex)、650 LP nm (Em)

Lyso Dye:488 nm (Ex)、502-554 nm (Em)

MitoBright Deep Red:640 nm (Ex)、656-700 nm (Em)

2.荧光显微镜观察

HeLa细胞用CCCP处理，并与线粒体检测试剂（Mtphagy Dye）和线粒体染色试剂（MitoBright LT Green）共同染色，并经过一段时间（6小时）后进行检测。

<检测条件>

设备：LSM-700 Laser scanning confocal microscope (LSCM)

(Carl Zeiss, Oberkochen, Germany)

激发波长：

MitoBright LT Green 488 nm

Mtphagy Dye 555 nm

物镜：63x

拍摄时间：6小时

拍摄间隔：15秒

3.自噬诱导和线粒体膜电位变化关系的检测

用羰基氰化物间氯苯腙(CCCP，一种线粒体解偶联剂)诱导Parkin表达的HeLa细胞线粒体自噬，并使用线粒体自噬检测试剂盒（Mitophagy Detection Kit：MD01）和线粒体膜电位检测试剂盒（JC-1 MitoMP Detection Kit：MT09）观察荧光结果。

结果证实在未经CCCP处理的细胞中几乎未检测到线粒体自噬的发生，并且线粒体膜电位正常维持。另一方面，在添加了CCCP的细胞中，证实了线粒体膜电位的降低（JC-1的红色荧光降低）和线粒体自噬的发生（Mtphagy染料的荧光增强）。

<实验条件>

■将Parkin质粒导入HeLa细胞

使用HilyMax（货号：H357）将Parkin质粒引入HeLa细胞中（Parkin质粒/HilyMax试剂：0.1 μg/0.2 μl）

过夜培养后进行检测。

■线粒体自噬检测

向表达Parkin的HeLa细胞中添加0.1 μmol/l Mtphagy工作溶液，并在37°C下孵育30分钟。然后将细胞用HBSS洗涤，加入10 μg/ml CCCP/MEM溶液，并在37℃下孵育2小时。在荧光显微镜下观察细胞。

■线粒体膜电位检测

将10 μg/ml的CCCP/MEM溶液添加至表达Parkin的HeLa细胞中，并在37℃下孵育1.5小时。加入4 μmol/l的JC-1工作液使其终浓度达到2 μmol/l，并在37℃下孵育30分钟。孵育后，将细胞用HBSS洗涤，加入成像缓冲液，并在荧光显微镜下观察细胞。

<检测条件>

■线粒体自噬检测

Ex：561 nm，Em：570-700 nm

■线粒体膜电位检测

绿色Ex：488 nm，Em：500-550 nm

红色Ex：561 nm，Em：560-610 nm

荧光特性

参考文献

序号	检测对象	使用仪器	文献
1)	细胞（HeLa）	流式细胞仪	J. Koniga, C. Otta, M. Hugoa, T. Junga, A. L. Bulteaub, T. Grunea and A. Hohna, “Mitochondrial contribution to lipofuscin formation”, Redox Biology, 2017, 11, 673.
2)	细胞（KB）	荧光显微镜	K. Kameyama, “Induction of mitophagy-mediated antitumor activity with folate-appended methyl-β-cyclodextrin”, International Journal of Nanomedicine, 2017, 12, 3433.
3)	细胞（SH-SY5Y, 初代皮质神经细胞）	荧光显微镜	E. F. Fang, T. B. Waltz, H. Kassahun, Q. Lu, J. S. Kerr, M. Morevati, E. M. Fivenson, B. N. Wollman, K. Marosi, M. A. Wilson, W. B. Iser, D. M. Eckley, Y. Zhang, E. Lehrmann, I. G. Goldberg, M. S. Knudsen, M. P. Mattson, H. Nilsen, V. A. Bohr and K. G. Becker, “Tomatidine enhances lifespan and healthspan in C. elegans through mitophagy induction via the SKN-1/Nrf2 pathway”, Scientific Reports, 2017, 7, (46208), DOI: 10.1038/srep46208.
4)	细胞（HeLa、Parkin表达HeLa）	荧光显微镜	H. Iwashita, S. Torii, N. Nagahora, M. Ishiyama, K. Shioji, K. Sasamoto, S. Shimizu and K. Okuma, “Live Cell Imaging of Mitochondrial Autophagy with a Novel Fluorescent Small Molecule”, ACS Chem. Biol., 2017, 12, (10), 2546.
5)	细胞（Cardiomyocytes）	流式细胞仪	Y. Feng, NB. Madungwe, CV. da Cruz Junho and JC. Bopassa, “Activation of G protein-coupled oestrogen receptor 1 at the onset of reperfusion protects the myocardium against ischemia/reperfusion injury by reducing mitochondrial dysfunction and mitophagy.”, Br. J. Pharmacol., 2017, 174, (23), 4329.
6)	细胞（HCT116）	荧光显微镜	K. M. Elamin, K. Motoyama, T. Higashi, Y. Yamashita, A. Tokuda and H. Arima, “Dual targeting system by supramolecular complex of folate-conjugated methyl-β-cyclodextrin with adamantane-grafted hyaluronic acid for the treatment of colorectal cancer.”, Int. J. Biol. Macromol., 2018, doi: 10.1016/j.ijbiomac.2018.02.149.
7)	细胞（Parkin-HeLa）	流式细胞仪	N. Furuya, S. Kakuta, K. Sumiyoshi, M. Ando, R. Nonaka, A. Suzuki, S. Kazuno, S. Saiki and N. Hattori, “NDP52 interacts with mitochondrial RNA poly(A) polymerase to promote mitophagy.”, EMBO Rep. ., 2018, doi: 10.15252/embr.201846363.
8)	细胞（NKT）	流式细胞仪	L. Zhu, X. Xie, L. Zhang, H. Wang, Z. Jie, X. Zhou, J. Shi, S. Zhao, B. Zhang, X. Cheng and S. Sun, “TBK-binding protein 1 regulates IL-15-induced autophagy and NKT cell survival”, Nature Communications., 2018, 9, (1), doi:10.1038/s41467-018-05097-5.
9)	细胞（HeLa）	流式细胞仪	K. Araki, K. Kawauchi, W. Sugimoto, D. Tsuda, H. Oda, R. Yoshida and K. Ohtani, “Mitochondrial protein E2F3d, a distinctive E2F3 product, mediates hypoxia-induced mitophagy in cancer cells”, Commun Biol., 2019, DOI: 10.1038/s42003-018-0246-9.
10)	细胞（Bovine Sertoli）	荧光显微镜	E. Adegoke, S. Adeniran, Y. Zeng, X. Wang, H. Wang, C. Wang, H. Zhang, P. Zheng and G. Zhang , “Pharmacological inhibition of TLR4/NF-κB with TLR4-IN-C34 attenuated microcystin-leucine arginine toxicity in bovine Sertoli cells.”, J Appl Toxicol., 2019,doi: 10.1002/jat.3771.
11)	组织（小鼠）	荧光显微镜	E. F. Fang, Y. Hou, K. Palikaras, B. A. Adriaanse, J. S. Kerr, B. Yang, S. Lautrup, M. M. Hasan-Olive, D. Caponio, X. Dan, P. Rocktaschel, D. L. Croteau, M. Akbari, N. H. Greig, T. Fladby, H. Nilsen, M. Z. Cader, M. P. Mattson, N. Tavernarakis and V. A. Bohr, “Mitophagy inhibits amyloid-β and tau pathology and reverses cognitive deficits in models of Alzheimer’s disease.”, Nat. Neurosci. ., 2019,DOI:10.1038/s41593-018-0332-9.
12)	细胞（HepG2）	荧光显微镜	Iwasawa, T. Shinomiya, N. Ota, N. Shibata, K. Nakata, I. Shiina, and Y. Nagahara , “Novel Ridaifen-B Structure Analog Induces Apoptosis and Autophagy Depending on Pyrrolidine Side Chain”, Biological and Pharmaceutical Bulletin., 2019, 42, (3), 401-410, doi: 10.1248/bpb.b18-00643.
13)	细胞（U2OS）	荧光显微镜	T. Namba, “BAP31 regulates mitochondrial function via interaction with Tom40 within ER-mitochondria contact sites “, Sci Adv., 2019, 5, (6), 1386.
14)	细胞（INS-1）	荧光显微镜	A. Inamura, S. M. Hirayama, and K. Sakurai, Loss of Mitochondrial DNA by Gemcitabine Triggers Mitophagy and Cell Death’, Biol. Pharm. Bull.., 2019, 42, 1977.
15)	细胞（HRCEpiC, HRPTEpic）	流式细胞仪	Y. Zhao and M. Sun, Metformin rescues Parkin protein expression and mitophagy in high glucose-challenged human renal epithelial cells by inhibiting NF-κB via PP2A activation., Life Sci.., 2020, DOI:10.1016/j.lfs.2020.117382.
16)	细胞（RAES）	荧光显微镜	N. Liu, J. Wu, L. Zhang, Z. Gao, Y. Sun, M. Yu, Y. Zhao, S. Dong, F. Lu and W. Zhang , “Hydrogen Sulphide modulating mitochondrial morphology to promote mitophagy in endothelial cells under high‐glucose and high‐palmitate “, J. Cell. Mol. Med., 2017, 21, (12), 3190.
17)	细胞（BAECs）	荧光显微镜	N. Kajihara, D. Kukidome, K. Sada, H. Motoshima, N. Furukawa, T. Matsumura, T. Nishikawa and E. Araki, “Low glucose induces mitochondrial reactive oxygen species via fatty acid oxidation in bovine aortic endothelial cells”, J Diabetes Investig, 2017, 8, (6), 750.
18)	细胞（HT22）	荧光显微镜	M. Jin, H. Ni and L. Li, “Leptin Maintained Zinc Homeostasis Against Glutamate-Induced Excitotoxicity by Preventing Mitophagy-Mediated Mitochondrial Activation in HT22 Hippocampal Neuronal Cells.”, Front Neurol, 2018, 9, (9), 332.
19)	细胞（BMDMs）	流式细胞仪	D. Bhatia, K. P. Chung, K. Nakahira, E. Patino, M. C. Rice, L. K. Torres, T. Muthukumar, A. M. Choi, O. M. Akchurin and M. E. Choi , “Mitophagy-dependent macrophage reprogramming protects against kidney fibrosis”, JCI Insight, 2019, 4, (23), e132826.
20)	细胞（U2OS）	荧光显微镜	J. Zheng, D. L. Croteau, V. A. Bohr and M. Akbari, “Diminished OPA1 expression and impaired mitochondrial morphology and homeostasis in Aprataxin-deficient cells. “, Nucleic Acids Res., 2019, 47, (8), 4086.
21)	细胞（HT22）	荧光显微镜	D. D. Wang, M. F. Jin, D. J. Zhao and H. Ni, “Reduction of Mitophagy-Related Oxidative Stress and Preservation of Mitochondria Function Using Melatonin Therapy in an HT22 Hippocampal Neuronal Cell Model of Glutamate-Induced Excitotoxicity”, Front Endocrinol (Lausanne), 2019, 10, 550.
22)	细胞（CD⁴⁺T-cells, HeLa）	荧光显微镜	A. Bektas, S. H. Schurman, M. G. Freire, A. Bektas, S. H. Schurman, M. G. Freire, C. A. Dunn, A. K. Singh, F. Macian, A. M. Cuervo, R. Sen and L. Ferrucci, “Age-associated changes in human CD⁴⁺ T cells point to mitochondrial dysfunction consequent to impaired autophagy.”, Aging (Albany NY)., 2019, 11, (21), 9234-9263.
23)	细胞（ALM）	流式细胞仪	T. Nechiporuk, S.E. Kurtz, O. Nikolova, T. Liu, C.L. Jones, A. D. Alessandro, R. C. Hill, A. Almeida, S. K. Joshi, M. Rosenberg, C. E. Tognon, A. V. Danilov, B. J. Druker, B. H. Chang, S. K McWeeney and J. W. Tyner, “The TP53 Apoptotic Network Is a Primary Mediator of Resistance to BCL2 Inhibition in AML Cells.”, Cancer Discov., 2019, 9, (7), 919.
24)	细胞（PK-15）	荧光显微镜	Y. Zhang, R. Sun, X. Li and W. Fang, “Porcine Circovirus 2 Induction of ROS Is Responsible for Mitophagy in PK-15 Cells via Activation of Drp1 Phosphorylation”, Viruses., 2020, 12, (3), 289.
25)	细胞（HCE）	荧光显微镜	Y. Huo, W. Chen, X. Zheng, J. Zhao, Q. Zhang, Y. Hou, Y. Cai, X. Lu and X. Jin , “The protective effect of EGF-activated ROS in human corneal epithelial cells by inducing mitochondrial autophagy via activation TRPM2.”, J. Cell. Physiol., 2020, DOI: 10.1002/jcp.29597.
26)	细胞（心肌细胞）	荧光显微镜	Y. Sun, F. Lu, X. Yu, B. Wang, J. Chen, F. Lu, S. Peng, X. Sun, M. Yu, H. Chen, Y. Wang, L. Zhang, N. Liu, H. Du, D. Zhao and W. Zhang, “Exogenous H2S Promoted USP8 Sulfhydration to Regulate Mitophagy in the Hearts of db/db Mice.”, Aging Dis., 2020, 11, (2), 269.
27)	细胞（HCFs）	荧光显微镜	R. Tanaka, M. Umemura, M. Narikawa, M. Hikichi, K. Osaw, T. Fujita, U. Yokoyama, T. Ishigami, K. Tamura and Y. Ishikawa, “Reactive fibrosis precedes doxorubicin-induced heart failure through sterile inflammation.”, ESC Heart Fail., 2020, 7, (2), 588.
28)	细胞（VSMCs）	荧光显微镜	C. Duan, L. Kuang, X. Xiang, J. Zhang, Y. Zhu, Y. Wu, Q. Yan, L. Liu and T. Li, “Drp1 regulates mitochondrial dysfunction and dysregulated metabolism in ischemic injury via Clec16a-, BAX-, and GSH- pathways “, Cell Death Dis., 2020, 11, 251.
29)	细胞（Bovine Sertoli）	荧光显微镜	E. O. Adegoke, W. Xue, N. S. Machebe, S. O. Adeniran, W. Hao, W. Chen, Z. Han, Z. Guixue and Z. Peng, “Sodium Selenite inhibits mitophagy, downregulation and mislocalization of blood-testis barrier proteins of bovine Sertoli cell exposed to microcystin-leucine arginine (MC-LR) via TLR4/NF-kB and mitochondrial signaling pathways blockage.”, Ecotoxicol. Environ. Saf., 2018, 116, 165.
30)	细胞（HeLa）	荧光显微镜	D. Takahashi, J. Moriyama, T. Nakamura, E. Miki, E. Takahashi, A. Sato, T. Akaike, K. I. Nakama and H. Arimoto, “AUTACs: Cargo-Specific Degraders Using Selective Autophagy. “, Mol. Cell, 2019, 76, (5), 797.
31)	细胞（primary hepatocyte）	荧光显微镜	H. Kim, J. H. Lee and J. W. Park, “IDH2 deficiency exacerbates acetaminophen hepatotoxicity in mice via mitochondrial dysfunction-induced apoptosis.”, Biochim Biophys Acta Mol Basis Dis, 2019, 1865, (9), 2333.
32)	细胞（C3H10T1/2s）	荧光显微镜	M. S. Rahman and Y. S. Kim, “PINK1-PRKN mitophagy suppression by Mangiferin promotes a brown-fat-phenotype via PKA-p38 MAPK signalling in murine C3H10T1/2”, Metabolism, 2020, 101, 154228.
33)	细胞（NHEKs）	荧光显微镜	S. Ikeoka and A. Kiso , “The Involvement of Mitophagy in the Prevention of UV-B-Induced Damage in Human Epidermal Keratinocytes “, J. Soc. Cosmet. Chem. Jpn., 2020, 54(3), 252.

D675/DALGreen – Autophagy Detection 细胞自噬检测试剂

D675/DALGreen – Autophagy Detection 细胞自噬检测试剂,细胞自噬是细胞内损坏的蛋白质或细胞器降解和循环利用的过程。DALGreen是一种可以进入细胞膜检测细胞自噬的小分子脂溶性荧光染料，具有在酸性环境中产生荧光的特性，可以检测到自噬体与溶酶体融合形成的自噬溶酶体。

货号：D675
DALGreen – 细胞自噬荧光探针
DALGreen – Autophagy Detection
储存条件：-20度保存，避光
运输条件：室温

特点：

操作流程简便
与LC3结果一致性高
可以动态观察细胞自噬

选择规格：20 nmol

关联产品TOP5

NO.1. DAPRed – Autophagy Detection 细胞自噬检测
NO.2. Cell Counting Kit-8 细胞增殖毒性检测
NO.3. Mitophagy Detection Kit 线粒体自噬检测
NO.4. ROS Assay Kit 活性氧检测
NO.5. Annexin V, FITC Apoptosis Detection Kit 细胞凋亡检测

产品概述

细胞自噬是细胞内损坏的蛋白质或细胞器降解和循环利用的过程。

DALGreen是一种可以进入细胞膜检测细胞自噬的小分子脂溶性荧光染料，具有在酸性环境中产生荧光的特性，可以检测到自噬体与溶酶体融合形成的自噬溶酶体。

原理

与DAPGreen和DAPRed一样，在自噬体形成的时候染料掺入细胞膜。然后当自噬体与溶酶体融合产生酸性环境时，DALGreen的荧光增强。

试剂概要

DALGreen不仅可以用荧光显微镜检测，还可以使用流式细胞仪进行检测。DAPGreen可以用荧光酶标仪进行检测，

您可以根据自己的实验条件，使用不同的仪器进行检测。

操作特点

操作流程只有一步-加入试剂

无需基因转染。只需向准备好的细胞加入DALGreen染料，即可方便快捷的进行荧光检测。

实验例

与LC3共染

对已经表达tagRFP-LC3的MEF细胞进行DALGreen共染实验。结果显示，DALGreen的染色部位与自噬体和自噬溶酶体的标记物LC3的位置高度一致。(比例尺：10 μm)

实验的详细情况请参考如下论文：
H. Iwashita,”Small fluorescent molecules for monitoring autophagic flux”, FEBS Letters., 2018, 592, (4), 559–567.

与Lamp-1共染

对已经表达Lamp1-tagRFP的MEF细胞进行DALGreen共染实验。结果显示，DALGreen的染色部位与溶酶体膜蛋白标记物Lamp 1的位置高度一致。(比例尺：10 μm)

实验的详细情况请参考如下论文：
H. Iwashita,”Small fluorescent molecules for monitoring autophagic flux”, FEBS Letters., 2018, 592, (4), 559–567.

ULK1/2敲除细胞的评价

将野生型MEF细胞与已经敲除自噬体膜形成有关的ULK1/2的细胞株一起用雷帕霉素(Rapamycin)和氯喹(Chloroquine)刺激后进行对比实验。结果显示，在野生型细胞中明显观察到荧光增强，而敲除了ULK1/2的细胞中基本观察不到荧光的增强。

实验的详细情况请参考如下论文：
H. Iwashita,”Small fluorescent molecules for monitoring autophagic flux”, FEBS Letters., 2018, 592, (4), 559–567.

细胞延时成像

用DALGreen染色HeLa细胞后，按照下列条件从培养30分钟开始直至培养6小时一直对细胞染色状态进行观察。

・Nutrient Condition: 增殖型培养基
・Autophagic Condition: 不含氨基酸的培养基

<检测条件>
仪器：激光共聚焦高内涵细胞分筛系统(恒河电机株式会社: CQ1)
荧光滤光片：Ex.405 nm / Em.525/50 nm，倍率：20X

DALGreen与其它试剂的长时间染色实验的比较，可进行单一样品随时间变化的长期观察实验。
・由于DALGreen在自噬诱导/抑制剂之前加，所以可以实时观察自噬的进程。另外在不知道自噬诱导/抑制剂的作用时间情况下，与其它试剂相比，用DALGreen更加方便快捷。
每个时间组均需要单独制备样品

・MDC(Monodansylcadaverine)等其它试剂必须要在诱导后加，
需要摸索诱导/抑制剂的作用时间，因此需要准备多组实验，操作复杂，耗费更多的时间和实验材料。

与LC3的对比

HeLa细胞:①对照组，②饥饿诱导（诱导细胞自噬）组

DALGreen的荧光成像图和细胞自噬因子LC3-Ⅱ表达量结果的对比

结果
DALGreen：饥饿诱导组比Control组荧光增强；LC3-Ⅱ：饥饿诱导组比Control组LC3-Ⅱ表达量增加；
结果表明两者有良好的相关性。

自噬诱导条件
① Control：用培养基培养6小时
② 饥饿诱导：用不含氨基酸培养基培养6小时

DALGreen的显色条件
细胞：HeLa细胞
检测波长：Ex. 488 nm/Em. 500-563 nm
比例尺：20 μm

与MDC的对比

结果

DALGreen和MDC结果：饥饿诱导组均比Control组荧光增强；结果表明两者有良好的相关性。

波长

因为MDC的最大激发波长在紫外区，所以不能用488 nm激发。DALGreen可以采用488 nm激发。

操作

DALGreen：加染料⇒饥饿诱导

MDC ：饥饿诱导⇒加染料

由于DALGreen是在饥饿诱导前加入，因此可以动态观察到细胞自噬的过程。

常见问题Q&A

Q1: DALGreen Working Solution的稳定性如何？

A1: 无法长期保存，需要现配现用

Q2: DMSO Stocking Solution 的稳定性如何？

A2:配制后请于-20℃保存，一个月内可保持稳定。另外建议根据用量分装保存。

Q3:如何摸索DALGreen的最佳浓度？

A3 :由于本试剂的特性，如果试剂的浓度太高或太低都会导致诱导自噬的样品组与未诱导自噬的对照组之间的差别不明显。建议参考以下信息摸索试剂的最佳浓度：

DALGreen的最佳浓度根据细胞的种类而不尽相同。

可以考虑从最低浓度(可以0.1 μmol/l作为参考)开始分别多个梯度至最高浓度(可以4 μmol/l作为参考)的步骤进行摸索。

参考例

我们公司对HeLa, HepG2, CHO细胞的最佳浓度进行了摸索。DALGreen以下列浓度进行染色，并在无氨基酸的培养基中培养以诱导自噬。下表中红色字体的浓度可明显观察到实验组与空白组的差异。

A4:溶酶体染因此当溶酶体染色试剂和DALGreen共染时，溶酶体染色试剂发出的荧光与自噬小体的部分DALGreen的荧光发生重叠。
色试剂会定位于细胞内的溶酶体里。而DALGreen是在进入自噬小体后，当自噬小体与溶酶体结合后，荧光变强。Q4: 这个产品和溶酶体染色试剂有什么区别吗？

本实验的数据，请参考下面论文的Supporting Information (Fig.S5)。

H. Iwashita, “Small fluorescent molecules for monitoring autophagic flux”, FEBS Letters., 2018, 592, (4), 559–567.

论文的原文链接在本产品的网站页面上。

网站链接(日语)：

http://dominoweb.dojindo.co.jp/goodsr7.nsf/View_Display/D675?OpenDocument

Q5:推荐使用的滤光片？

A5:激发波长：350~450 nm;
发射波长：500~560 nm;
另外利用激光共聚焦显微镜的488 nm激发波长也可以检测，
请参考我们公司网站产品页面的实验例。

Q6:是否有与自噬相关的蛋白质敲除和评估的实例？

A6:与自噬小体成膜有关的ULK1和ULK2敲除的细胞与野生型细胞饥饿诱导，用DALGreen染色后评价的实例是有的。

实验结果显示，与ULK1/ULK2敲除的细胞相比，野生型细胞中的DALGreen荧光信号增大。这次实验的具体数据请参照下面这篇论文的Supporting Information (Fig. S5)

另外，自噬的标记物LC3-RFP与DALGreen的共染色结果显示，大多数的染色Puncta(斑点，位点)都高度一致。本实验的数据，请参考下面论文的Fig.1。

H. Iwashita, “Small fluorescent molecules for monitoring autophagic flux”, FEBS Letters., 2018, 592, (4), 559–567.

论文的原文链接在本产品的网站页面上。

网站链接(日语)：

http://dominoweb.dojindo.co.jp/goodsr7.nsf/View_Display/D675?OpenDocument

Q7:自噬有哪些途径？DALGreen可以检测到哪些状态？

A7:众所周知，自噬根据其分子机制可以分为两种：一种是依赖于ATG5的传统自噬(LC3发生变化），另一种则是非依赖于ATG的选择性自噬（LC3形式的转化并未发生）。

DALGreen在形成自噬体膜时掺入其中，当形成自噬溶酶体时，环境变成酸性，DALGreen荧光增强。因此，DALGreen可以检测自噬溶酶体的状态。

*参考资料：发现新的自噬机制Shigeomi Shimizu

https://www.dojindo.co.jp/letterj/160/review/01.html

文献链接：http://dx.doi.org/10.14348/molcells.2018.2215

▶对于首次检测的细胞类型和实验条件，请参考FAQ[如何确定细胞自噬探针DALGreen的最佳浓度]。

Q8:在进行延时成像时有什么要注意的地方吗？

A8:为了确定最佳实验条件，请先进行预实验。

由于试剂的特性，刚刚染色后有荧光值升高的趋势，因此请参照以下步骤进行预实验和延时成像。

1. 预实验

– 使用对照细胞(不诱导自噬的细胞)。

– 根据说明书的步骤用Working Soluiton染色后，用培养基洗涤2次。

– 加入正常培养基后，观察荧光随时间的变化。

– 如下图所示，染色后的细胞在荧光强度阶段性降低之后，确认荧光强度变化趋于稳定的时间段（图中的T）。

※条件可能因细胞种类而异。

(参考)

HeLa细胞的话，染色后约60分钟后，荧光确定会趋于稳定(DALGreen)。

2. 延时染色成像

– 细胞用Working Solution染色后，在培养基中37℃培养。

※培养时间为预实验中摸索出的染色时间。

※染色后不要立刻进行自噬诱导。

-培养后进行自噬诱导并开始延时染色成像。

(参考)

用DALGreen对HeLa细胞进行染色，在正常的培养基中培养60分钟(预实验中摸索的时间)后，进行自噬诱导。

参考文献

No.	检测样品	检测仪器	引用(含链接)
1)	细胞 (HeLa, MEF)	荧光显微镜	H. Iwashita, H. T. Sakurai, N. Nagahora, M. Ishiyama, K. Shioji, K. Sasamoto, K. Okuma, S. Shimizu, and Y. Ueno, “Small fluorescent molecules for monitoring autophagic flux.”, FEBS Letters., 2018, 592, (4), 559–567.
2)	细胞 (HeLa)	荧光显微镜	T. Sakata, A. Saito and H. Sugimoto, “In situ measurement of autophagy under nutrient starvation based on interfacial pH sensing.”, Scientific Reports., 2018, 8, 8282.
3)	细胞 (HS-MM)	荧光显微镜	Y. Egawa, C. Saigo, Y. Kito, T. Moriki and T. Takeuchi , “Therapeutic potential of CPI-613 for targeting tumorous mitochondrial energy metabolism and inhibiting autophagy in clear cell sarcoma.”, PLoS One., 2018, 13, (6), e0198940.
4)	细胞 (HaCaT)	荧光显微镜	S. Abe, S. Hirose, M. Nishitani, I. Yoshida, M. Tsukayama, A. Tsuji and K. Yuasa , “Citrus peel polymethoxyflavones, sudachitin and nobiletin, induce distinct cellular responses in human keratinocyte HaCaT cells.“, Biosci. Biotechnol. Biochem. ., 2018, 82, (12), 1347.
5)	细胞 (KGN)	荧光显微镜	W. Yuping, M. Congshun, Z. Huihui, Z. Yuxia, C. Zhenguo and W. Liping, “Alleviation of endoplasmic reticulum stress protects against cisplatin-induced ovarian damage.”, Reprod. Biol. Endocrinol., 2018,doi: 10.1186/s12958-018-0404-4.
6)	细胞 (BmN)	荧光显微镜	S. Xue, F. Mao, D. Hu, H. Yan, J. Lei, E. Obeng, Y. Zhou, Y. Quan, and W. Yu, “Acetylation of BmAtg8 inhibits starvation-induced autophagy initiation.”, Mol. Cell Biochem., 2019,doi: 10.1007/s11010-019-03513-y.
7)	细胞 (HeLa)	荧光显微镜	F. Hongbao,Y. Shankun, C. Qixin, L. Chunyan, C. Yuqi, G. Shanshan, B. Yang, T. Zhiqi, L. Z. Amanda, T. Takanori, C.Yuncong, G. Zijian, H. Weijiang and D. Jiajie , “De Novo-Designed Near-Infrared Nanoaggregates for Super-Resolution Monitoring of Lysosomes in Cells, in Whole Organoids, and in Vivo.”, ACS Nano, 2019, 13, (12), 1446.
8)	细胞 (RT-7)	流式细胞仪	E. Sasabe, A. Tomomura, N. Kitamura and T. Yamamoto, “Metal nanoparticles-induced activation of NLRP3 inflammasome in human oral keratinocytes is a possible mechanism of oral lichenoid lesions.”, Toxicol In Vitro., 2020, 62, 104663.
9)	细胞 (骨髓细胞)	荧光显微镜	J. Xia, Y. He, B. Meng, S. Chen, J. Zhang, X. Wu, Y. Zhu, Y. Shen, X. Feng, Y. Guan, C. Kuang, J. Guo, Q. Lei, Y. Wu, G. An, G. Li, L. Qiu, F. Zhan and W. Zhou, “NEK2 induces autophagy-mediated bortezomib resistance by stabilizing Beclin-1 in multiple myeloma.”, Mol Oncol, 2020, DOI: 10.1002/1878-0261.12641.
10)	细胞 (Human L2)	荧光显微镜	Q. Xu, W. Shi, P. Lv, W. Meng, G. Mao, C. Gong, Y. Chen, Y. Wei, X. He, J. Zhao, H. Han, M. Sun and K. Xiao, “Critical role of caveolin-1 in aflatoxin B1-induced hepatotoxicity via the regulation of oxidation and autophagy.”, Cell Death Dis., 2020, 11(1), 6.
11)	细胞 (心肌细胞)	荧光显微镜	L Cui, LP Zhao, JY Ye, L Yang, Y Huang, X.P. Jiang, Q. Zhang, JZ. Jia, DX. Zhang and Y. Huang, “The Lysosomal Membrane Protein Lamp2 Alleviates Lysosomal Cell Death by Promoting Autophagic Flux in Ischemic Cardiomyocytes.“, Front Cell Dev Biol, 2020,DOI:10.3389/fcell.2020.00031.
12)	细胞 (IPEC-J2)	荧光显微镜	Y Yang, J Huang, J Li, H Yang and Y. Yin, “The Effects of Butyric Acid on the Differentiation, Proliferation, Apoptosis, and Autophagy of IPEC-J2 Cells..”, Curr. Mol. Med., 2020, 20(4), 307.
13)	细胞 (成纤维细胞、肾脏上皮细胞)	荧光显微镜	M. M. Ivanova, J. Dao, N. Kasaci, B. Adewale, J. Fikry and O. G. Alpan , “Rapid Clathrin-Mediated Uptake of Recombinant α-Gal-A to Lysosome Activates Autophagy”, Biomolecules , 2020, 10(6), 837.
14)	细胞 (NHEKs)	荧光显微镜	S. Ikeoka and A. Kiso , “The Involvement of Mitophagy in the Prevention of UV-B-Induced Damage in Human Epidermal Keratinocytes “, J. Soc. Cosmet. Chem. Jpn., 2020, 54(3), 252.
15)	细胞 (HeLa)	荧光显微镜(超分辨率)	Q. Chen, M. Hao, L. Wang, L. Li, Y. Chen, X. Shao, Z. Tian, R. A. Pfuetzner, Q. Zhong, A. T. Brunger, J. Guan and J. Diao,“Prefused lysosomes cluster on autophagosomes regulated by VAMP8″, 2021, doi:10.1038/s41419-021-04243-0.

D676/DAPGreen – Autophagy Detection 细胞自噬检测试剂

货号：D676
DAPGreen – 细胞自噬荧光探针
DAPGreen – Autophagy Detection
储存条件：-20度保存，避光
运输条件：室温

特点：

操作流程简便
与LC3结果高度一致
可以动态观察细胞自噬

选择规格：5nmol

关联产品TOP5
NO.1. Cell Counting Kit-8 细胞增殖毒性检测
NO.2. Mitophagy Detection Kit 线粒体自噬检测
NO.3. Calcein-AM/PI Double Staining Kit 活死细胞双染
NO.4. Liperfluo 细胞脂质过氧化物检测
NO.5. Annexin V, FITC Apoptosis Detection Kit 细胞凋亡检测

产品概述

DAPGreen是一种小分子荧光染料，可以用来检测自噬体及自噬溶酶体。由于其特殊的结构，在自噬体形成双
层膜结构时染料可以进入其中，并在疏水环境中产生荧光。DAPGreen具有很好的细胞透膜性，通过荧光显微
镜可进行活细胞荧光成像，也可使用流式细胞仪进行定量检测。

原理

当形成自噬体膜时，DAPGreen可以掺入其中，并在脂溶性环境中产生荧光。

DAPGreen的检测结果与细胞自噬标志物LC3的结果有很高的相关性。

试剂概要

DAPGreen不仅可以用荧光显微镜检测，还可以使用流式细胞仪进行检测。

同时也实现了用荧光酶标仪进行检测，您可以根据自己的实验条件，使用不同的仪器进行检测。

*DAPGreen和DALGreen不能共染

操作简便

操作流程只有一步-加入试剂

只需向准备好的细胞加入DAPGreen染料，即可方便快捷的进行荧光检测。

实验例

与LC3高度相关
与自噬标准物LC3的细胞共染实验结果的比较。

检测条件：DAPGreen：Ex. 488 nm / Em. 500-563 nm

比例尺：10 μm
将DAPGreen加入已表达tagRFP-LC3的Hela细胞中，用雷帕霉素（Rapamycin）诱导自噬4 h后，用共聚焦显微镜观察DAPGreen和RFP的荧光成像。结果DAPGreen与tagRFP-LC3的染色部位高度一致。

与Lamp-1共染

对已经表达Lamp1-tagRFP的MEF细胞进行DAPGreen共染实验。结果显示，DAPGreen的染色部位与溶酶体膜蛋白标记物Lamp 1的位置高度一致。(比例尺：10 μm)

实验的详细情况请参考如下论文：
“Small fluorescent molecules for monitoring autophagic flux”, FEBS Letters., 2018, 592, (4), 559–567.

流式细胞仪的定量分析

自噬诱导后，通过流式细胞仪检测DAPGreen的荧光。

检测条件：
检测波长：Ex. 488 nm / Em. 500-560 nm

DAPGreen染色HeLa细胞后，在不含氨基酸的培养基中培养0、3和6 h，用流式细胞仪检测。结果，在饥饿诱导3 h后可以检测到更强的荧光信号。

荧光酶标仪的定量检测

用荧光酶标仪检测自噬诱导后DAPGreen的荧光。

检测条件

检测波长：Ex. 450 nm / Em. 535 nm

DAPGreen染色HeLa细胞后，在不含氨基酸的培养基中分别培养0、2、4、6 h，用荧光酶标仪检测。结果饥饿诱导2 h检测荧光，饥饿诱导组的荧光强度大约是对照组的3.5倍。

有关检测操作的详细信息，请参考FAQ“使用荧光酶标仪进行定量分析的检测条件是什么？”。

应用例：荧光显微镜的数值化

96孔板中接种HeLa细胞，并用DAPGreen染色后，分别更换含有血清和不含血清的培养基后继续培养。培养后分别通过视野内的平均荧光强度进行计算。结果发现，不含血清的培养基培养的细胞中DAPGreen的荧光强度更高。

<检测条件>

Ex：488 nm, Em: 500-550 nm

物镜： CFI Plan Apochromat VC 20x

拍摄模式： Resonant Scanner

XY分辨率：512×512

<使用装置>

荧光显微镜：Nikon 激光共聚焦显微镜A1R

分析软件：NIS-Elements

＜实验步骤＞

1. 将HeLa细胞播种于96孔板中并培养。

2. 去除培养基，用无血清培养基清洗1次。

3. 添加配置好的DAPGreen working solution ，37℃ 培养30 min。

4. 去除培养基，用无血清培养基清洗2次。

5. 诱导自噬的孔中加入无血清培养基，正常孔中加入正常培养基。37℃培养6小时(之后用4%PFA固定)。

6. 荧光显微镜观察。

按上述条件拍摄后，再用100倍物镜放大后拍摄，对细胞内的DAPGreen的荧光信号进行统计。结果显示，含有血清的培养基培养的细胞中平均每个细胞有1.5个信号，而不含血清的培养基培养的细胞中平均每个细胞有27个信号。

<检测条件>

Ex : 488 nm, Em : 500-550 nm

物镜： CFI Plan Apochromat TIRF 100xC Oil

拍摄模式： Galvano Scanner

XY分辨率：512×512

<使用装置>

荧光显微镜：Nikon 激光共聚焦显微镜A1R

分析软件：NIS-Elements

*本数据由DAPGreen的使用客户友情提供。

DAPGreen荧光光谱

激发滤光片：425-475 nm
荧光滤光片：500-560 nm

常见问题Q&A

Q1: DAP Green working solution的稳定性如何？

A1：无法长期保存，需要现配现用

Q2: DMSO stocking solution 的稳定性如何？

A2：配制后请于-20℃保存，一个月内可保持稳定。另外建议根据用量分装保存。

Q3: 推荐使用的滤光片？

A3：激发波长：425-475 nm

发射波长：500-560 nm

利用激光共聚焦显微镜的488 nm激发波长也可以检测，请参考我们公司网站产品页面的实验例。

Q4: 在进行延时成像时有什么要注意的地方吗？

4：为了确定最佳实验条件，请先进行预实验。

由于试剂的特性，刚刚染色后有荧光值升高的趋势，因此请参照以下步骤进行预实验和延时成像。

1. 预实验

使用对照细胞(不诱导自噬的细胞)。

根据说明书的步骤用 Working Soluiton染色后，用培养基洗涤2次。

加入正常培养基后，观察荧光随时间的变化。

如下图所示，染色后的细胞在荧光强度阶段性降低之后，确认荧光强度变化趋于稳定的时间段（图中的T）。

※条件可能因细胞种类而异。

(参考)

HeLa细胞染色约60分钟后，荧光会趋于稳定(DAPGreen)。

2. 延时染色成像

– 细胞用Working Solution染色后，在培养基中37℃培养。

※培养时间为预实验中摸索出的染色时间。验中摸索出的染色时间。

※染色后不要立刻进行自噬诱导。

-培养后进行自噬诱导并开始延时染色成像。

(参考)

用DAPGreen对HeLa细胞进行染色，在正常的培养基中培养60分钟(预实验中摸索的时间)后，进行自噬诱导。

Q5: 如何确定细胞自噬探针DAPGreen的最佳浓度？

A5: 由于本试剂的特性，如果试剂的浓度太高或太低都会导致诱导自噬的样品组与未诱导自噬的对照组之间的差别不明显。建议参考以下信息摸索试剂的最佳浓度：

探针的最佳浓度根据细胞的种类而不尽相同。以DAPGreen为例可以考虑从最低浓度(可以以0.05 μmol/l作为参考)开始分别多个梯度至摸索至最高浓度(可以以0.4 μmol/l作为参考)的步骤进行摸索。

参考例：

我们公司对HeLa, HepG2, CHO细胞的最佳浓度进行了摸索。DAPGreen以下列浓度进行染色，并在无氨基酸的培养基中培养以诱导自噬。下表中红色字体的浓度可明显观察到实验组与空白组的差异。

[HeLa细胞]

[HepG2细胞]

[CHO细胞]

Q6: 使用荧光酶标仪进行定量分析的检测条件是什么？

A6:以下是使用HeLa细胞进行检测的实验例。

将DAPGreen染色的HeLa细胞在不含氨基酸的培养基中分别培养0、2、4、6 h，用荧光酶标仪检测。

<操作>

1）将细胞接种在透明底的黑板上（HeLa细胞，1.6×104 cells/孔，100 µl/孔）

2）在37°C，5％ CO2培养箱过夜培养

3）去除上清液后，在培养基中加入100 µl配制好的Working Solution(DAPGreen：0.1 µmo/l）。

4）在37°C，5％ CO2培养箱培养30 min

5）用100 µl培养基清洗细胞2次

6）加入100 µl饥饿培养基（Waco，Code：048-33575）

7）在37°C下培养各时间点

8）用荧光酶标仪（TECAN，Infinite Pro M200）检测（Ex/Em = 450 nm/530 nm）

（0 h对照组用HBSS代替检测）

<检测条件>波长：Ex. 450 nm/Em. 535 nm

饥饿诱导2 h检测荧光，确认到饥饿诱导组的荧光强度大约是对照组的2.5倍。

Q7: 自噬有哪些途径？DAPGreen可以检测到哪些状态？

当形成自噬体膜时，DAPGreen可以掺入其中，并在脂溶性环境中产生荧光。因此DAPGreen可以检测自噬体的状态。

*参考资料：发现新的自噬机制Shigeomi Shimizu

https://www.dojindo.co.jp/letterj/160/review/01.html

文献链接：http://dx.doi.org/10.14348/molcells.2018.2215

▶对于首次检测的细胞类型和实验条件，请参考FAQ[如何确定细胞自噬探针DAPGreen的最佳浓度]。

参考文献

No.	检测样品	检测仪器	引用(含链接)
1)	细胞 (HeLa, MEF)	荧光显微镜	H. Iwashita, H. T. Sakurai, N. Nagahora, M. Ishiyama, K. Shioji, K. Sasamoto, K. Okuma, S. Shimizu, and Y. Ueno, “Small fluorescent molecules for monitoring autophagic flux.”, FEBS Letters., 2018, 592, (4), 559–567.
2)	细胞 (HepG2; Huh-7)	荧光显微镜;流式细胞仪	L. Hu, T. Zhang, D. Liu, G. Guan, J. Huang, P. Proksch, X. Chen and W. Lin, “Notoamide-type alkaloid induced apoptosis and autophagy via a P38/JNK signaling pathway in hepatocellular carcinoma cells”, RSC Adv., 2019, 9, 19855.
3)	细胞 (HepG2)	荧光显微镜	Q. Chu, S. Zhang, M. Chen, W. Han, R. Jia, W. Chen and X. Zheng, “Cherry Anthocyanins Regulate NAFLD by Promoting Autophagy Pathway”, Oxid Med Cell Longev., 2019,DOI:10.1155/2019/4825949.
4)	细胞 (HLMVEC)	荧光显微镜	Q. Chu, S. Zhang, M. Chen, W. Han, R. Jia, W. Chen and X. Zheng, “Cherry Anthocyanins Regulate NAFLD by Promoting Autophagy Pathway”, Oxid Med Cell Longev., 2019,DOI:10.1155/2019/4825949.
5)	细胞 (HeLa)	荧光显微镜	F. Hongbao,Y. Shankun, C. Qixin, L. Chunyan, C. Yuqi, G. Shanshan, B. Yang, T. Zhiqi, L. Z. Amanda, T. Takanori, C.Yuncong, G. Zijian, H. Weijiang and D. Jiajie , “De Novo-Designed Near-Infrared Nanoaggregates for Super-Resolution Monitoring of Lysosomes in Cells, in Whole Organoids, and in Vivo.”, ACS Nano, 2019, 13, (12), 1446.
6)	细胞 (HeLa; A375)	流式细胞仪	B. Yang, L. Ding, Y. Chen and J. Shi, “Augmenting Tumor-Starvation Therapy by Cancer Cell Autophagy Inhibition”, Adv. Sci., 2020,DOI:10.1002/advs.201902847.
7)	细胞 (PC12)	荧光显微镜(超分辨率)	Y. Tan, L. Yin, Z. Sun, S. Shao, W. Chen, X. Man,Y. Du and Y. Chen, “Astragalus polysaccharide exerts anti-Parkinson via activating the PI3K/AKT/mTOR pathway to increase cellular autophagy level in vitro.”, Int. J. Biol. Macromol., 2020, DOI:10.1016/j.ijbiomac.2020.02.282.
8)	细胞 (Wild type Hepa 1-6)	荧光显微镜 (用ImageJ软件数值化)	J. Kim, W.Y.Chee, N. Yabuta, K. Kajiwara, S. Nada and M. Okada, “Atg5-mediated autophagy controls apoptosis/anoikis via p53/Rb pathway in naked mole-rat fibroblasts”, Biochem. Biophys. Res. Commun., 2020, 22, DOI:10.1016/j.bbrc.2020.05.083.
9)	细胞 (小鼠皮肤成纤维细胞)	流式细胞仪	J. Kim, W.Y.Chee, N. Yabuta, K. Kajiwara, S. Nada and M. Okada, “Atg5-mediated autophagy controls apoptosis/anoikis via p53/Rb pathway in naked mole-rat fibroblasts”, Biochem. Biophys. Res. Commun., 2020, 22, DOI:10.1016/j.bbrc.2020.05.083.
10)	细胞 (HeLa)	荧光显微镜(超分辨率)	Q. Chen, M. Hao, L. Wang, L. Li, Y. Chen, X. Shao, Z. Tian, R. A. Pfuetzner, Q. Zhong, A. T. Brunger, J. Guan and J. Diao, “Prefused lysosomes cluster on autophagosomes regulated by VAMP8″,2021, doi:10.1038/s41419-021-04243-0.

G268/Glutamine Assay Kit-WST试剂盒

G268/Glutamine Assay Kit-WST试剂盒,Glutamine Assay Kit-WST是用于定量检测谷氨酰胺的试剂盒。无论是培养基内还是细胞内的谷氨酰胺均可以通过WST的还原反应进行定量，可检测的最低浓度为5 μmol/l。此外，本试剂盒还可使用96孔板进行多样品批量检测。

货号：G268
谷氨酰胺定量检测试剂盒
Glutamine Assay Kit-WST
储存条件：0-5度保存，避光，防潮
运输条件：室温

特点：

享有显色底物WST专利
用于L-Glutamine的定量

选择规格：1 set

关联产品TOP5

NO.1. FerroOrange 细胞亚铁离子检测
NO.2. GSSG/GSH Quantification Kit II 氧化型/还原型谷胱甘肽定量
NO.3. Glutamate Assay Kit-WST 谷氨酸的定量检测
NO.4. Liperfluo 细胞脂质过氧化物检测
NO.5. Mito-FerroGreen 铁离子荧光探针

试剂盒内含

100 tests
– Dye Mixture ×1
·Glutamine Standard ×1
Enzyme ×1
Assay Buffer 7.5 ml×1
Reconstitution Buffer 750 ul×1
·Lysis Buffer 25 ml×1
Glutaminase 20 ul×1
·Reaction Buffer 5 ml×1
·Filtration Tube ×12

产品概述

谷氨酰胺是TCA循环的中间体α-酮戊二酸的主要来源，并且是用于核酸和其他氨基酸合成及能量产生的重要物质。根据文献报道特别是在癌细胞中，谷氨酰胺作为底物可促进Glutaminolysis的生成，而Glutaminolysis是产生α-酮戊二酸的途径之一。同时Glutaminolysis还可以消除活性氧并减少氧化型谷胱甘肽。

Glutamine Assay Kit-WST是用于定量检测谷氨酰胺的试剂盒。无论是培养基内还是细胞内的谷氨酰胺均可以通过WST的还原反应进行定量，可检测的最低浓度为5 μmol/l。此外，本试剂盒还可使用96孔板进行多样品批量检测。

原理

本试剂盒通过WST的还原反应对细胞和培养基中的谷氨酰胺进行定量。此外，本试剂盒还包含谷氨酰胺标准溶液，可用于通过制作标准曲线来定量样品中谷氨酰胺的浓度。

操作步骤

*向谷氨酰胺标准溶液和含有谷氨酰胺酶的样品孔中加入谷氨酰胺酶溶液，并在样品(不含谷氨酰胺酶溶液)的每个孔中加Reaction Buffer。

由下式算出检测样品中的谷氨酰胺浓度。

样品中的谷氨酰胺浓度(mmol/l)＝(含有谷氨酰胺酶溶液)-(不含谷氨酰胺酶溶液)

实验例

标准曲线的实验例：

样品中的谷氨酰胺浓度可通过使用该试剂盒的谷氨酰胺标准溶液制作标准曲线来确定。如果谷氨酰胺浓度为0.5 mmol/l或更高，则可以通过稀释样品进行检测。

谷氨酰胺和谷氨酸的检测实验例：

将A549细胞接种在6孔板中，用Glutamine Assay Kit-WST和Glutamate Assay Kit-WST分别检测细胞培养上清液中谷氨酰胺和谷氨酸浓度随培养时间的变化。

结果，培养基中的谷氨酰胺浓度随培养时间增加而降低，而谷氨酸浓度则升高。

常见问题Q&A

Q1：一个试剂盒可以检测样品的数量。

A1：制备标准曲线和样品(n=3)，可以检测的样品数量如下所示。

100 tests

样品数量(n=3) 12个样品(参照下图)

谷氨酰胺标准溶液和样品的96孔板排列示意图(n=3)

＊当n=3时，至少需要240 μl(每孔40 μl×6孔)。

样品中的谷氨酰胺浓度(mmol/l)＝(含有谷氨酰胺酶溶液)-(不含谷氨酰胺酶溶液)

Q2：配制后的Working solution可以保存多久？

A2：Working solution无法保存，需要现配现用。此外光会影响Working solution的稳定性，所以配制后请避光。

Q3：是否可以定量D-Glutamine？

A3：该试剂盒是用于L-Glutamine定量，无法定量D-Glutamine。

Q4：是否可以检测含有还原性物质的样品？

A4：如果样品中含有还原性的物质，则WST染料也会发生显色，此时无法准确定量谷氨酰胺浓度。实验中如遇到以上情况，可以准备药物对照(不含细胞含药物的培养基+试剂)。

Q5：待测样品可以保存吗？

A5：我们确认过细胞培养上清液样品可以-20°C保存1个月。

细胞裂解液样品也可以-20°C保存1个月。但是，在保存之前请使用试剂盒中的Filtration Tube进行脱蛋白处理。

Q6：为什么我的样品孔没有显色？

A6：样品中的谷氨酰胺浓度可能低于检测限(5 µmol/l)，谷氨酰胺浓度低于5 µmol/l的样品无法用该试剂盒检测。如果待测样品被稀释，则稀释样品中含有的谷氨酰胺浓度可能低于5 µmol/l。请减少稀释比例，从而将检测样品的谷氨酰胺浓度调整到最低检测限以上。

Q7：是否可以使用450 nm以外波长的滤光片进行检测？

A7：也可以使用490 nm的滤光片。但是，吸光度会低于在450nm处的吸光度。(见下图)

参考文献

1)Lingtao,J.et al.,”Glutamate dehydrogenase 1 signals through antioxidant glutathione peroxidase 1 to regulate redox homeostasis and tumor growth”,Cancer Cell,2015,27,257-270.

G269/Glutamate Assay Kit-WST试剂盒

G269/Glutamate Assay Kit-WST试剂盒,Glutamate Assay Kit-WST是谷氨酸的定量检测试剂盒。细胞培养基中或细胞内的谷氨酸都可以通过WST的还原反应进行定量，谷氨酸定量的最低浓度为5 μmol/l。此外，本试剂盒还可以使用96孔板进行多样品批量检测。

货号：G269
谷氨酸的定量检测试剂盒
Glutamate Assay Kit-WST
储存条件：0-5度保存，避光，防潮
运输条件：室温

特点：

享有显色底物WST专利
用于L-Glutamate的定量

选择规格：1set

关联产品TOP5

NO.1. FerroOrange 细胞亚铁离子检测
NO.2. Glutamine Assay Kit-WST 谷氨酰胺的定量检测
NO.3. GSSG/GSH Quantification Kit II 氧化型/还原型谷胱甘肽定量
NO.4. Liperfluo 细胞脂质过氧化物检测
NO.5. Mito-FerroGreen 铁离子荧光探针

试剂盒内含

100 tests
-Dye Mixture ×l
·Glutamate Standard 300 ul×1
Enzyme ×1
-Assay Buffer 7.5 ml×1
·Reconstitution Buffer 750 ul×1
·Lysis Buffer 25 ml×1
-Filtration Tube ×24

产品概述

　　谷氨酸不仅用于蛋白质和谷胱甘肽的生物合成，而且还作为神经递质发挥重要作用，谷氨酸过多被认为是引起神经退行性疾病如阿尔茨海默氏病的原因。根据文献报道，胱氨酸/谷氨酸的转运蛋白(xCT)具有吸收胱氨酸放出谷氨酸的功能，而抑制xCT会诱导细胞发生铁依赖性的死亡—铁死亡，近年来针对xCT的癌症研究越来越多。

Glutamate Assay Kit-WST是谷氨酸的定量检测试剂盒。细胞培养基中或细胞内的谷氨酸都可以通过WST的还原反应进行定量，谷氨酸定量的最低浓度为5 μmol/l。此外，本试剂盒还可以使用96孔板进行多样品批量检测。

原理

　　本试剂盒通过WST的还原反应对细胞和培养基中的谷氨酸进行定量。此外，本试剂盒还包含谷氨酸标准溶液，可用于通过制作标准曲线来定量样品中谷氨酸的浓度。

操作步骤

　　只需将细胞培养上清液或组织/细胞裂解溶液转移到孔板中，加入试剂后孵育即可。

实验例

　　标准曲线的实验例：

　　谷氨酰胺和谷氨酸的检测实验例：

将A549细胞接种在6孔板中，用Glutamine Assay Kit-WST和Glutamate Assay Kit-WST分别检测细胞培养上清液中谷氨酰胺和谷氨酸浓度随培养时间的变化。

结果，培养基中的谷氨酰胺浓度随培养时间增加而降低，而谷氨酸浓度则升高。

　　铁死亡研究中谷氨酸和谷胱甘肽的检测实验例:

据报道通过弹性蛋白，抑制胱氨酸/谷氨酸转运体(xCT)造成铁依赖性的细胞死亡，即细胞铁死亡。在通过弹性蛋白处理后的A549细胞中，确认谷氨酸的释放量和细胞内谷胱甘肽的量。结果显示，通过弹性蛋白处理的细胞中谷氨酸释放的量减少，抑制胱氨酸的摄取，从而导致谷胱甘肽的量减少。

Sulfasalazine (SSZ) 引起的细胞内代谢变化实验例：

将已知会抑制胱氨酸/谷氨酸转运体(xCT)的Sulfasalazine(SSZ)加入到A549细胞后，确认谷氨酸释放量、细胞内ATP、α-酮戊二酸(α-KG)、谷胱甘肽(GSH)以及ROS的变化。

结果显示，SSZ加入后细胞内ATP、谷胱甘肽(GSH)和谷氨酸释放量减少，细胞内α-酮戊二酸和ROS增加。

<使用产品>

· 细胞内GSH：GSSG/GSH Quantification Kit II（货号：G263）

· 细胞内ROS：ROS Assay Kit -Highly Sensitive DCFH-DA-（货号：R252）

· 细胞内ATP：ATP Assay Kit-Luminescence（货号：A550）

· 细胞内α-KG：α-Ketoglutarate Assay Kit-Fluorometric（货号：K261）

<实验条件>

细胞：A549细胞 (1 x 10⁶ cells) 　药物处理时间：48 h

参考文献) Shogo Okazaki et al.,”Glutaminolysis-related genes determine sensitivity to xCT-targeted therapy in head and neck squamous cell carcinoma”.Cancer Sci.,2019,doi:10.1111/cas.14182.

常见问题Q&A

Q1：一个试剂盒可以检测样品的数量是多少？

A1：制备标准曲线和样品(n=3)，可以检测的样品数量如下所示。

100 tests

样品数量(n=3) 24个样品(参照下图)

谷氨酸标准溶液和样品的96孔板排列示意图(n=3)

Q2：配制后的Working solution可以保存多久？

A2：Working solution无法保存，需要现配现用。此外光会影响Working solution的稳定性，所以配制后请避光。

※Working solution配制后，避光室温条件下4 h稳定。当暴露于光线下，溶液的颜色会变成褐色。

Q3：是否可以定量D-Glutamate？

A3：该试剂盒是用于L-Glutamate定量，无法定量D-Glutamate。

Q4：是否可以检测含有还原性物质的样品？

A4：如果样品中含有还原性的物质，则WST染料也会发生显色，此时无法准确定量谷氨酸浓度。实验中如遇到以上情况，可以准备药物对照(不含细胞含药物的培养基+试剂)。

Q5：待测样品可以保存吗？

A5：我们确认过细胞培养上清液样品可以-20°C保存1个月。

细胞裂解样品也可以-20°C保存1个月。但是，在保存之前请使用试剂盒中的Filtration Tube进行脱蛋白处理。

Q6：为什么我的样品孔没有显色？

A6：样品中的谷氨酸浓度可能低于检测限(5 µmol/l)，谷氨酸浓度低于5 µmol/l的样品无法用该试剂盒检测。

如果待测样品被稀释，则稀释样品中含有的谷氨酸浓度可能低于5 µmol/l。请减少稀释比例，从而将检测样品的谷氨酸浓度调整到最低检测限以上。

Q7：是否可以使用450 nm以外波长的滤光片进行检测？

A7：也可以使用490 nm的滤光片。但是，吸光度会低于在450nm处的吸光度。(见下图)

参考文献

1)Cobler,L.et al.,”xCT inhibition sensitizes tumors to γ-radiation via glutathione reduction”,Oncotarget,2018,9,32280-32297.

2)Tobias,M.et al.,”Role of GPX4 in ferroptosis and its pharmacological implication”,Free Radical Bioglogy and Medicine,2019,133,144-152.

R252/活性氧检测试剂盒（ROS Assay Kit）

R252/活性氧检测试剂盒（ROS Assay Kit）,ROS Assay Kit -Highly Sensitive DCFH-DA,ROS Reactive Oxygen Species 主要是在线粒体中合成 ATP时所产生的高活性氧簇。ROS对细胞内的信号传导和吞噬作用等免疫机能起着重要的作用。另一方面， ROS对DNA和蛋白质的氧化作用也是各种疾病和细胞衰老的原因之一。

货号：R252
活性氧检测试剂盒
ROS Assay Kit -Highly Sensitive DCFH-DA
储存条件：0-5°C
运输条件：常温

特点：

比DCFH-DA更高的灵敏度
可多种仪器上机

选择规格：100 tests

试剂盒内含

Highly Sensitive DCFH-DA Dye 10ulx1
Loading Buffer (10x) 1m| x 1

产品概述

ROS Reactive Oxygen Species 主要是在线粒体中合成 ATP时所产生的高活性氧簇。ROS对细胞内的信号传导和吞噬作用等免疫机能起着重要的作用。另一方面， ROS对DNA和蛋白质的氧化作用也是各种疾病和细胞衰老的原因之一。

最近的研究发现，由二价铁所诱发的芬顿反应所引起的一种新的细胞死亡方式（铁死亡，Ferroptosis）的研究领域里 ROS也被广泛关注，检测 ROS的需求和意义也在不断升高 1)。目前在检测 ROS时，使用最多的试剂是DCFH-DA。但是 DCFH-DA往往有灵敏度低、样品荧光与背景的差别不明显等问题。本试剂盒是一种高灵敏度的ROS检测试剂盒，而且配套使用本试剂盒内附带的 Buffer，可以在相对更低的细胞毒性下对 ROS进行高灵敏度检测。

荧光特性

技术信息

与市面现有试剂的比较

活性氧反应的选择性

高灵敏度DCFH-DA与常规DCFH-DA对活性氧（ROS）的反应性相同。
另外，由于具有与DCFH-DA相同的荧光特性（λex：505nm，λem：525nm），因此能够以相同的激发/荧光波长进行检测。

检测灵敏度的比较

用DCFH-DA和ROS检测试剂盒-高灵敏度DCFH-DA-分别对过氧化氢（1×10 ⁴细胞/ ml）处理的HeLa细胞进行染色，并比较细胞内ROS的荧光结果。结果显示，在任何检测仪器中，同仁化学ROS检测试剂盒-高灵敏度DCFH-DA都以比DCFH-DA拥有更高的灵敏度。

（1）荧光显微镜检测

<检测条件>
Ex.488 nm / Em.500 -560 nm
细胞种类：HeLa细胞

（2）使用荧光酶标仪检测

<检测条件>
Ex.490-520 nm / Em.510-540 nm
细胞种类：HeLa细胞

（3）使用流式细胞仪检测

<检测条件>
FITC激发电压：215 V
细胞种类：HeLa细胞

实验例

一.Erastin处理的A549细胞的内在性ROS的检测

1. 向 ibidi 8-well plate中接种A549细胞 (1××10⁴ cells/ml, DMEM, 10% fetal bovine serum, 1% penicillin-37°C 、 5% CO2培养箱内过夜培养。

2. 去除培养基，加入用 DMEM培养基稀释好的 50 μμmol/l的 Erastin溶液， 37°C 、 5% CO₂培养箱过夜培养。

3. 去除上清，HBSS清洗 2次，加入 Highly Sensitive DCFH-DA Dye working solution 37°C 、 5% CO₂培养箱培养 30 min。

4. 去除Working solution HBSS清洗 2次，再次加入 HBSS，用荧光显微镜观察。

二.LPS处理的巨噬细胞内源性ROS的检测

用LPS（脂多糖）处理的RAW264.7细胞中细胞内ROS的变化的荧光成像结果显示，LPS处理可增加细胞内ROS。

<检测条件>
细胞内ROS（高灵敏度DCFH-DA染料）：Ex. 488 nm / Em.500 -560 nm

<实验操作>
1.在ibidi 8孔板中接种RAW264.7细胞（3×104细胞，DMEM，10％胎牛血清，1％青霉素-链霉素）
2.培养箱（37℃，5％）过夜培养
3.除去培养基，用HBSS洗涤细胞两次，然后添加用DMEM培养基稀释的500 ng / ml LPS
4.培养箱（37°C，5％CO2）孵育20小时
5.除去上清液，用HBSS洗涤细胞两次，然后添加高灵敏度DCFH-DA染料工作液。
6.培养箱（37°C，5％CO2）培养30分钟
7.培养30分钟后除去工作溶，用HBSS洗涤细胞两次后再添加HBSS并用荧光显微镜观察。

三.柳氮磺吡啶(SSZ)引起的细胞内代谢变化

向A549细胞添加已知抑制胱氨酸/谷氨酸转运蛋白（xCT）的柳氮磺吡啶（SSZ）之后，确认了细胞内的ROS、ATP、α-谷氨酸（α-KG）、谷胱甘肽（GSH）的变化和谷氨酸释放量的变化。

结果显示，由于SSZ的添加，细胞内的ATP、谷胱甘肽（GSH）以及谷氨酸的释放量减少，细胞内的α-谷氨酸和ROS增加。

常见问题Q&A

Q1: 请告诉我一个试剂盒可以测多少个样品？
A1:可以测量的样品数量请参考以下内容。
・96-well plate：1块
・ibidi8-well plate：6块
・35mm dish：5块
・6-well plate：5孔
Q2:有没有可以用作阳性对照的实验例？
A2：使用说明书上记载了经过过氧化氢处理的HeLa细胞的检测实验例。
Q3: Highly Sensitive DCFH-DA working solution可以用Loading Buffer以外的溶液配置吗?
A3:为了减轻染色时对细胞的损伤，推荐使用附带的Loading Buffer配置，Hanks’HEPES和HBSS也可以进行制备。如果用培养基进行制备时请使用无血清培养基。
Q4:染色后的清洗可以使用PBS代替HBSS吗？
A4：为了减轻对细胞的损伤推荐HBSS。如果手头没有HBSS的话，建议用培养基清洗。
Q5:用荧光显微镜检测时有什么注意事项吗？
A5：染料与ROS反应并氧化后发出荧光。如果激发光持续照射，则染料会被氧化，背景会上升，因此，在获取荧光成像图像时，请先调整明场环境下的焦点和参数，然后再获取荧光图像。

参考文献

1）Shogo Okazaki et al., “Glutaminolysis-related genes determine sensitivity to xCT-targeted therapy in head and neck squamous cell carcinoma”. Cancer Sci., 2019, doi:10.1111/cas.14182.

G263/GSSG/GSH Quantification Kit II-氧化型/还原型谷胱甘肽定量试剂盒

G263/GSSG/GSH Quantification Kit II-氧化型/还原型谷胱甘肽定量试剂盒,谷胱甘肽 (γ-L-谷氨酰-L-半胱氨酰-甘氨酸) 是体内的一种三肽化合物，它参与抗氧化和药物代谢的过程，还是谷胱甘肽过氧化物酶、谷胱甘肽S-转移酶、巯基转移酶等的底物。谷胱甘肽通常以还原型状态(GSH) 存在，但是GSH在氧化应激的作用下会转化为氧化型状态 (GSSG)。因此GSH/GSSG的比值被认为是氧化应激研究的一个重要指标。

货号：G263
氧化型/还原型谷胱甘肽定量试剂盒
GSSG/GSH Quantification Kit II
储存条件：0-5度保存
运输条件：室温

特点：

细胞、组织样品均可检测
操作更加简单
试剂盒稳定性高

选择规格：100tests

关联产品TOP5

NO.1. Liperfluo 细胞脂质过氧化物检测
NO.2. FerroOrange 细胞亚铁离子检测
NO.3. Cell Counting Kit-8 细胞增殖毒性检测
NO.4. ROS Assay Kit -Highly Sensitive DCFH-DA- ROS检测
NO.5. Calcein-AM/PI Double Staining Kit 活死细胞双染检测

概述

谷胱甘肽 (γ-L-谷氨酰-L-半胱氨酰-甘氨酸) 是体内的一种三肽化合物，它参与抗氧化和药物代谢的过程，还是谷胱甘肽过氧化物酶、谷胱甘肽S-转移酶、巯基转移酶等的底物。谷胱甘肽通常以还原型状态(GSH) 存在，但是GSH在氧化应激的作用下会转化为氧化型状态 (GSSG)。因此GSH/GSSG的比值被认为是氧化应激研究的一个重要指标。

优势

1）可以进行氧化型谷胱甘肽（GSSG）、还原型谷胱甘肽（GSH）的分类定量。

2）操作简单，且可以同时检测多个样品。

操作步骤

详见说明书

注意事项

试剂开封后各溶液的保存方法及保存时间

Substrate Working Solution：溶解后在-20℃可保存2个月

GSH Standard Solution：溶解后在-20℃可保存2个月

GSSG Standard Solution：溶解后在-20℃可保存2个月

Enzyme Working Solution：稀释后在4℃可保存2个月

Coenzyme Working Solution：用超纯水溶解后在-20℃可保存2个月

Masking Solution：用乙醇溶解后在4℃可保存2个月

其他材料

酶标仪（405或415 nm）、20 µl和200 µl移液器，多通道移液器、 96孔板、 5-磺基水杨酸 (SSA) 溶液、乙醇

常见问题Q&A

Q1:如何计算GSH浓度？
A1:根据标准曲线得到总谷胱甘肽（GSH+GSSG）的浓度，使用以下公式计算GSH浓度。
GSH浓度=总谷胱甘肽浓度-GSSG浓度×2
GSSG（氧化型谷胱甘肽）相当于两分子的GSH（还原型谷胱甘肽）。
因此，通过将GSSG浓度加倍从而得到GSH浓度。
Q2:是否可以通过添加Masking Reagent来掩盖源自GSSG的GSH？
A2:加入酶/辅酶之后，由GSSG产生的GSH先与DTNB反应，而还原为GSSG。GSSG生成的GSH不会被屏蔽。
Q3:本试剂盒与谷胱甘肽定量试剂盒（货号：T419）有什么区别？
A3:本试剂盒可以分别检测GSSG和GSH，而总谷胱甘肽定量试剂盒（T419）则无法实现。作为氧化应激指标的GSH和GSSG的比例更加受引研究人员关注。
Q4:显色效果弱怎么办？
A4:考虑以下原因：
原因1）本试剂盒的测量范围是0.5 μmol/l及以上，测量样品中所含的谷胱甘肽的量可能小于该值。
对策）本试剂盒无法测量不符合测量范围的样品，请考虑其他方法检测。例如HPLC方法。
也可以通过降低预处理的稀释率或增加样品量来增加检测样品的浓度。
注意：为了加强显色效果而延长显色时间，则无法获得标准曲线。
原因2）可能含有抑制荧光的物质。例如：与SH基团反应的化合物（马来酰亚胺）会干扰测量结果。
对策）由于无法通过预处理等去除这些化合物，因此请在不含有此类物质的情况下再检测。
原因3）反应中的pH值低，有可能抑制显色。
对策）1、测量时，请确保SSA浓度为1％或更低。当SSA浓度为1％或更高时，会抑制显色效果。
2、如果含有其他酸性物质，则在测量前用三乙醇胺等将其中和至pH 7，或将它们稀释至约1％或更低的酸浓度下进行反应。
Q5:该试剂盒可以检测多少样品？
A5:本试剂盒可以进行100次检测（使用1块96孔板）
当n=3时，可以检测9个样品。（样品未染色）
如果仅测量谷胱甘肽的总量，可以检测25个样品。
样品的布局例：通道1～6是GSSG浓度测定，通道7～12是总谷胱甘肽浓度测定。

Q6:样品中有大量谷胱甘肽，如何稀释样品？
A6:用0.5％5-磺基水杨酸（SSA）水溶液稀释。
测量时样品中的SSA浓度应为0.5至1％。
如果SSA浓度高，则反应过程中的pH值会呈酸性，这可能会影响吸光度。
Q7:通过测量GSSG与GSH的比例可以得到什么？
A7:谷胱甘肽通常在体内以还原形式（GSH）存在，
因为它通过刺激（例如氧化应激）转化为氧化形式（GSSG）
GSH与GSSG之比是氧化应激的指标。

参考文献

1) ER Stress Cooperates with Hypernutrition to Trigger TNF-Dependent Spontaneous HCC Development,Cancer Cell,2014,26, 331–343

2) Rhythmic oscillations of the microRNA miR-96-5p play a neuroprotective role by indirectly regulating glutathione levels,Nature Communications,2014,5,3823

3) Phospholipid methylation controls Atg32-mediated mitophagy and Atg8 recycling,The EMBO Journal,2015,34(21),2703–2719

4) Administering xCT inhibitors based on circadian clock improves antitumor effects,Cancer Research,2017,77(23),6603-6613

5) Cold stress-induced ferroptosis involves the ASK1-p38 pathway,EMBO reports,2017,18(11),2067-2078

6) Chloroplast DNA Replication Is Regulated by the Redox State Independently of Chloroplast Division in Chlamydomonas reinhardtii,Plant Physiology,2013,161,2102–2112

7) Oxidative stress inhibits healthy adipose expansion through suppression of SREBF1-mediated lipogenic pathway,Diabetes,2018,67(6),1113-1127
8）Endogenous reactive oxygen species cause astrocyte defects and neuronal dysfunctions in the hippocampus: a new model for aging brain,Aging Cell,2017,16,39–51

9) Ubiquinol-10 Supplementation Activates Mitochondria Functions to Decelerate Senescence in Senescence-Accelerated Mice,Antioxidants & Redox Signaling,2014,20(16),2606-2620

10) Skeletal muscle-specific eukaryotic translation initiation factor 2α phosphorylation controls amino acid metabolism and fibroblast growth factor 21-mediated non-cell-autonomous energy metabolism,

The FASEB Journal,2016,30(2),798-812

11) Riluzole exerts distinct antitumor effects from a metabotropic glutamate receptor 1-specific inhibitor on breast cancer cells,Oncotarget,2017,8(27),44639-44653

M496/MDA检测试剂盒

M496/MDA检测试剂盒,本试剂盒采用经典的TBA法，通过检测MDA/硫代巴比妥酸(TBA)复合体的荧光或吸光度来检测细胞或组织中的MDA浓度。此外，试剂盒中还附带MDA标准溶液，以便通过标准曲线定量检测样品中的MDA

货号：M496
MDA检测
MDA Assay Kit
储存条件：-20度保存，避光
运输条件：室温

特点：

细胞、组织样品均可检测
操作更加简单
采用荧光法灵敏度更高

选择规格：100tests

试剂盒内含

Lysis Buffer	6.5 ml × 1
Dilution Buffer	10 ml× 1
MDA Standard(蓝盖)	200 ul (1 mmol/l)×1
Substrate (红盖)	58 mg x 1
Antioxidant(绿盖)	200 ul×1

产品概述

丙二醛(MDA)是脂质过氧化物分解后形成的一种化合物。因此，MDA 是检测细胞和组织中脂质过氧化物的最常见的指标之一，在氧化应激、铁死亡等领域的研究中被广泛使用。MDA Assay Kit 可以定量检测样品中的 MDA 浓度，通过硫代巴比妥酸（TBA）与水解产生的 MDA 反应形成的 TBA 复合体的吸光度或荧光强度来定量检测样品中的丙二醛（MDA）。试剂盒中配有抗氧化剂(Antioxidant)，可以防止样品在反应过程中发生不必要的氧化，从而确保获得准确的实验结果。

测定原理

本试剂盒采用经典的TBA法，通过检测MDA/硫代巴比妥酸(TBA)复合体的荧光或吸光度来检测细胞或组织中的MDA浓度。此外，试剂盒中还附带MDA标准溶液，以便通过标准曲线定量检测样品中的MDA。

产品特点

简化操作步骤

一般的MDA检测试剂盒(TBA法)，作为底物的硫代巴比妥酸(TBA)需要天平称量和高温加热溶解的步骤。而同仁化学研究所的MDA试剂盒中的TBA无需称量和加热溶解的操作，从而减少由于称量等造成的误差，使得实验结果的孔间差更小。同时，还可大幅缩短操作所需的时间。

细胞、组织样品均可检测

细胞样品通过荧光法检测。组织样品可以根据样品中MDA的含量在荧光法和吸光度法之间自由选择。具体可参考下表。

实验例

由于Erastin可以抑制xCT（胱氨酸/谷氨酸转运体），是最常见的铁死亡诱导剂之一。使用同仁化学研究所的MDA试剂盒检测Erastin处理的HepG2(人肝癌细胞)中MDA的变化。通过标准曲线(用BCA法蛋白定量校准后)，计算样品中MDA的浓度。可以发现，Erastin处理的细胞中，MDA含量明显上升。

UP05/Cystine Uptake Assay Kit-胱氨酸摄取能力检测试剂盒

UP05/Cystine Uptake Assay Kit-胱氨酸摄取能力检测试剂盒,试剂盒内含的胱氨酸类似物(Cystine Analog, CA)与胱氨酸一样可以通过xCT的转运进入细胞内。细胞裂解后通过添加Reducing Agent还原CA并与检测试剂FOdA特异性反应，生成可产生荧光的物质。

货号：UP05
胱氨酸摄取能力检测试剂盒
Cystine Uptake Assay Kit
储存条件：-20度保存
运输条件：常温

特点：

可用荧光酶标仪高通量筛选

选择规格：20tests,100tests

产品概述

胱氨酸(Cystine)是抗氧化物质谷胱甘肽(GSH)的来源，在细胞内的氧化还原平衡中发挥着重要的作用。在癌症研究领域，Sulfasalazine、Erastin等xCT(胱氨酸/谷氨酸反向转运体)抑制剂可以改变细胞内的氧化应激平衡，进而引发细胞死之一的铁死亡。而在免疫研究领域，据报道，巨噬细胞和中性粒细胞在免疫刺激剂的作用下，xCT的表达会增高并增加细胞内的GSH水平，以平衡自身出于攻击癌细胞目的所释放的ROS。因此，无论是对癌细胞的研究还是免疫细胞的研究都离不开胱氨酸摄取能力这一重要指标。

检测原理

试剂盒内含的胱氨酸类似物(Cystine Analog, CA)与胱氨酸一样可以通过xCT的转运进入细胞内。细胞裂解后通过添加Reducing Agent还原CA并与检测试剂FOdA特异性反应，生成可产生荧光的物质。[专利申请中]

检测实例

xCT抑制剂Sulfasalazine, Erastin的抑制效果评价

使用本试剂盒对xCT抑制剂Sulfasalazine和Erastin的抑制效果进行评价。荧光结果显示，两种抑制剂均对胱氨酸的摄取有明显的抑制作用。

与传统方法比较

以往在胱氨酸摄取检测时一般采用同位素示踪法，下面是本试剂盒与同位素示踪法结果的比较。

常见问题Q&A

Q1：氨基酸类似物(CA)具体是通过哪种转运体进入细胞内的？
A1：Cystine Analog是通过胱氨酸/谷氨酸转运体(xCT)进入细胞内的。
Q2：目前有检测实绩的细胞有哪些？
A2：下列细胞都有检测实绩：
人胶质母细胞瘤细胞, A172
人类肺泡基底上皮细胞, A549
人恶性黑色素瘤细胞, A375
人结肠癌细胞, HCT116
人肝癌细胞, HepG2
人早幼粒白血病, HL60
人纤维肉瘤细胞, HT1080
小鼠胚胎成纤维细胞, MEF
人小细胞肺癌细胞, SBC-5
人胶质瘤细胞, U-251 MG
Q3：氨基酸类似物(CA)进入细胞后会被分解、代谢掉吗？
A3：氨基酸类似物(CA)的构造非常稳定，实验范围内的操作不会被分解或代谢。
Q4：可以用这个试剂盒进行定量检测胱氨酸吗？
A4：本试剂盒不是胱氨酸定量检测试剂盒。
Q5：可以用这个试剂盒对进入细胞内的胱氨酸定量检测吗？
A5：不能定量检测进入细胞内的胱氨酸，本试剂盒是针对细胞摄取胱氨酸能力的数值化检测试剂盒。
Q6：观察不到荧光变化的时候，应该怎么办？
A6：延长CA Uptake solution与细胞的共培养时间(0.5 ~ 1 h)。
Q7：背景荧光较高时，应该怎么办？
A7：环境中可能有未被细胞摄取的胱氨酸类似物残存，用PBS清洗后再进行检测。
Q8：配制CA Uptake solution时，除了不含胱氨酸的无血清培养基以外，还可以使用哪些Buffer？
A8：检测HeLa细胞时，有过使用HBSS或含有0.1% Glucose PBS（+）进行配制的成功实例。
Q9：如何用细胞数对荧光强度进行补正？
A9：可以通过细胞核染色试剂进行补正。也可以使用同仁化学研究所的 Cell Count Normalization Kit (货号C544)进行细胞数补正。
Q10：一般使用哪种孔板比较好？
A10：下列厂家得孔板有过检测实绩：
公司名/ 产品名/ 货号
Ibidi/ μPlate 96 well ibiTreat black S 15/ Ib89626
AGC techno glass/ EZVIEW Glass Bottom Culture Plate LB 96well/ 5866-096
Thermo Fisher/ 96 Well Black/Clear Bottom Plate, TC Surface, Pack of 10/ 165305
Q11：Cystine uptake solution可以长期保存吗？
A11：CA Uptake solution无法长期保存，请提前计算好用量，务必现用现配。

关联产品

产品名	包装	价格	货号
Glucose Uptake Assay Kit-Blue	1 set	3,980	UP01
Glucose Uptake Assay Kit-Green	1 set	3,980	UP02
Glucose Uptake Assay Kit-Red	1 set	3,980	UP03

I291/Iron Assay Kit -Colorimetric-试剂盒

I291/Iron Assay Kit -Colorimetric-试剂盒,近年来，随着铁死亡概念的提出，细胞内铁离子的代谢过程的研究逐渐成为了研究热点。同仁化学研究所开发的 Iron Assay Kit-Colorimetric-试剂盒是一套操作简便的比色法铁离子检测试剂盒。

货号：I291
Iron Assay Kit -Colorimetric-组织铁离子定量试剂盒
Iron Assay Kit -Colorimetric
储存条件：0-5度保存
运输条件：室温

特点：

组织检测
配有标准品，可定量二价、三价铁含量
吸光度法

选择规格：50tests

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NO.1. FerroOrange 细胞亚铁离子检测
NO.2. Liperfluo 细胞脂质过氧化物检测
NO.3. Cell Counting Kit-8 细胞增殖毒性检测
NO.4. ROS Assay Kit -Highly Sensitive DCFH-DA- ROS检测
NO.5. GSSG/GSH Quantification Kit II 氧化型/还原型谷胱甘肽

试剂盒内含

50 tests	Probe Solution 7ml ×1管 Assay Buffer20 ml×1管
	Standard(黄盖）150 ul (1 mmol/l)×i管
	Reducer(蓝盖）×1管

产品概述

铁是生物体内最重要的金属元素之一，生物体内铁元素的含量虽少，但有着重要的生理作用。近年来，随着铁死亡概念的提出，细胞内铁离子的代谢过程的研究逐渐成为了研究热点。同仁化学研究所开发的 Iron Assay Kit-Colorimetric-试剂盒是一套操作简便的比色法铁离子检测试剂盒。与其他市面上的检测试剂盒相比，可以在更短的时间内进行快速检测。通过比较组织裂解液中的铁离子探针 3-(2-Pyridyl)-5,6-bis(5-sulfo-2-furyl)-1,2,4-triazine, disodium salt的吸光度与还原成二价铁离子的三价铁标准品的吸光度，即可确定组织样品中的二价铁含量。同时，还可以通过试剂盒中的还原剂将样品中的三价铁还原成二价铁，以确定总铁含量，进而计算出样品中三价铁的含量。

原理

金属离子选择性

加标回收实验

实验例

组织样品中的Fe²⁺和 Fe³⁺的检测

1. 称量 100 mg肝脏组织。

2. 加入 1 ml冷 PBS，移液器吹打 20次， Vortex振荡 10 s 14,000 RPM离心 4 min，去除上清。

3. 将样品转移至研钵，加入液氮充分研磨成粉末后，加入 1.3 ml Assay Buffer，回收至微管中。

4. 将含有样品的微管置于超声波水浴中 5 min。（为防止样品温度上升，每 1 min间隔置于冰浴上 20 s）。

5. 16,000 g离心 10 min，除去不溶物。

6. 取 1300 μl上清液，每管分别加入 400 μl上清液，制成二价铁样品、总铁样品、样品空白。

7. Standard管中加入 Reducer solution。（参考图 2 H管 30 μl、 G~C管 20 μl、 B管 40 μl、 A管 20 μl）。

二价品样品管中加入 20 μl Assay Buffer。

总铁样品管中加入 20 μl Reducer solution。

样品空白管中加入 20 μl Assay Buffer。

将所有的 Standard管、样品管、样品空白管 37 培养 15 min。

8. 参考表 1和表 2，加入至 96孔板中 37 培养 60 min，检测 593 nm处的吸光度。

9. 将酶标仪数据拷贝至 “Iron Assay Kit – Excel表 ”，自动计算出二价铁和三价铁浓度。

参考文献

Hao Ren,et.cl，“Self-assembled FeS-based cascade bioreactor with enhanced tumor penetration and synergistic treatments to trigger robust cancer immunotherapy”，APSB，2020，DOI:10.1016/j.apsb.2021.05.005

F374/FerroOrange-二价铁离子检测探针

F374/FerroOrange-二价铁离子检测探针,铁是生物体内最丰富的过渡金属元素，它参与各种生理过程活动。近年来，活细胞中的游离铁受到广泛关注，游离铁最常以其稳定的氧化还原态存在，即亚铁离子 (Fe2+) 和铁离子 (Fe3+)。对研究者来说，在研究细胞内的还原环境，金属转运蛋白和Fe2+的水溶性时，了解Fe2+的行为比了解Fe3+的行为更为重要。FerroOrange作为一种新型的荧光探针，可对活细胞内的Fe2+进行荧光成像。

货号：F374
细胞亚铁离子检测荧光探针
FerroOrange
储存条件：0-5度保存
运输条件：室温

特点：

荧光法高敏检测胞内二价铁
适合于多种检测仪器
铁死亡常见指标之一

选择规格：1 tube,3 tubes

关联产品TOP5

NO.1. Liperfluo 细胞脂质过氧化物检测
NO.2. GSSG/GSH Quantification Kit II 氧化型/还原型谷胱甘肽
NO.3. Cell Counting Kit-8 细胞增殖毒性检测
NO.4. Mito-FerroGreen 线粒体内亚铁离子检测
NO.5. ROS Assay Kit 活性氧检测

规格性状

性状：可溶于乙腈，甲醇和二甲基亚砜。

纯度（HPLC）：92.0%以上

荧光光谱：符合一致性

产品概述

铁是生物体内最丰富的过渡金属元素，它参与各种生理过程活动。近年来，活细胞中的游离铁受到广泛关注，游离铁最常以其稳定的氧化还原态存在，即亚铁离子 (Fe²⁺) 和铁离子 (Fe³⁺)。对研究者来说，在研究细胞内的还原环境，金属转运蛋白和Fe²⁺的水溶性时，了解Fe²⁺的行为比了解Fe³⁺的行为更为重要。FerroOrange作为一种新型的荧光探针，可对活细胞内的Fe²⁺进行荧光成像。

原理

FerroOrange检测胞内Fe²⁺

图为将2 μl的1 mmol/l FerroOrange和2 μl的10 mmol/l的各种金属离子添加到1 ml的50 mmol/l HEPES缓冲液（pH 7.4）中，并在室温下反应1小时后测量的荧光强度。

荧光特性

Ex：543 nm Em：580 nm

铁离子试剂的选择

	FerroOrange	Mito-FerroGreen
存在部位	细胞内	线粒体
荧光特性	λex : 543 nm、λem : 580 nm	λex : 505 nm、λem : 535 nm
检测仪器	荧光显微镜、荧光酶标仪（Cy3）	荧光显微镜（FITC、GFP）
测定对象	活细胞	活细胞
检测次数	24μg可染色17次35mm dish （终浓度为1μmol/l）	50μg可染色5次35mm dish （终浓度为5μmol/l）

与其他染料共染

FerroOrange与各种细胞内的染色试剂共染

用各种染色试剂染色HeLa细胞，清洗细胞。然后将FerroOrange添加到细胞中，并用荧光显微镜观察。

与ER染色试剂共染

＜检测条件＞

FerroOrange: Ex: 561 nm、Em: 570-620 nm

ER Tracker Green（ER染色试剂）: Ex: 488 nm、Em: 510-555 nm

标尺: 10 μm

与线粒体染色试剂共染

＜检测条件＞

FerroOrange: Ex: 561 nm、Em: 570-620 nm

MitoBright Deep Red（线粒体染色试剂）: Ex: 640 nm、Em: 650-700 nm

标尺: 10 μm

与高尔基体染色试剂的共染

＜检测条件＞

FerroOrange: Ex: 561 nm、Em: 570-620 nm

BODIPY FL（高尔基体染色试剂）: Ex: 488 nm、Em: 510-555 nm

标尺: 10 μm

操作步骤

1.细胞接种于荧光培养皿中，在37℃，5% CO₂培养箱中孵育过夜。

2.弃去上清液，并用HBSS或无血清培养基洗涤细胞3次。

3.更换含有药物的培养基，在37℃，5% CO₂培养箱中孵育。

* 请根据药物特性优化孵育时间。

4.加入浓度为1 μmol/l的FerroOrange工作液，在37℃，5% CO₂培养箱中孵育。

* 加入FerroOrange染色剂后请立即观察，不要洗涤。

5.在荧光显微镜下观察细胞。

高灵敏度检测胞内铁离子

使用HeLa细胞，通过FerroOrange确认细胞内Fe²⁺的变化

与对照组的细胞相比，用硫酸亚铁 (II) 铵处理的HeLa细胞的FerroOrange荧光强度增加。相反，在用Bpy处理的细胞中，其荧光强度降低。

因此，证明FerroOrange与细胞内Fe²⁺反应。

A: 对照组

B: 铁剂·硫酸亚铁(II) 铵（终浓度100umol/l）处理

C: 铁螯合剂·2,2′-Bipyridyl (Bpy)（终浓度100umol/l）处理

检测条件 Ex/Em = 561 nm/570-620 nm 比例尺：20 μm

使用流式细胞仪检测

通过流式细胞仪进行定量分析

——FerroOrange的荧光强度可能受细胞密度和细胞种类的影响

——培养基的更换和清洗可能使染料从细胞内泄露

——进行流式定量分析时，需优化实验步骤

<Usage Example>
1. HeLa cells (1 x105 cells/well) in MEM (10% fetal bovine serum, 1% penicillin-streptomycin) were seeded on a 6 well plate and were cultured at 37oC in a 5% CO2 incubator overnight.
2. The cells were washed with serum-free medium (2 mL) three times. Then, serum-free medium (1 mL) was added to the cells.
3. 10 mmol/L Ammonium iron (II) sulfate (10 μL) was added to wells (The final concentration: 100 μmol/L).
4. To mix Ammonium iron(II) sulfate and serum-free medium, the entire medium was pipetted up from wells and then immediately pipetted back one time.
5. The cells were incubated for 20 min in a 37oC incubator equilibrated with 95% air and 5% CO2, and the cells were washed with HBSS (1 mL) three times.
6. After trypsinization (250 µL), stop the reaction with serum medium (1 mL), 1.25 ml of the cell suspension was transferred to a microcentrifuge tube.
7. The cells suspension was centrifuged at 1,500 rpm for 3 minutes.
8. The supernatant was discarded and HBSS (1 mL) was added to the microcentrifuge tube and suspended by pipetting.
9. The cells suspension was centrifuged at 1,500 rpm for 3 minutes and the supernatant was discarded.
10. 1 μmol/L FerroOrange in MEM (serum-free medium) (300 μL) was added to the cells.
11. The cells were incubated for 15 -30 min in a 37oC incubator equilibrated with 95% air and 5% CO2.
12. The stained cells were passed through a cell strainer and analyze samples using a flow cytometer.

<注意点>

1.清洗对于结果分析的影响

2.染料体积对于结果分析的影响

常见问题Q&A

Q1:FerroOrange由于是活细胞荧光探针，如果铁死亡发生，导致细胞膜破裂后，荧光是否存在？

A1:由于FerroOrange是活细胞探针，对死细胞无法发挥出探针的正常性能。

Q2: FerroOrange只会检测游离铁吗？还是某些如铁硫蛋白里的结合铁，都可以检测吗？

A2：FerroOrange只检测游离的二价铁

Q3: 有哪些帮助实验成功的技巧？

A3:（1）染色后不要清洗工作液，因为这样可能会让细胞内的FerroOrange泄露出来。

（2）为了获得更加可靠的实验数据，我们建议准备Bpy（2,2`联吡啶，抑铁剂）或硫酸亚铁铵（增铁剂）处理的细胞作为对照组，以便于FerroOrange的数据进行比较。

Q4: FerroOrange能否用于固定处理之后的样本?

A4:不能用于石蜡切片。

试剂能尝试于温和条件下固定处理之后的样本，如多聚甲醛（PFA，终浓度3%）在4°C中培养10 min。与未固定的样本相比，固定20 min以上或室温固定后的样本的荧光强度会明显降低。请注意本探针可能很难于固定样本中使用，必须先进行染色，然后做尝试。

Q5:本探针适合于什么检测方式？

A5:见表格

我们建议使用绿色激光（Ex:532 nm）激发FerroOrange

Q6:染色时需要注意什么？

A6：注意如下，

1.FerroOrange染色后的对培养基的更换。

染色后无需清洗工作液，通常血清中含有铁离子，请注意使用不含血清的培养基，所以染色后即使细胞外有残留的FerroOrange，但是因为细胞外没有血清中铁离子的影响，也不会产生背景荧光的问题。

2.细胞难以染色(灵敏度低)时的办法。

根据细胞种类的不同，染色程度也有差异。

使FerroOrange working solution浓度高于推荐的1 µmol/l进行染色。建议在1-5 µmol/l范围内染色。

Q7:使用荧光酶标仪的操作步骤

A7：请参考下面的实验例子进行测量。

<测定样品>。

样品A：无添加剂(仅HeLa细胞)。

样品B：添加了铁螯合试剂2,2`-bipyridyl(Bpy)的HeLa细胞。

样品C：添加铁(硫酸铵铁)的HeLa细胞。

<测量操作>。

1.在96孔黑板(透明底)上接种100 µl HeLa细胞悬液，使其达到10,000 cells/well，在37℃ 5%CO2 培养箱中过夜培养。

2.样品C的细胞用MEM(不含FBS)100 µl洗涤3次。

3.向样品C中添加100 μl硫酸铵铁(II)/MEM(不含FBS) (最终浓度: 100 µmol/l)，在37℃ 5%CO2培养箱中静置30分钟。

4.用100 µl HBSS洗涤所有孔的细胞3次。

5.向样品A和C中添加100 μl的1 µmol/l FerroOrange working solution ，向样品B中添加100 μl含有FerroOrange(最终浓度:1 µmol/l)和Bpy(最终浓度:100 µmol/l)的HBSS溶液，在37℃ 5%CO2培养箱中培养30分钟。

6.用多功能读板器检测各样品的荧光强度(Ex:543 nm,Em:580 nm)。

Q8：推荐的滤光片

A8: 激发滤光片:530-565 nm
发射滤光片:570-620 nm

Q9: FerroOrange染色后是否有必要洗掉工作液？

A9:我们建议染色后不要清洗，因为这样可能会导致细胞中的FerroOrange泄露出来。

以下有关于不同细胞密度和细胞种类确认的情况，

<不同细胞密度>

<不同细胞种类>

参考文献

1.K. Tomita, M. Fukumoto, K. Itoh, Y. Kuwahara, K. Igarashi, T. Nagasawa, M. Suzuki, A. Kurimasa and T. Sato, “MiR-7-5p is a key factor that controls radioresistance via intracellular Fe2+ content in clinically relevant radioresistant cells.”, Biochem. Biophys Res Commun., 2019,DOI: 10.1016/j.bbrc.2019.08.117

2.Y. Wang and M. Tang, “PM2.5 induces ferroptosis in human endothelial cells through iron overload and redox imbalance”, Environ. Pollut., 2019, 264,DOI: 10.1016/j.envpol.2019.07.105

3.S Guo, X Yao, Q Jiang, K Wang, Y Zhang, H. Peng, J. Tang and W. Yang , “Dihydroartemisinin-Loaded Magnetic Nanoparticles for Enhanced Chemodynamic Therapy”, Front Pharmacol,2020,11,226.DOI: 10.3389/fphar.2020.00226

4.R. A. Weber, F. S. Yen, S.P.V. Nicholson, H. Alwaaseem, E.C. Bayraktar,M. Alam, R. C. Timson, K. La, M. Abu-Remaileh, H. Molina and K. Birsoy, “Maintaining Iron Homeostasis Is the Key Role of Lysosomal Acidity for Cell Proliferation”, Mol. Cell, 2020, 77, 1-11.DOI: 10.1016/j.molcel.2020.01.003

5.X. Li, T. Wang, X. Huang, Y. Li, T. Sun, S. Zang, K. Guan, Y. Xiong, J. Liu and H. Yuan , “Targeting ferroptosis alleviates methionine‐choline deficient (MCD)‐diet induced NASH by suppressing liver lipotoxicity”, Liver Int., 2020,DOI: 10.1111/liv.14428

6.T. Hirayama, M. Niwa, S. Hirosawa and H. Nagasawa, “High-Throughput Screening for the Discovery of Iron Homeostasis Modulators Using an Extremely Sensitive Fluorescent Probe”, ACS Sens., 2020,DOI: 10.1021/acssensors.0c01445

论文6中记载的 “RhoNox-4”的化合物就是“FerroOrange”。

L248/Liperfluo-细胞脂质过氧化物检测

L248/Liperfluo-细胞脂质过氧化物检测,Liperfluo是Spy-LHP的类似物，可用于检测脂质过氧化物 (LPO)，Liperfluo会被脂质过氧化物特异性氧化而在乙醇等有机溶剂中发出很强的荧光。由于氧化型Liperfluo的激发和发射波长分别为524 nm和535 nm (均为长波长)，因此可以减轻光对测定样品的损伤和降低样品的自发荧光。

货号：L248
细胞脂质过氧化物检测试剂盒
Liperfluo
储存条件：0-5度保存，避光，充氮气
运输条件：室温

分子式：C51H41N2O8P

分子量：840.85

特点：

特异性检测铁死亡相关的脂质过氧化
比BODIPY C11更适合于胞内定位
铁死亡常见指标之一

选择规格：50μg,50μg*5

关联产品TOP5

NO.1. FerroOrange 细胞亚铁离子检测
NO.2. GSSG/GSH Quantification Kit II 氧化型/还原型谷胱甘肽
NO.3. Cell Counting Kit-8 细胞增殖毒性检测
NO.4. Mito-FerroGreen 线粒体内亚铁离子检测
NO.5. ROS Assay Kit 活性氧检测

规格性状

性状：深红色结晶粉末或固体。

纯度（HPLC）：90.0%以上

核磁共振谱：符合一致性

<使用次数>每50µg可用5-50次

产品概述

Liperfluo是Spy-LHP的类似物，可用于检测脂质过氧化物 (LPO)，Liperfluo会被脂质过氧化物特异性氧化而在乙醇等有机溶剂中发出很强的荧光。由于氧化型Liperfluo的激发和发射波长分别为524 nm和535 nm (均为长波长)，因此可以减轻光对测定样品的损伤和降低样品的自发荧光。由于Liperfluo在二异喹啉环的一个末端连接有四乙二醇基团，因此提高了它在水溶液中的分子分散性。虽然它的氧化型在水溶液中几乎没有荧光，但是在细胞膜等脂溶性高的部位会产生较强的荧光。因此Liperfluo适用于活细胞中脂质过氧化物的荧光成像或流式分析。

特点：

1）能够成像和检测细胞中的脂质过氧化物

2）长波长激发，可以减少光损伤和自发荧光对细胞的影响

3）高度脂质过氧化物特异性

研究领域

在铁死亡研究中：

作为细胞死亡形式之一，在铁死亡研究中使用到Liperfluo

细胞种类（铁死亡诱导剂）	论文信息
人支气管上皮细胞（RSL3）	Pseudomonas aeruginosa utilizes host polyunsaturated phosphatidylethanolamines to trigger theft-ferroptosis in bronchial epithelium.
小鼠成纤维细胞(RSL3)	Oxidized arachidonic and adrenic PE s navigate cells to ferroptosis.
HeLa细胞(添Erastin或Brefeldin A)	Golgi stress mediates redox imbalance and ferroptosis in human cells.

原理

荧光特性

激发波长Ex：488 nm，发射波长Em：500-550 nm

操作步骤

1.在dish等容器中接种细胞并培养。

2.去除培养基后，用无血清培养基清洗一次。

3.加入合适浓度的Liperfluo工作液，在37℃培养30 min。

※请根据细胞种类，诱导药物等实验条件，摸索最佳的Liperfluo工作液浓度。

4.去除上清液后，用无血清培养基清洗2次。

5.用荧光显微镜或流式细胞仪进行检测。

实验例

用激光共聚焦荧光显微镜观察HeLa细胞

1) 在 μ-slide 8孔板中 (ibidi公司) 接种HeLa细胞 (3.0×10⁴个/孔、含血清MEM培养基)，在37℃ 5%的CO₂培养箱中过夜培养。

2) 去除培养基，用无血清MEM培养基清洗细胞1次。

3) 将200 μl用无血清MEM培养基稀释的1 μmol/l的Liperfluo溶液加入8孔板中，在37℃ 5%的CO₂培养箱中培养30 min。

4) 去除溶液，用200 μl HBSS清洗2次。

5) 均匀地加入200 μl用HBSS稀释的500 μmol/l的 t-BHP(tert-Buthyl Hydroperoxide) 溶液，在37℃ 5%的CO₂培养箱中培养60 min。

6) 用共焦荧光显微镜观察 (激发波长：488 nm，发射波长：500-550 nm)。

用流式细胞仪检测HeLa细胞

1) 将HeLa细胞 (1.0×10⁵个/孔、含血清MEM培养基) 接种至6孔板(Thermo公司) 中，在37℃ 5%的CO₂培养箱中过夜培养。

2) 去除培养基，用无血清MEM培养基清洗细胞1次。

3) 将2 ml用无血清MEM培养基稀释的1 μmol/l的Liperfluo溶液加入6孔板中，在37℃ 5%的CO₂培养箱中培养30 min。

4) 去除溶液，用2 ml HBSS清洗2次。

5) 均匀地加入2 ml用HBSS稀释的500 μmol/l的t-BHP (tert-Buthyl Hydroperoxide) 溶液，在37℃ 5%的CO₂培养箱中培养60 min。

6) 用胰酶消化细胞后，用含有血清的MEM培养基重悬细胞，移至管中并将培养基更换为HBSS。

7) 用流式细胞仪检测 (激发波长：488 nm，发射波长：515-545 nm)。

用Erastin诱导铁死亡细胞的荧光成像

1) 在 μ-slide 8孔板中 (ibidi公司) 接种A549细胞 (1.0×10⁵个/孔、含血清DMEM培养基)，在37℃ 5%的CO₂培养箱中过夜培养。

2) 去除培养基，加入200 μl用无血清DMEM培养基稀释的50 μmol/l的Erastin溶液，在37℃ 5%的CO₂培养箱中过夜培养。

3) 去除培养基，用200 μl HBSS清洗2次。

4) 去除HBSS，加入200 μl用HBSS稀释的1 μmol/l的Liperfluo溶液，在37℃ 5%的CO₂培养箱中培养30 min。

5) 去除溶液，用200 μl HBSS清洗2次。

6) 用激光共焦荧光显微镜观察 (激发波长：488 nm，发射波长：500-550 nm)。

常见问题Q&A

Q1.文献实验方法：先加Liperfluo，后加药；说明书实验方法：先加药，后加探针，哪种方法比较好？

A1: 都可以。

先加Liperfluo再加药

用共聚焦荧光显微镜观察HeLa细胞

（1）在μ-slide 8孔板中（ibidi公司）接种HeLa细胞（3.0×104个/孔、含血清MEM培养基），在37℃ 5%的CO2培养箱中过夜培养。

（2）去除培养基，用无血清MEM培养基清洗细胞一次。

（3）将200 μl无血清MEM培养基稀释后的1 μmol/l的Liperfluo溶液加入8孔板中，在37℃ 5%的CO2培养箱中培养30 min。

（4）去除溶液，用200 μl HBSS清洗2次。

（5）均匀地加入200 μl用HBSS稀释的500 μmol/l的t-BHP(tert-Buthyl Hydroperoxide) 溶液，在37℃ 5%的CO2培养箱中培养60 min。

（6）用共焦荧光显微镜观察 (激发波长：488 nm，发射波长：500-550 nm)。

先加药再加Liperfluo

（1）在 μ-slide 8孔板中 (ibidi公司) 接种A549细胞 (1.0×105个/孔、含血清DMEM培养基)，

在37℃ 5%的CO2培养箱中过夜培养。

（2）去除培养基，加入200 μl用无血清DMEM培养基稀释的50 μmol/l的Erastin溶液，

在37℃ 5%的CO2培养箱中过夜培养。

（3）去除培养基，用200 μl HBSS清洗2次。

（4）去除HBSS，加入200 μl用HBSS稀释的1 μmol/l的Liperfluo溶液，

在37℃ 5%的CO2培养箱中培养30 min。

（5）去除溶液，用200 μl HBSS清洗2次。

（6）用激光共焦荧光显微镜观察 (激发波长：488 nm，发射波长：500-550 nm)。

Q2. Liperfluo如果按照文献进行，先加探针，后加药，荧光淬灭时间为2小时可能无法满足实验，希望延长荧光时间，是否有好的方法？或者是否可以加荧光防淬灭剂？

A2: 关于荧光抗淬灭剂：由于抗淬灭剂的作用原理，有可能无法在实验中使用。

其他的改善方法：

(1)如果褪色的原因是由光源照射造成的褪色。可以尝试减小光源强度进行观测。

(2)清洗操作后长时间放置可能会造成探针向细胞外漏出。可考虑不清洗直接观察。

Q3.Liperfluo由于是活细胞荧光探针，如果铁死亡发生，导致细胞膜破裂后，荧光是否存在？

A3:由于Liperfluo是活细胞探针，对死细胞无法发挥出探针的正常性能。

Q4：培养基中酚红或血清对实验有没有影响？此外，在背景高或荧光弱的情况下有没有改善意见？

A4:可用于酚红或含血清培养基。但是，如果背景高，请用PBS替换。
此外，当背景较高时，Liperfluo可能会被光自然氧化，培养时也请尽量遮光。

(溶解后请务必用铝箔等遮光)。

荧光强度弱的情况下，即使反应时间延长，背景也会变高，所以不推荐。

因此，建议调整设备 (荧光观察)的条件。

1.增强激发光的强度。

2.延长曝光时间。

Q5：悬浮和贴壁细胞都可以使用Liperfluo染色吗？是否可以染色固定细胞

A5:悬浮和贴壁细胞，都可以使用。

有实验经验的：HL-60细胞(悬浮细胞)，CHO细胞·SH-SY5Y细胞(贴壁细胞)等，固定的细胞不能染色。

参考文献

细胞种类	诱导剂	抑制剂	Liperfluo终浓度和培养时间	检测仪器	期刊名	出版年	影响因子	论文题目(含原文链接)	开放获取
B16细胞(小鼠黑色素瘤细胞); HT-1080(人纤维肉瘤细胞)	Erastin; RSL3; IFNγ	Ferrostatin-1; Liproxstatin-1	10 μM; 37℃ 30 min or 1h	流式细胞仪	Nature	2019	42.778	CD8+ T cells regulate tumour ferroptosis during cancer immunotherapy	N
HBE(人支气管上皮样细胞)	RSL3	Ferrostatin-1	10 μM; 30 min	荧光显微镜	The Journal of Clinical Investigation	2018	11.864	Pseudomonas aeruginosa utilizes host polyunsaturated phosphatidylethanolamines to trigger theft-ferroptosis in bronchial epithelium	Y
RAW 264.7(小鼠单核巨噬细胞白血病细胞)	RSL3	Ferrostatin-1	10 μM; 30 min	荧光显微镜	Nature Chemical Biology	2020	12.587	Redox lipid reprogramming commands susceptibility of macrophages and microglia to ferroptotic death	N
MEF(小鼠胚胎成纤维细胞)	RSL3	Liproxstatin-1	10 μM; 30 min	荧光显微镜	Nature Chemical Biology	2016	12.587	Oxidized arachidonic and adrenic PEs navigate cells to ferroptosis	N
NCI-ADR/Res (NAR) 人卵巢腺癌细胞	RSL3; Arachidonic Acid	–	10 μM; 30 min	荧光显微镜	Biomaterials	2019	10.317	Triggered ferroptotic polymer micelles for reversing multidrug resistance to chemotherapy	N
4T1细胞(小鼠乳癌细胞)	RSL3	–	10 μM	荧光显微镜	ACS Applied Materials & Interfaces	2019	8.758	Boosting the Ferroptotic Antitumor Efficacy via Site-Specific Amplification of Tailored Lipid Peroxidation	N
BMDM(小鼠骨髓来源的巨噬细胞)	SiO₂ & TiO₂ nanoparticles	–	20 μM	流式细胞仪	Particle and Fibre Toxicology	2017	7.546	SiO₂ and TiO₂ nanoparticles synergistically trigger macrophage inflammatory responses	Y
3T3-L1 adipocytes(小鼠脂肪细胞)	GluOC(未羧基化的骨钙素)	–	–	荧光显微镜	Cell Death and Disease	2018	6.304	Osteocalcin triggers Fas/FasL-mediated necroptosis in adipocytes via activation of p300	Y
Hacat(人永生化角质形成细胞)	长波紫外线(UVA)照射	–	5 μM in PBS; 37℃ 30 min	荧光显微镜	Free Radical Biology and Medicine	2017	6.170	Blue light-induced oxidative stress in live skin	N
SH-SY5Y(人神经母细胞瘤细胞)	24S-OHC(人24s羟基胆固醇)	–	–	流式细胞仪	Free Radical Biology and Medicine	2015	6.170	New aspects of 24(S)-hydroxycholesterol in modulating neuronal cell death	N
OEC-M1(人口腔上皮细胞)	Erastin; RSL3; 零价铁(ZVI)纳米颗粒	Lipoxstatin, Ferrostatin-1,10-phenanthroline; DFO	10 μM; 30 min	荧光显微镜	Biomaterials Science	2018	6.183	Assessment of zero-valent iron-based nanotherapeutics for ferroptosis induction and resensitization strategy in cancer cells	N
Murine T cells(鼠T细胞)	NKAP-deficient(NF-κB激活蛋白缺乏)	Ferrostatin-1	10 μM in HBSS; 37℃ 30 min	流式细胞仪	The Journal of Immunology	2019	4.886	Murine T Cell Maturation Entails Protection from MBL2, but Complement Proteins Do Not Drive Clearance of Cells That Fail Maturation in the Absence of NKAP	Y
THP-1(人髓系白血病单核细胞);(1×10⁵ cells/mL)	AAPH(2,2′-偶氮二异丁基脒二盐酸盐)	H₂ gas(氢气)	5 μM; 30 min	流式细胞仪	Scientific Reports	2016	3.998	Molecular hydrogen regulates gene expression by modifying the free radical chain reactiondependent generation of oxidized phospholipid mediators	Y
PMVECs(肺微血管内皮细胞)	LPS(脂多糖)	Prdx6-D140A-knock-in mice	10 μM; 30 min	荧光显微镜	Lung Cellular and Molecular Physiology	2019	4.406	Genetic inactivation of the phospholipase A2 activity of peroxiredoxin 6 in mice protects against LPS-induced acute lung injury	Y
HepG2(人肝癌细胞)	AAPH(2,2′-偶氮二异丁基脒二盐酸盐)	–	10 μM; 30 min	荧光显微镜	Journal of Agricultural and Food Chemistry	2019	4.192	Novel Fluorescence-Based Method To Characterize the Antioxidative Effects of Food Metabolites on Lipid Droplets in Cultured Hepatocytes	N
4T1细胞(小鼠乳癌细胞); HT1080(人纤维肉瘤细胞)	WO₃/Pt nanoparticles	–	20 μM; 37℃ 30 min	荧光显微镜	Nanotechnology	2016	3.551	WO₃/Pt nanoparticles promote light-induced lipid peroxidation and lysosomal instability within tumor cells	N
SH-SY5Y(人神经母细胞瘤细胞)	AAPH(2,2′-偶氮二异丁基脒二盐酸盐)	–	20 μM; 37℃ 15 min	荧光显微镜/流式细胞仪	RSC Advances	2012	3.119	A novel fluorescent probe with high sensitivity and selective detection of lipid hydroperoxides in cells	N
Burkitt’s Lymphoma(Burkitt淋巴瘤细胞)	Artesunate(青蒿琥酯); Erastin	DFO; Liproxstatin-1; Ferrostatin-1	5 μM in PBS; 37℃ 30 min	流式细胞仪	Biochemical and Biophysical Research Communications	2019	2.985	Artesunate activates the ATF4-CHOP-CHAC1 pathway and affects ferroptosis in Burkitt’s Lymphoma	N
Horse breed stallions(种马精子)	UV light; Fe	–	1 μM; 37℃ 30 min	流式细胞仪	Animal Reproduction Science	2019	1.660	Effects of media and promoters on different lipid peroxidation assays in stallion sperm	N
Human hair(人头发)	UV radiation	–	–	荧光显微镜	Cosmetics	2018	–	Mechanism of Cuticle Hole Development in Human Hair Due to UV-Radiation Exposure	Y
HeLa(人宫颈癌细胞)	BFA, Erastin	Ferrostatin-1; Liproxstatin-1	5 µM	荧光显微镜	Communications Biology	2018	4.165	Golgi stress mediates redox imbalance and ferroptosis in human cells	Y
THP-1(人髓系白血病单核细胞)	TBHB(叔丁基过氧化氢)	H₂ gas(氢气)	5 µM; 30 min	流式细胞仪	Canadian Journal of Physiology and Pharmacology	2019	1.946	Molecular hydrogen suppresses free radical-induced cell death by mitigating fatty acid peroxidation and mitochondrial dysfunction	N
HEI-OC1(耳蜗毛细胞)	RSL3	DFO; Liproxstatin-1; Ferrostatin-1	5 μM; 37℃ 30 min	荧光显微镜	Journal of Cellular and Molecular Medicine	2020	4.486	Inhibition of ferroptosis protects House Ear Institute-Organ of Corti 1 cells and cochlear hair cells from cisplatin-induced ototoxicity	Y
SH-SY5Y(人神经母细胞瘤细胞)	6-OHDA	Ferrostatin-1	5 μM; 37℃ 30 min	荧光显微镜	Molecular Neurobiology	2020	4.500	Activation of p62-Keap1-Nrf2 Pathway Protects 6-Hydroxydopamine-Induced Ferroptosis in Dopaminergic Cells	Y
HEI-OC1(耳蜗毛细胞);鼠新生耳蜗毛细胞	RSL3	Liproxstatin-1	5 μM; 37℃ 30 min	荧光显微镜	Oxidative Medicine and Cellular Longevity	2020	5.076	Liproxstatin-1 Protects Hair Cell-Like HEI-OC1 Cells and Cochlear Hair Cells against Neomycin Ototoxicity	Y
BV2 Microglial(小鼠小胶质细胞)	GQDs(石墨烯量子点)	DFO; Liproxstatin-1; Ferrostatin-1	10 μM; 37℃ 30 min	荧光显微镜	Particle and Fibre Toxicology	2020	7.546	Induction of ferroptosis in response to graphene quantum dots through mitochondrial oxidative stress in microglia	Y
HL-60(人骨髓细胞白血病细胞)	RSL3	–	10 µM; 1 h	荧光显微镜	Cell Death and Differentiation	2020	10.717	Oxygenated phosphatidylethanolamine navigates phagocytosis of ferroptotic cells by interacting with TLR2	Y
Brain slices from LN229^TAZ(4SA)(人脑胶质瘤切片)	CD45-	–	10 μM; 37℃ 4 h	荧光显微镜	Nature Communications	2020	12.121	Neutrophil-induced ferroptosis promotes tumor necrosis in glioblastoma progression	Y
BeWo(人胎盘绒膜癌细胞)	PLA2G6敲除; GPX4敲除	–	10 μM; 37℃ 30 min	荧光显微镜	Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America	2020	9.412	PLA2G6 guards placental trophoblasts against ferroptotic injury	N
B16-F10(小鼠皮肤黑色素瘤细胞)	Erastin	–	10 μM; 37℃ 30 min	流式细胞仪	iScience	2020	4.447	Chemically Programmed Vaccines: Iron Catalysis in Nanoparticles Enhances Combination Immunotherapy and Immunotherapy-Promoted Tumor Ferroptosis	Y

M466/MitoPeDPP试剂

M466/MitoPeDPP试剂,MitoPeDPP是一种新型荧光染料，由于其具有三苯基膦结构，因此可以穿过细胞膜并在线粒体中聚集。聚集在线粒体内膜上的MitoPeDPP可以被脂质过氧化物氧化而释放出强荧光。由于氧化的MitoPeDPP(Ox-MitoPeDPP) 的激发和发射波长分别是452 nm和470 nm，可以减小样品的光损伤和自发荧光，因此利用荧光显微镜MitoPeDPP可以检测活细胞中的脂质过氧化物。

货号：M466
3-[4-(Perylenylphenylphosphino)phenoxy]propyltriphenylphosphonium iodide
MitoPeDPP
储存条件：0-5度保存，避光
运输条件：室温

特点：

定位线粒体
更深层次脂质过氧化探究

选择规格：5μg*3

关联产品TOP5

NO.1. FerroOrange 细胞亚铁离子检测
NO.2. Mito-FerroGreen 线粒体内亚铁离子检测
NO.3. Liperfluo 细胞脂质过氧化物检测
NO.4. GSSG/GSH Quantification Kit II 氧化型/还原型谷胱甘肽
NO.5. ROS Assay Kit 活性氧检测

产品概述

MitoPeDPP是一种新型荧光染料，由于其具有三苯基膦结构，因此可以穿过细胞膜并在线粒体中聚集。

聚集在线粒体内膜上的MitoPeDPP可以被脂质过氧化物氧化而释放出强荧光。由于氧化的MitoPeDPP

(Ox-MitoPeDPP) 的激发和发射波长分别是452 nm和470 nm，可以减小样品的光损伤和自发荧光，因此利用

荧光显微镜MitoPeDPP可以检测活细胞中的脂质过氧化物。

特点

1.特异性的在细胞中线粒体内聚集

2.可以检测线粒体膜内的脂质过氧化物

3.可以在488 nm和535 nm的荧光波长下进行检测

* 本产品由福冈大学化学系的Dr. Shioji开发

*由于MitoPeDPP量极少不宜看到，可以通过观察MitoPeDPP DMSO溶液的颜色是否为黄色来判断。

检测原理

MitoPeDPP可以穿过细胞膜并在线粒体中聚集。聚集在线粒体内膜上的MitoPeDPP可以被脂质过氧化物氧化而释放出强荧光。

实验例

1.MitoPeDPP和线粒体染色试剂MitoBright共同染色的实施例

在HeLa细胞中添加t-BHP（氢过氧化叔丁基），检测脂质过氧化物

波长（wavelength/band pass）

MitoPeDPP：470/40（Ex），525/50（Em）

MitoBright DeepRed：600/50（Ex），685/50（Em）

结果证实在HeLa细胞内的线粒体中，MitoPeDPP受t-BHP氧化后会发出荧光。另外通过与线粒体染色试剂（MitoBright Deep Red:MT08）的共染色，确认了MitoPeDPP的荧光是定位在线粒体中。

2.检测添加Rotenone产生的脂质过氧化物

向HeLa细胞[μ-slide，8孔（由Ibidi制造）]中添加MitoPeDPP之后，添加Rotenone溶液并使用荧光显微镜观察。实验结果证实，添加Rotenone后，检测到细胞中产生了脂质过氧化物。

Rotenone的刺激时间：0 min(左)，90 min(中)，180 min(右)

上部）荧光图，下部）明场图

3.神经细胞使用MitoPeDPP的实验例

A.荧光显微镜检测

向NIE-115细胞（小鼠神经芽细胞瘤）添加异黄素，诱导Ca2+流入细胞内，并通过MitoPeDPP的荧光染色来观察线粒体膜内的脂溶性过氧化物的产生。实验结果证实添加了异霉素的实验组相比对照组来说荧光更强。

B. 平均荧光强度数据比较

为了量化对照组细胞和添加了离子霉素的细胞的荧光强度，对两组数据进行基于平均荧光强度的比较。

结果证实，加入离子霉素后30分钟的细胞对比对照组的细胞，观察到的荧光强度显着增加。

数据提供（Free Radical Research, in press)

参照芝浦工业大学系统理工学院福井浩二副教授、中村沙希[参考文献3]

4.MitoPeDPP反应的选择性

在不含细胞的反应体系中，MitoPeDPP可以与各种过氧化物如H2O2，t-BHP和ONOO- 反应，但是在细胞中，积

累在线粒体中的MitoPeDPP可以被t-BHP氧化而释放出较强荧光 (图3A)，却和其它ROS或RNS反应很弱 (图3B)。

A) 在HepG2细胞中加入MitoPeDPP培养15 min，然后用100 μmol / l的t-BHP处理。

B) 在HepG2细胞中加入MitoPeDPP培养15 min后，加入ROS、RNS诱导剂。

分别加入100 μmol / l (H2O2，NO和ONOO-诱导剂)和10 μmol / l PMA（O2-.诱导剂）。

左边为明场图，右边为荧光图

* t-BHP：tert-Butylhydroperoxide; PMA, Phorbol myristate acetate;

SIN-1, 3-(Morpholinyl)sydnonimine, hydrochloride;

NOC 7, 1-Hydroxy-2-oxo-3-(N-methyl-3-aminopropyl)-3-methyl-1-triazene

波长/带通滤波器：470/40 (Ex), 525 /50 (Em)

参考文献

1) K. Shioji K, Y. Oyama, K. Okuma and H. Nakagawa, “Synthesis and properties of fluorescence probe for detection of peroxides in mitochondria.”, Bioorg Med Chem Lett., 2010, 20, (13), 3911.

2) S. Oka, J. Leon, K. Sakumi, T. Ide, D. Kang, F. M. LaFerla and Y. Nakabeppu, “Human mitochondrial transcriptional factor A breaks the mitochondria-mediated vicious cycle in Alzheimer’s disease”, Scientific Reports ., 2016, DOI: 10.1038/srep37889 , .

3) S. Nakamura, A. Nakanishi, M. Takazawa, S. Okihiro, S. Urano and K. Fukui, “Ionomycin-induced calcium influx induces neurite degeneration in mouse neuroblastoma cells: Analysis of a time-lapse live cell imaging system”, Free Radical Research., 2016, 50, (11), 1214.

4) M. Akimoto, R. Maruyama, Y. Kawabata, Y. Tajima and K. Takenaga, “Antidiabetic adiponectin receptor agonist AdipoRon suppresses tumour growth of pancreatic cancer by inducing RIPK1/ERKdependent necroptosis”, Cell Death Dis., 2018, 9, 804.

5) M. Álvarez-Córdoba, A. Fernández Khoury, M. Villanueva-Paz, C. Gómez-Navarro, I. Villalón-García, J. M. Suárez-Rivero, S. Povea-Cabello, M. Mata, D. Cotán, M. Talaverón-Rey, A. J. Pérez-Pulido, J. J. Salas, E. M. Pérez-Villegas, A. Díaz-Quintana, J. A. Armengol, J. A. Sánchez-Alcázar , “Pantothenate Rescues Iron Accumulation in Pantothenate Kinase-Associated Neurodegeneration Depending on the Type of Mutation.”, Mol. Neurobiol. ., 2019, 56, (5), 3638.

M489/Mito-FerroGreen-铁离子荧光探针

M489/Mito-FerroGreen-铁离子荧光探针,Mito-FerroGreen是一种新型荧光探针，用于检测线粒体 (铁硫簇和血红素蛋白的合成场所) 内亚铁离子Fe2+。该产品已在岐阜药科大学药物化学实验室的永澤秀子和平山祐博士的指导下开发。

货号：M489
铁死亡荧光试剂 (Fe2+荧光法)
Mito-FerroGreen
储存条件：-20度保存，避光
运输条件：室温

特点：

定位线粒体
更深层次铁离子探究

选择规格：50μg*2

关联产品TOP5

NO.1. FerroOrange 细胞亚铁离子检测
NO.2. Liperfluo 细胞脂质过氧化物检测
NO.3. MitoPeDPP 线粒体内脂质过氧化物检测
NO.4. Cell Counting Kit-8 细胞增殖毒性检测
NO.5. GSSG/GSH Quantification Kit II 氧化型/还原型谷胱甘肽

产品概述

研究证实铁是生物体内量最多的过渡金属元素。其参与多种生理活动。近几年，细胞内的游离铁离子由于具有很高的反应性，和细胞损伤、死亡有一定的关联而得到了越来越多的关注。在细胞内游离铁离子以稳定的Fe2+和 Fe3+形式存在。从细胞内的还原环境，金属转运体及Fe2+的水溶性考虑，认为揭示细胞内Fe2+的行为比Fe3+更重要。Mito-FerroGreen是一种新型荧光探针，用于检测线粒体 (铁硫簇和血红素蛋白的合成场所) 内亚铁离子Fe2+。

该产品已在岐阜药科大学药物化学实验室的永澤秀子和平山祐博士的指导下开发。

测定原理

产品特点

铁离子检测试剂的选择

可以根据自己的实验方法和实验仪器选择检测试剂

	FerroOrange	Mito-FerroGreen
细胞内分布	细胞内	线粒体
荧光特性	λex : 543 nm、λem : 580 nm	λex : 505 nm、λem : 535 nm
检测仪器	荧光显微镜	荧光显微镜（FITC、GFP）
（滤镜）	荧光显微镜	荧光显微镜（FITC、GFP）
检测对象	活细胞	活细胞
染色次数	24 μg可染色35 mm dish 17块板	50 μg可染色35 mm dish 5块板
染色次数	（终浓度 1 μmol/l時）	（终浓度 5 μmol/l時）

实验例

1.线粒体定位

为了确认Mito-FerroGreen的是否特异性地在线粒体内定位，与线粒体染色试剂（MitoBright Deep Red※）一同进行染色，实验结果证实了Mito-FerroGreen选择性地染色在线粒体内。

向HeLa细胞中添加5μmol/ l的Mito-FerroGreen和200 nmol/l的线粒体染色探针MitoBright Deep Red，并在CO2培养箱中培养30分钟，然后添加100μmol/ l的硫酸铁铵（II），并将混合后的细胞溶液在CO2培养箱中培养1小时后通过观察荧光。

Mito-FerroGreen

激发波长：488 nm

发射波长：500-565 nm

MitoBright Deep Red

激发波长：640 nm

发射波长：656-700 nm

2.线粒体内的铁离子荧光成像

在含有血清的MEM培养基中接种HeLa细胞，并加入Mito-FerroGreen，通过荧光检测HeLa细胞众线粒体内的二价铁（左图）。而在添加了铁离子的HeLa细胞中，观察到了Mito-FerroGreen的荧光明显增强（中间图）。在添加了铁螯合剂的细胞中，几乎未观察到Mito-FerroGreen的荧光（右图）。以这种方式，证实了线粒体中铁含量的差异和荧光强度的差异是成相关性的。

3.对二价铁离子的高度选择性和高信号

向1ml 50mmol/l HEPES Buffer（pH7.4）中加入2μl 1mol/l Mito-FroGreen、2μl 10mmol/l各种金属以及20μl 1mg/ml酯化酶，在室温下反应1小时后测定荧光强度。

激发波长：500 nm

发射波长：535 nm

4.适用于通用滤光片

Mito-FerroGreen的激发波长为488nm，最大激发波长可达505nm。

向3ml 50 mmol/l HEPES Buffer (pH7.4) 中加入 6μl 1mol/l Mito-FroGreen、6μl 10mmol/l硫酸铵铁（Ⅱ）以及20μl 1mg/ml酯化酶。在37℃下反应1小时后检测荧光强度。

激发波长：500 nm

发射波长：535 nm

常见问题Q&A

Q1：是否可以对酵母进行染色吗？

A1：我们公司有酵母染色的实验例，染色的具体实验步骤请联系我们公司的销售人员。

Q2：推荐使用的滤光片波长是多少？

A2：检测时推荐的滤光片如下：

激发波长：450~500 nm

发射波长：515~550 nm

规格性状

性状：本品溶于乙腈、甲醇、二甲醇。

纯度（HPLC）：90.0%以上

荧光光谱：适合测试

参考文献

1) T. Hirayama, S. Kadota, M. Niwa and H. Nagasawa, “A mitochondria-targeted fluorescent probe for selective detection of mitochondrial labile Fe(II)”, Metallomics., 2018, DOI: 10.1039/C8MT00049B

2) T. Issitt, E. Bosseboeuf, N. Winter, N. Dufton, G. Gestri, V. Senatore, A. Chikh, A. Randi, C. Raimondi, “Neuropilin-1 controls endothelial homeostasis by regulating mitochondrial function and iron-dependent oxidative stress via ABCB8”, iScience., 2018,DOI: 10.1016/j.isci.2018.12.005 .

3) E. E. Mon, F. Y. Wei, R. N. R. Ahmad, T. Yamamoto, T. Moroishi and K. Tomizawa, “Regulation of mitochondrial iron homeostasis by siderofexin 2 “, J Physiol Sci., 2018,doi:10.1007/s12576-018-0652-2.

4) M. Fujimaki, N. Furuya, S. Saiki, T. Amo, Y. Imamichi and N. Hattori, “Iron supply via NCOA4-mediated ferritin degradation maintains mitochondrial functions”, Mol. Cell. Biol.., 2019,doi: 10.1128/MCB.00010-19.

5) K. Tomita, M. Fukumoto, K. Itoh, Y. Kuwahara, K. Igarashi, T. Nagasawa, M. Suzuki, A. Kurimasa and T. Sato, “MiR-7-5p is a key factor that controls radioresistance via intracellular Fe2+ content in clinically relevant radioresistant cells.”, Biochem Biophys Res Commun.., 2019,doi: 10.1016/j.bbrc.2019.08.117.

6) Y. Wang and M. Tang, “PM2.5 induces ferroptosis in human endothelial cells through iron overload and redox imbalance”, Environ. Pollut., 2019, 264, doi: 10.1016/j.envpol.2019.07.105.

7) KF. Yambire, C. Rostosky, T. Watanabe, D. Pacheu-Grau, S. Torres-Odio,A. Sanchez-Guerrero,O. Senderovich, EG. Meyron-Holtz,I.Milosevic, J. Frahm, AP. West and N. Raimundo, “Impaired lysosomal acidification triggers iron deficiency and inflammation in vivo.”, Elife, 2019, 3, (8), doi:10.7554/eLife.51031.

8) H. Nishizawa, M. Matsumoto, T. Shindo, D. Saigusa, H. Kato, K. Suzuki, M. Sato, Y. Ishii, H. Shimokawa and K. Igarashi, “Ferroptosis is controlled by the coordinated transcriptional regulation of glutathione and labile iron metabolism by the transcription factor BACH1″, J. Biol. Chem., 2019,doi: 10.1074/jbc.RA119.009548.

9)Y. akashima, A. Hayano and B. Yamanaka, Metabolome analysis reveals excessive glycolysis via PI3K/AKT/mTOR and RAS/MAPK signaling in methotrexate-resistant primary CNS lymphoma-derived cells.”, Clin. Cancer Res., 2020, DOI:10.1158/1078-0432.

MT14/mtSOX Deep Red – Mitochondrial Superoxide Detection

MT14/mtSOX Deep Red – Mitochondrial Superoxide Detection,线粒体在生成ATP的同时会生成超氧化物。正常情况下，细胞的抗氧化酶等物质会保护细胞免受活性氧的伤害。但是，当线粒体功能异常时，活性氧过量积累会造成细胞的各种机能紊乱。因此在评价细胞氧化应激水平时，往往需要同时检测线粒体的膜电位和线粒体的活性氧。

货号：MT14
线粒体超氧化物检测用荧光染料
mtSOX Deep Red – Mitochondrial Superoxide Detection
储存条件：0-5℃，避光
运输条件：室温

特点：

对超氧化物的选择性高
独特的荧光特性(λex: 540 nm; λem: 670 nm)

选择规格：1set,3set

产品概述

线粒体在生成ATP的同时会生成超氧化物。正常情况下，细胞的抗氧化酶等物质会保护细胞免受活性氧的伤害。但是，当线粒体功能异常时，活性氧过量积累会造成细胞的各种机能紊乱。因此在评价细胞氧化应激水平时，往往需要同时检测线粒体的膜电位和线粒体的活性氧。

与其他试剂的比较

对各种活性氧的反应选择性

mtSOXDeep Red相较于T公司的产品Red，在各种活性氧中，对超氧化物的选择性更高。

另外，与其他公司产品所不同的是，mtSOX Deep Red拥有独特的荧光特性(λex: 540 nm; λem: 670 nm)，可以同时进行线粒体膜电位检测试剂(JC-1 货号MT09; MT-1 货号MT13)的共染色实验。

实验例

线粒体超氧化物和线粒体膜电位的同时检测

用HBSS清洗HeLa细胞后，使用mtSOX和同仁化学研究所的线粒体膜电位检测试剂(JC-1 货号MT09或MT-1 货号MT13)进行共染色实验，同时观察线粒体ROS和线粒体膜电位。

结果显示，伴随着线粒体ROS的产生，线粒体膜电位也逐渐降低。

<使用JC-1的实验操作>

<检测条件>

JC-1:绿Ex=488 nm; Em= 490-520 nm; 红Ex=561 nm; Em= 560-600 nm

mtSOX:Ex=633 nm; Em= 640-700 nm

Scale bar: 10 μm

<检测条件>

JC-1:绿Ex=485 nm; Em= 535 nm; 红Ex=535 nm; Em= 595 nm

mtSOX:Ex=550 nm; Em= 675 nm

<使用MT-1的实验操作>

<检测条件>

MT-1: Ex=561 nm; Em= 560-600 nm

mtSOX:Ex=633 nm; Em= 640-700 nm

Scale bar: 10 μm

<检测条件>

MT-1: Ex=545 nm; Em= 600 nm;

mtSOX:Ex=550 nm; Em= 675 nm

细胞内Total ROS和线粒体超氧化物的同时检测

用HBSS清洗HeLa细胞后，使用mtSOX和同仁化学研究所的细胞内ROS检测试剂(ROS Assay Kit -Highly Sensitive DCFH-DA- 货号：R252)进行共染色实验，通过线粒体超氧化物诱导剂Antimycin或过氧化氢诱导后进行荧光观察。

结果显示，可以分别观察到细胞内ROS诱导后的荧光增强和线粒体的ROS诱导后的荧光增强。

<实验操作>

<Antimycin刺激的结果>

<检测条件>

细胞内ROS: Ex=488 nm; Em= 490-520 nm

mtSOX:Ex=633 nm; Em= 640-700 nm

Scale bar: 10 μm

常见问题Q&A

Q1：mtSOX Deep Red的检测原理是什么？
A1：mtSOX Deep Red被Superoxide特异性氧化后会发出荧光，同时它还可在线粒体处积累，因此可以检测线粒体Superoxide。伴随着Superoxide的增加，线粒体的膜电位消失的话，核小体和细胞质会被染料染色。
Q2：每个试剂盒可以检测多少个样品？
A2：可检测的样品数如下。
・ 96-well plate: 1块。
・ ibidi 8-well plate: 6块。
・ 35 mm dish: 5块。
Q3：是否可以用培养基以外的溶液配制Working solution？
A3：可以，可使用HBSS或PBS代替培养基。
Q4：各检测仪器适用的滤光片？
A4：荧光显微镜、流式细胞仪、荧光酶标仪均可检测。
・激光共聚焦显微镜
Ex/Em: 561/640-700 nm (无红色荧光染料共染时)
Ex/Em: 633/640-700 nm (与红色荧光染料共染时)
・荧光显微镜
TxRed Filter
・荧光酶标仪
Ex/Em: 535–565/660–690 nm
Q5：是否可以刺激后再染色？
A5：在线粒体膜电位正常的前提下是有可能的。
本染料依赖线粒体膜电位在线粒体处积累，因此如果药物刺激造成线粒体膜电位降低的话，染料将无法在线粒体处积累，影响检测结果。因此推荐先染色再进行药物刺激。

MT13/线粒体膜电位检测试剂盒

MT13/线粒体膜电位检测试剂盒,线粒体利用氧气合成ATP，从而产生细胞所需的能量，是重要的细胞器之一。线粒体活性低下和机能障碍与癌症、老化、阿尔茨海默病、帕金森病等神经变性疾病密切相关。因此，线粒体膜电位（MMP）作为线粒体相关疾病的一个有希望的靶点已被广泛研究。

货号：MT13
线粒体膜电位检测试剂盒
MT-1 MitoMP Detection Kit
运输条件：室温

特点：

固定后仍可检测
荧光滞留性强
灵敏度高

选择规格：1set

产品概述

线粒体利用氧气合成ATP，从而产生细胞所需的能量，是重要的细胞器之一。线粒体活性低下和机能障碍与癌症、老化、阿尔茨海默病、帕金森病等神经变性疾病密切相关。因此，线粒体膜电位（MMP）作为线粒体相关疾病的一个有希望的靶点已被广泛研究。

产品特点

解决传统试剂的三个问题

观察线粒体膜电位时，使用JC-1、TMRE、TMRM，但由于PFA不可固定、容易淬灭，数据的再现性等问题。MT-1 MitoMP Detection Kit是克服了这些问题的线粒体膜电位的检测试剂。

并且，通过本试剂盒中包含的Imaging Buffer，可以在抑制了荧光背景和对细胞的损伤的状态下进行观察。

①固定后也可检测

由于微小的细胞状态的变化，也会造成线粒体膜电位发生变化，所以取得数据的重现性需要特别注意。通用的线粒体膜电位检测试剂（JC-1、TMRE）如果对细胞进行固定处理的话会失去荧光，所以需要使用活细胞进行迅速的测定。MT-1即使进行染色后进行PFA固定操作，也能保持荧光，因此可以进行高重复性的实验。

②可监控

没有进行药物刺激的细胞通过各种试剂染色，确认了荧光强度的变化。结果，JC-1和TMRE在染色后约10分钟左右荧光强度下降，MT-1仍保持了一定的荧光强度

③高灵敏度

线粒体膜电位的细微变化在JC-1中有难以检测的情况，在这种情况下，使用四甲基罗丹明乙酯（TMRE）监测MMP。MT-1可提供与TMRE同等的检测灵敏度。

与各种试剂的比较

实验例

1.通过去极化的实验例

通过线粒体去极化剂的cyanide-p-trifluoromethoxyphenylhydrazone (FCCP)处理HeLa细胞，用该试剂观察膜电位的变化。

结果，确认了FCCP处理的细胞线粒体膜电位下降的情况。

2.凋亡诱导细胞线粒体膜电位的变化

预先在MT-1中染色的HL60细胞中添加Etoposide，诱导凋亡后，与Annexin V、FITC Conjugate一同染色，并通过流式细胞仪检测。

结果发现Annexin V-FITC产生的荧光强度变化（绿色荧光强度的增加）确认了凋亡的发生，以及从MT-1产生的荧光强度变化（红色荧光强度的降低）发现了线粒体膜电位的变化。

常见问题Q&A

Q1:使用荧光显微镜检测时需要注意什么？

A1:请尽量减少激发光照射时间并提高检测灵敏度。

细胞长期暴露于激发光内可能导致细胞损伤和荧光染料降解，请优化检测时间。

Q2：MT-1检测后可以固定吗？

A2：应使用4%多聚甲醛（PFA）固定，且不能与（Triton X-100、NP-40等）一起使用，因为这可能导致染泄漏。

Q3：固定后可以对细胞染色吗？

A3：由于MT-1在线粒体中的积累取决于线粒体膜电位，因此固定后不适用于染色。

Q4：是否需要做阳性对照？

A4：作为阳性对照，可在技术手册中找到使用FCCP（羰基氰化物-对三氟甲氧基苯腙）的实验例。

Q5：优化染色条件时，应使用何种浓度的MT-1染料

A5：MT-1染料的浓度建议稀释1000倍。但在优化染色条件时，请参考以下内容。

<荧光强度弱>

请优化以下浓度：稀释500-1000倍。

<观察到非特异性吸附>

请优化以下浓度：稀释1000至2000倍。

Q6:我可以使用缓冲液来制备MT-1工作溶液吗？

A6:可以使用Hanks的HEPES和HBSS。也可以使用MEM、RPMI和含10%FBS的MEM制备。

Q7：添加MT-1工作液后，可以不清洗直接上机检测吗？

A7：染色后，无需清洗即可观察样品。但我们不建议在不清洗的情况下长期观察它们，因为它们可能具有细胞毒性。

我们建议去除上清液并用培养基替换。

Q8：MT-1染色后，是否可以用PBS代替HBSS来清洗？

A8：我们建议使用HBSS来减少细胞损伤。如果您没有HBSS，我们建议使用培养基来代替清洗。

参考文献

N. Okada, T. Yako, S. Nakamura, M. Shimazawa, H. Hara, “Reduced mitochondrial complex II activity enhances cell death via intracellular reactive oxygen species in STHdhQ111 striatal neurons Q1 with mutant huntingtin”, 2021, doi:10.1016/j.jphs.2021.09.001.

MT15/MitoBright IM Red for Immunostaining试剂

MT15/MitoBright IM Red for Immunostaining试剂,近年来，随着显微镜技术的发展，有关细胞器的研究正在由原来的“单独研究线粒体的机能””逐渐向“线粒体与其他细胞器之间的相互作用”的方向转移。因此，对于线粒体的更详细的形态观察需求越来越大。MitoBright IM Red克服了其他染料的靶向标记稳定性差的问题，是一种可以用于免疫荧光共染色线粒体荧光探针。

货号：MT15
免疫荧光用线粒体荧光染料
MitoBright IM Red for Immunostaining
储存条件：-20 保存
运输条件：室温

特点：

标记稳定性强、特异性高
可用于免疫荧光共染色

选择规格：20μl,20μl*3

规格性状

	1 Tube	3Tubes
MitoBright lM Red for Immunostaining	20 ul ×1	20 ul × 3

产品概述

线粒体不仅是细胞中产生能量的场所，也是与癌症、衰老、神经退行性疾病（例如，阿尔茨海默症、帕金森症）等密切相关的最重要的细胞器之一。

近年来，随着显微镜技术的发展，有关细胞器的研究正在由原来的“单独研究线粒体的机能””逐渐向“线粒体与其他细胞器之间的相互作用”的方向转移。因此，对于线粒体的更详细的形态观察需求越来越大。

MitoBright IM Red克服了其他染料的靶向标记稳定性差的问题，是一种可以用于免疫荧光共染色线粒体荧光探针。

实验例：与内质网标记物KDEL的共染色

用MitoBrightIM Red标记HeLa细胞的线粒体，经固定化和膜透性处理后再用内质网标记物KDEL的抗体进行免疫共染色。并且在左图的箭头所示范围内进行了荧光强度的检测。从荧光图像可以清晰的观察线粒体与附近的内质网的形态。

<检测条件>

MitoBright IM Red (红) Ex: 561 nm, Em: 560-620 nm

KDEL抗体-Alexa488 (绿) Ex: 488 nm, Em= 490-550 nm

Scale bar: 10 μm

MitoBright IM Red与其他试剂的不同

传统的小分子荧光染料在染色后的固定化操作或透膜剂处理后，往往会失去靶向性。而MitoBright IM Red与其他染料相比，提高了靶向稳定性，可以抑制免疫荧光实验时固定化操作造成的荧光强度减弱等问题。

・荧光强度差的比较

MitoBright IM与(T公司的)传统荧光染料相比，在活细胞线粒体染色后的固定化处理和透膜剂处理后的荧光强度如下图所示。固定化处理和透膜剂处理后，荧光强度都有一定的下降，但是MitoBright IM比传统染料的靶向标记稳定性更高，因此可以观察到更清晰的线粒体染色情况。

<检测条件>

Ex=561 nm; Em= 560-620 nm

・荧光背景的比较

使用线粒体标记物TOM20抗体比较MitoBrightIM和传统试剂的免疫染色后的线粒体定位情况。用MitoBrightIM和传统试剂对HeLa细胞进行染色，然后用TOM20抗体进行二抗免疫荧光染色。结果显示，用MitoBrightIM或现有试剂对HeLa细胞进行染色，然后用TOM20抗体进行二抗染色。结果显示，传统试剂有扩散到线粒体以外区域的情况，导致背景很高，而MitoBrightIM的背景更低，而且定位与TOM20抗体一致。

<检测条件>

Ex=561 nm; Em= 560-620 n

与传统试剂的对比

可检测的次数

MitoBright IM Red 规格	荧光显微镜
MitoBright IM Red 规格	（35 mm dish, working solution 2 ml/dish时)
20 μl	10 枚
20 µl x3	30 枚

荧光特性

激发波长(λex) ： 548 nm
发射波长(λem) ： 566 nm

常见问题Q&A

Q: MitoBright IM Red出厂就是是DMSO溶液状态，反复冻融是否会影响染色结果？

我们做过反复冻融5次的稳定性实验，染色结果正常。如果长时间保存时需要反复冻融，保险起见建议提前分装，分开保存。

Q：先药物刺激再进行MitoBright IM染色时，发现有荧光辉斑产生，请问是否有好的解决办法？
A：请在药物刺激前进行MitoBright IM的染色。
由于本试剂是依靠线粒体膜电位在线粒体处积累的，如果线粒体膜电位大幅降低，会导致试剂无法在线粒体处聚集。

(参考实验)

分别采用“先FCCP刺激后染色” 和“先染色后FCCP刺激” 的方法对HeLa细胞进行实验并观察荧光。

先进行MitoBright IM染色再FCCP刺激的实验组很顺利的观察到了荧光，而相反的实验组没有观察到荧光。

MT09/JC-1 MitoMP Detection Kit-线粒体膜电位检测试剂盒

MT09/JC-1 MitoMP Detection Kit-线粒体膜电位检测试剂盒,细胞中的线粒体作为有氧呼吸产生ATP的主要场所，是体内重要的细胞器之一，常被用于早期细胞毒性、氧化应激、细胞凋亡等研究中1)。线粒体活性的降低与机能失调，已被证实与癌症、衰老、神经退行性疾病 (如阿尔兹海默症、帕金森病等) 等密切相关2)3)。

货号：MT09
线粒体膜电位检测试剂盒
JC-1 MitoMP Detection Kit
储存条件：0-5度保存
运输条件：室温

特点：

灵敏度高
易上手
多种仪器均可检测

选择规格：1set

试剂盒内含

1 set	JC-1 Dye	100 nmolx1
1 set	lmaging Buffer (10x)	11 mlx1

关联产品TOP5

NO.1. Cell Counting Kit-8 细胞增殖毒性检测
NO.2. ROS Assay Kit 活性氧检测
NO.3. FerroOrange 细胞亚铁离子检测
NO.4. GSSG/GSH Quantification Kit II 氧化型/还原型谷胱甘肽
NO.5. Mitophagy Detection Kit 线粒体自噬检测

产品概述

细胞中的线粒体作为有氧呼吸产生ATP的主要场所，是体内重要的细胞器之一，常被用于早期细胞毒性、氧化应激、细胞凋亡等研究中¹⁾。线粒体活性的降低与机能失调，已被证实与癌症、衰老、神经退行性疾病 (如阿尔兹海默症、帕金森病等) 等密切相关²⁾³⁾。

JC-1是一种被广泛使用的小分子线粒体膜电位探针，依赖于线粒体膜电位在线粒体中聚集，染料伴随聚集过程，荧光从绿色 (530 nm) 变为红色 (590 nm)。当线粒体发生去极化，红/绿荧光强度比值降低。以往的研究者反映，JC-1不易溶于水并有大量沉淀产生。但与其他公司的产品不同，同仁化学研究所研制的JC-1试剂解决了这一问题，避免了沉淀的产生。同时使用试剂盒中配制的成像缓冲液 (Imaging Buffer)，可大幅降低荧光背景并在检测过程中保护细胞不受损伤。

当JC-1工作液的浓度为2 μmol/l, 每次用量为100 μl时，可以检测500次。

产品特点

1.为什么要检测线粒体膜电位

线粒体不仅是细胞内产生能量的场所，它还与癌症、衰老、阿尔兹海默症、帕金森等神经变异性疾病密切相关。因此，针对线粒体状态的研究非常重要，其中线粒体膜电位的变化经常被作为重要的指标之一检测。

当线粒体正常、膜电位差保持不变时，JC-1会聚集并发出红色荧光，而当膜电位降低时，JC-1会作为单体存在并发出绿色荧光。红色和绿色荧光强度的变化可以作为检测线粒体状态的指标。

2.初次使用也很容易上手

3.去极化的检测实例

使用去极化剂carbonylcyanide-p-trifluoromethoxyphenylhydrazone（FCCP）对HeLa细胞进行处理，用本试

剂盒进行检测。可以发现与未加药物的细胞相比，加药组细胞的红色荧光明显减少。

实验条件

JC-1浓度： 2 μmol/l in MEM, 染色时间30 min

FCCP浓度：100 μmol/l， FCCP处理时间1 h

检测条件

Green : Ex 488 nm/ Em 500-550 nm;

Red : Ex 561 nm/ Em 560-610 nm;

标尺: 20 μm

操作步骤

实验例

1.诱导凋亡的实验例

1.1 荧光显微镜

通过荧光颜色的改变判断由凋亡导致的线粒体膜电位的变化。

检测条件

Green: Ex 488 nm / Em 500-550 nm

Red : Ex 561 nm / Em 560-610 nm

标尺: 80 μm

1.2 流式细胞仪

定量分析单个细胞的膜电位变化

检测条件

Green: Ex 488 nm / Em 515-545 nm

Red : Ex 488 nm / Em 564-604 nm

1.3 酶标仪

确认孔板中吸光度来判断线粒体膜电位的变化

检测条件

Green: Ex 485 nm / Em 525-545 nm

Red : Ex 535 nm / Em 585-605 nm

2.诱导自噬的实验例

使用表达Parkin的HeLa细胞，分别使用线粒体自噬试剂盒（Mitophagy Detection Kit：MD01）和线粒体膜电位检测试剂盒（JC-1 MitoMP Detection Kit： MT09）来观察添加和不添加CCCP（羰基氰化物间氯苯）的线粒体状态的变化。

结果证明在未经CCCP处理的细胞中几乎未检测到线粒体自噬的发生，并且线粒体膜电位正常维持。而在添加了CCCP的细胞中，证实了线粒体膜电位的降低（JC-1的红色荧光的降低）和线粒体的自噬（Mtphagy染料的荧光的增强）。

<检测条件>

线粒体自噬检测

Ex：561 nm，Em：570-700 nm

线粒体膜电位检测

绿色Ex：488 nm，Em：500-550 nm

红色Ex：561 nm，Em：560-610 nm

实验条件

1.将Parkin质粒导入HeLa细胞

使用HilyMax（货号：H357）将Parkin质粒引入HeLa细胞中（Parkin质粒/HilyMax试剂：0.1 μg/0.2 μl）

然后过夜培养，收集细胞进行以下检测。

2.自噬检测

向表达Parkin的HeLa细胞中添加0.1 μmol/l Mtphagy工作溶液，并在37°C下孵育30分钟。然后将细胞用HBSS洗涤，加入10 μg/ml CCCP/MEM溶液，并在37℃下孵育2小时。荧光显微镜下观察处理后的细胞。

3.线粒体膜电位检测

将10 μg/ml的CCCP/MEM溶液添加至表达Parkin的HeLa细胞中，并在37℃下孵育1.5小时。加入4 μmol/l的JC-1工作溶液使终浓度至2 μmol/l，并将细胞溶液在37℃下孵育30分钟。孵育后将细胞用HBSS洗涤，加入成像缓冲液，在荧光显微镜下观察细胞。

3.线粒体膜电位与细胞周期关联性

将已知能在细胞周期的G2/M期起作用以终止细胞增殖并诱导细胞衰老的阿霉素（DOX）加入A549细胞后，

使用细胞周期检测试剂盒蓝色（产品代码：C549）/深红色（产品代码：C548）后检测。

结果证实了A549细胞的细胞周期确实发生了变化，同时用细胞衰老检测试剂盒–SPiDER-βGal（产品代码：SG03）证实了细胞产生衰老，实验证实了线粒体膜电位会发生变化。

常见问题Q&A

Q1: 本试剂盒可以检测多少次？

A1:大概的使用次数请参考下表：

检测装置	容器	使用次数	液量
流式细胞仪	–	100次	0.5 ml/次
荧光显微镜荧光酶标仪	35 mm dish	25次	2 ml/孔
	8孔Chamber Slide	30次	200 μl/孔
	96孔板	5次	100 μl/孔

Q2：在JC-1染色后，可以使用PBS代替HBSS洗涤吗？

A2：我们建议使用HBSS来减少对细胞的损伤。如果您手边没有HBSS的话，建议使用培养基洗净。

Q3：可以使用含血清的培养基吗？

A3：在清洗细胞和Working Solution中可以使用含血清的培养基。在观察荧光时建议使用Imaging Buffer。如果一定要使用含血清的培养基的话，建议不要加酚红。

Q4：染色后细胞固定或者固定后进行染色可以实现吗？

A4：细胞固定操作会使得线粒体去极化，所以染色前后均不能进行细胞固定。

Q5：处理后的样品与对照组相比较，红和绿两种荧光值都增加（或减少）了，结果该如何解释？

A5：请先比较实验组和对照组的荧光比值，两者相比，荧光比越低，线粒体膜电位越低。

用荧光之比进行结果分析的理由。

JC-1由于膜电位依存性地在细胞中积蓄，根据细胞的状态，每个细胞的JC-1的浓度有可能不同。

由于对照组和实验组处理样品的细胞状态不同，JC-1的累积浓度不同。)

另外，在线粒体膜电位较高的状态下，JC-1会聚集在一起，使荧光从绿色转移到红色。

该聚集体的量取决于膜电位的程度，因此可以用红/绿之比来比较样品之间的线粒体膜电位。

＜参考文献＞

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参考文献

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3)	细胞（3T3L1, C2C12）	流式细胞仪	M. Kurano, K. Tsukamoto, T. Shimizu, H. Kassai, K. Nakao, A. Aiba, M. Hara and Yatomi , “Protection Against Insulin Resistance by Apolipoprotein M/Sphingosine 1-Phosphate “, Diabetes, 2020, DOI: 10.2337/db19-0811.
4)	细胞	流式细胞仪	T. Nechiporuk, S.E. Kurtz, O. Nikolova, T. Liu, C.L. Jones, A. D. Alessandro, R. C. Hill, A. Almeida, S. K. Joshi, M. Rosenberg, C. E. Tognon, A. V. Danilov, B. J. Druker, B. H. Chang, S. K McWeeney and J. W. Tyner , “The TP53 Apoptotic Network Is a Primary Mediator of Resistance to BCL2 Inhibition in AML Cells.”, Cancer Discov, 2019, 9,
5)	细胞	荧光显微镜	G. Yang, M. Fan, J. Zhu, C. Ling, L. Wu, X. Zhang, M. Zhang, J. Li, Q. Yao, Z. Gu and X. Cai, “A multifunctional anti-inflammatory drug that can specifically target activated macrophages massively deplete intracellular H2O2 and produce large amounts CO for a highly efficient treatment of osreoarthritis” , Biomaterials, 2020, doi:10.1016/j.biomaterials.2020.120155.
6)	细胞（ARPE-19)	荧光显微镜	J. H. Quan, F. F. Gao, H. A. Ismail, J. M. Yuk, G. H. Cha, J. Q. Chu and Y. H. Lee, “Silver Nanoparticle-Induced Apoptosis in ARPE-19 Cells Is Inhibited by Toxoplasma gondii Pre-Infection Through Suppression of NOX4-Dependent ROS Generation”, Int J Nanomedicine , 2020, 15, 3695–3716.

M466/MitoPeDPP试剂

货号：M466
3-[4-(Perylenylphenylphosphino)phenoxy]propyltriphenylphosphonium iodide
MitoPeDPP
储存条件：0-5度保存，避光
运输条件：室温

特点：

特异性的在细胞中线粒体内聚集
可以检测线粒体膜内的脂质过氧化物
可以在488 nm和535 nm的荧光波长下进行检测

选择规格：5μg*3

产品概述

MitoPeDPP是一种新型荧光染料，由于其具有三苯基膦结构，因此可以穿过细胞膜并在线粒体中聚集。

聚集在线粒体内膜上的MitoPeDPP可以被脂质过氧化物氧化而释放出强荧光。由于氧化的MitoPeDPP

(Ox-MitoPeDPP) 的激发和发射波长分别是452 nm和470 nm，可以减小样品的光损伤和自发荧光，因此利用

荧光显微镜MitoPeDPP可以检测活细胞中的脂质过氧化物。

特点

1.特异性的在细胞中线粒体内聚集

2.可以检测线粒体膜内的脂质过氧化物

3.可以在488 nm和535 nm的荧光波长下进行检测

* 本产品由福冈大学化学系的Dr. Shioji开发

*由于MitoPeDPP量极少不宜看到，可以通过观察MitoPeDPP DMSO溶液的颜色是否为黄色来判断。

检测原理

MitoPeDPP可以穿过细胞膜并在线粒体中聚集。聚集在线粒体内膜上的MitoPeDPP可以被脂质过氧化物氧化而释放出强荧光。

实验例

1.MitoPeDPP和线粒体染色试剂MitoBright共同染色的实施例

在HeLa细胞中添加t-BHP（氢过氧化叔丁基），检测脂质过氧化物

波长（wavelength/band pass）

MitoPeDPP：470/40（Ex），525/50（Em）

MitoBright DeepRed：600/50（Ex），685/50（Em）

2.检测添加Rotenone产生的脂质过氧化物

Rotenone的刺激时间：0 min(左)，90 min(中)，180 min(右)

上部）荧光图，下部）明场图

3.神经细胞使用MitoPeDPP的实验例

A.荧光显微镜检测

B. 平均荧光强度数据比较

为了量化对照组细胞和添加了离子霉素的细胞的荧光强度，对两组数据进行基于平均荧光强度的比较。

结果证实，加入离子霉素后30分钟的细胞对比对照组的细胞，观察到的荧光强度显着增加。

数据提供（Free Radical Research, in press)

参照芝浦工业大学系统理工学院福井浩二副教授、中村沙希[参考文献3]

4.MitoPeDPP反应的选择性

在不含细胞的反应体系中，MitoPeDPP可以与各种过氧化物如H2O2，t-BHP和ONOO- 反应，但是在细胞中，积

累在线粒体中的MitoPeDPP可以被t-BHP氧化而释放出较强荧光 (图3A)，却和其它ROS或RNS反应很弱 (图3B)。

A) 在HepG2细胞中加入MitoPeDPP培养15 min，然后用100 μmol / l的t-BHP处理。

B) 在HepG2细胞中加入MitoPeDPP培养15 min后，加入ROS、RNS诱导剂。

分别加入100 μmol / l (H2O2，NO和ONOO-诱导剂)和10 μmol / l PMA（O2-.诱导剂）。

左边为明场图，右边为荧光图

* t-BHP：tert-Butylhydroperoxide; PMA, Phorbol myristate acetate;

SIN-1, 3-(Morpholinyl)sydnonimine, hydrochloride;

NOC 7, 1-Hydroxy-2-oxo-3-(N-methyl-3-aminopropyl)-3-methyl-1-triazene

波长/带通滤波器：470/40 (Ex), 525 /50 (Em)

参考文献

1) K. Shioji K, Y. Oyama, K. Okuma and H. Nakagawa, “Synthesis and properties of fluorescence probe for detection of peroxides in mitochondria.”, Bioorg Med Chem Lett., 2010, 20, (13), 3911.

MD01/Mitophagy Detection Kit-线粒体自噬

货号：MD01
线粒体自噬检测试剂盒
Mitophagy Detection Kit

特点：

只需添加小分子量荧光试剂即可轻松检测线粒体
可以使用荧光显微镜进行活细胞成像
可以与附着的溶酶体染色剂同时染色

选择规格：1set

试剂盒内含

1 set

. Mtphagy Dye
. Lyso Dye

×1管
×1管

产品概述

特点：

1）只需添加小分子量荧光试剂即可轻松检测线粒体

2）可以使用荧光显微镜进行活细胞成像

3）可以与附着的溶酶体染色剂同时染色

原理

记载了本产品的检测原理和实验例的论文请看MD01论文实验例中第四篇：Live Cell Imaging of Mitochondrial Autophagy with a Novel Fluorescent Small Molecule

实验例

波长：

Mtphagy Dye:561 nm (Ex)、650 LP nm (Em)

Lyso Dye:488 nm (Ex)、502-554 nm (Em)

MitoBright Deep Red:640 nm (Ex)、656-700 nm (Em)

2.荧光显微镜观察

HeLa细胞用CCCP处理，并与线粒体检测试剂（Mtphagy Dye）和线粒体染色试剂（MitoBright LT Green）共同染色，并经过一段时间（6小时）后进行检测。

<检测条件>

设备：LSM-700 Laser scanning confocal microscope (LSCM)

(Carl Zeiss, Oberkochen, Germany)

激发波长：

MitoBright LT Green 488 nm

Mtphagy Dye 555 nm

物镜：63x

拍摄时间：6小时

拍摄间隔：15秒

3.自噬诱导和线粒体膜电位变化关系的检测

<实验条件>

■将Parkin质粒导入HeLa细胞

使用HilyMax（货号：H357）将Parkin质粒引入HeLa细胞中（Parkin质粒/HilyMax试剂：0.1 μg/0.2 μl）

过夜培养后进行检测。

■线粒体自噬检测

■线粒体膜电位检测

<检测条件>

■线粒体自噬检测

Ex：561 nm，Em：570-700 nm

■线粒体膜电位检测

绿色Ex：488 nm，Em：500-550 nm

红色Ex：561 nm，Em：560-610 nm

荧光特性

常见问题Q&A

Q1: 本试剂盒和现存传统方法相比有何优势？

A1: 与PH敏感并基于Keima荧光蛋白检测方法相比，本试剂为小分子荧光试剂，因此无需表达荧光蛋白。

另外，可以通过与用于普通活细胞成像的荧光试剂用相同的操作方法对其进行染色和共同观察。

Q2: 使用DMSO配置后的储存液稳定性如何？
A2：Mtphagy Dye、Lyso Dye均在制备后需保存在-20℃情况下可以稳定保存1个月。建议按照实验用量，

提前分装保存。

Q3: 工作液稳定性如何

A3: 无法保存，建议现配现用。
Q4: 培养基中有酚红会影响检测吗？

A4：观察的时候，如果使用共聚焦激光显微镜的话，几乎不会受到酚红的影响，但是使用落射型荧光显微

镜的话，会观察到酚红色的背景。（参照以下观察数据）因此使用落射型荧光显微镜时，请在Working

solution进行染色时使用不含酚红的培养基或HBSS。

Q5: 荧光显微镜推荐的滤镜是什么？

A5:根据各种试剂推荐以下波长。
Mtphagy Dye：激发（500～560 nm）、发射（670～730 nm）

Lyso Dye：激发（350～450 nm）、发射（500～560 nm）

Q6:与其他深红色染料共同染色时的注意事项。
A6：Mtphagy Dye比一般的红色系荧光染料相比波长更长，所以和Deep Red的荧光染料一起染色的时候

需要特别注意。即Mtphagy Dye在500–560 nm处激发，可在670-730 nm处检测到荧光，这时与

MitoBright Deep Red的荧光检测波长重叠。因此，有必要在不激发深红色染料的波长下激发Mtphagy

染料，同时在不激发Mtphagy染料的波长下激发深红色染料。

[泄漏的情况]

① 制备仅添加了MitoBright Deep Red（没有添加Mtphagy Dye）的细胞。

② 通过观察MitoBright Deep Red的激发/发射波长，确认是否观察到荧光（右下图）。

③ 用Mtphagy Dye的激发/发射波长观察，确认是否观察到荧光（左下图）。

和③中，观察到来自MitoBright Deep Red的荧光（左下图）。

*如果如上所述确认荧光泄漏，请参阅以下内容。

○调整激发/发射波长

如以上确认如图所示，MitoBright Deep Red也在Ex 561 nm处激发，因此可以将Mtphagy Dye的激发

波长更改为接近激光器或滤光片的500 nm，以使MitoBright深红色不被激发。

调整荧光强度和荧光检测灵敏度

如果MitoBright Deep Red的荧光泄漏到Mtphagy染料的观察波长中，请将观察过程中的激发强度或

灵敏度降低到未观察到荧光的水平。

然后，再确认改变后的观察条件下可以检测Mtphagy Dye的荧光。

[如何检查泄漏]

使用Mtphagy Dye，Lyso dye（溶酶体染色剂），MitoBrightLT Deep Red（线粒体染色剂）

进行三重染色时进行确认

1.在3个培养皿或孔中制备细胞。

（Mtphagy Dye、Lyso Dye、MitoBright Deep Red分别在在不同的皿或孔中进行染色）

2.向每个孔中添加Mtphagy Dye和MitoBright Deep Red。（在无血清培养基中）

3.在37°C下孵育30分钟。

4.进行自噬诱导条件下（如饥饿培养等）进行培养。

5.向上述2.中未使用的细胞添加Lyso Dye。（在无血清培养基中）

6.在37°C下孵育30分钟。

7.观察每种试剂的激发波长和荧光波长以及荧光强度。

8.检查所用试剂以外的观察波长处的荧光是否没有泄漏。

[观察条件]

Lyso Dye：Ex：350-450 nm，Em：500-560 nm

Mtphagy Dye：Ex ： 500-560 nm，Em ：670-730 nm

MitoBright Deep Red：Ex ：640 nm，Em ：656-700 nm

参考文献

序号	检测对象	使用仪器	文献
1)	细胞（HeLa）	流式细胞仪	J. Koniga, C. Otta, M. Hugoa, T. Junga, A. L. Bulteaub, T. Grunea and A. Hohna, “Mitochondrial contribution to lipofuscin formation”, Redox Biology, 2017, 11, 673.
2)	细胞（KB）	荧光显微镜	K. Kameyama, “Induction of mitophagy-mediated antitumor activity with folate-appended methyl-β-cyclodextrin”, International Journal of Nanomedicine, 2017, 12, 3433.
3)	细胞（SH-SY5Y, 初代皮质神经细胞）	荧光显微镜	E. F. Fang, T. B. Waltz, H. Kassahun, Q. Lu, J. S. Kerr, M. Morevati, E. M. Fivenson, B. N. Wollman, K. Marosi, M. A. Wilson, W. B. Iser, D. M. Eckley, Y. Zhang, E. Lehrmann, I. G. Goldberg, M. S. Knudsen, M. P. Mattson, H. Nilsen, V. A. Bohr and K. G. Becker, “Tomatidine enhances lifespan and healthspan in C. elegans through mitophagy induction via the SKN-1/Nrf2 pathway”, Scientific Reports, 2017, 7, (46208), DOI: 10.1038/srep46208.
4)	细胞（HeLa、Parkin表达HeLa）	荧光显微镜	H. Iwashita, S. Torii, N. Nagahora, M. Ishiyama, K. Shioji, K. Sasamoto, S. Shimizu and K. Okuma, “Live Cell Imaging of Mitochondrial Autophagy with a Novel Fluorescent Small Molecule”, ACS Chem. Biol., 2017, 12, (10), 2546.
5)	细胞（Cardiomyocytes）	流式细胞仪	Y. Feng, NB. Madungwe, CV. da Cruz Junho and JC. Bopassa, “Activation of G protein-coupled oestrogen receptor 1 at the onset of reperfusion protects the myocardium against ischemia/reperfusion injury by reducing mitochondrial dysfunction and mitophagy.”, Br. J. Pharmacol., 2017, 174, (23), 4329.
6)	细胞（HCT116）	荧光显微镜	K. M. Elamin, K. Motoyama, T. Higashi, Y. Yamashita, A. Tokuda and H. Arima, “Dual targeting system by supramolecular complex of folate-conjugated methyl-β-cyclodextrin with adamantane-grafted hyaluronic acid for the treatment of colorectal cancer.”, Int. J. Biol. Macromol., 2018, doi: 10.1016/j.ijbiomac.2018.02.149.
7)	细胞（Parkin-HeLa）	流式细胞仪	N. Furuya, S. Kakuta, K. Sumiyoshi, M. Ando, R. Nonaka, A. Suzuki, S. Kazuno, S. Saiki and N. Hattori, “NDP52 interacts with mitochondrial RNA poly(A) polymerase to promote mitophagy.”, EMBO Rep. ., 2018, doi: 10.15252/embr.201846363.
8)	细胞（NKT）	流式细胞仪	L. Zhu, X. Xie, L. Zhang, H. Wang, Z. Jie, X. Zhou, J. Shi, S. Zhao, B. Zhang, X. Cheng and S. Sun, “TBK-binding protein 1 regulates IL-15-induced autophagy and NKT cell survival”, Nature Communications., 2018, 9, (1), doi:10.1038/s41467-018-05097-5.
9)	细胞（HeLa）	流式细胞仪	K. Araki, K. Kawauchi, W. Sugimoto, D. Tsuda, H. Oda, R. Yoshida and K. Ohtani, “Mitochondrial protein E2F3d, a distinctive E2F3 product, mediates hypoxia-induced mitophagy in cancer cells”, Commun Biol., 2019, DOI: 10.1038/s42003-018-0246-9.
10)	细胞（Bovine Sertoli）	荧光显微镜	E. Adegoke, S. Adeniran, Y. Zeng, X. Wang, H. Wang, C. Wang, H. Zhang, P. Zheng and G. Zhang , “Pharmacological inhibition of TLR4/NF-κB with TLR4-IN-C34 attenuated microcystin-leucine arginine toxicity in bovine Sertoli cells.”, J Appl Toxicol., 2019,doi: 10.1002/jat.3771.
11)	组织（小鼠）	荧光显微镜	E. F. Fang, Y. Hou, K. Palikaras, B. A. Adriaanse, J. S. Kerr, B. Yang, S. Lautrup, M. M. Hasan-Olive, D. Caponio, X. Dan, P. Rocktaschel, D. L. Croteau, M. Akbari, N. H. Greig, T. Fladby, H. Nilsen, M. Z. Cader, M. P. Mattson, N. Tavernarakis and V. A. Bohr, “Mitophagy inhibits amyloid-β and tau pathology and reverses cognitive deficits in models of Alzheimer’s disease.”, Nat. Neurosci. ., 2019,DOI:10.1038/s41593-018-0332-9.
12)	细胞（HepG2）	荧光显微镜	Iwasawa, T. Shinomiya, N. Ota, N. Shibata, K. Nakata, I. Shiina, and Y. Nagahara , “Novel Ridaifen-B Structure Analog Induces Apoptosis and Autophagy Depending on Pyrrolidine Side Chain”, Biological and Pharmaceutical Bulletin., 2019, 42, (3), 401-410, doi: 10.1248/bpb.b18-00643.
13)	细胞（U2OS）	荧光显微镜	T. Namba, “BAP31 regulates mitochondrial function via interaction with Tom40 within ER-mitochondria contact sites “, Sci Adv., 2019, 5, (6), 1386.
14)	细胞（INS-1）	荧光显微镜	A. Inamura, S. M. Hirayama, and K. Sakurai, Loss of Mitochondrial DNA by Gemcitabine Triggers Mitophagy and Cell Death’, Biol. Pharm. Bull.., 2019, 42, 1977.
15)	细胞（HRCEpiC, HRPTEpic）	流式细胞仪	Y. Zhao and M. Sun, Metformin rescues Parkin protein expression and mitophagy in high glucose-challenged human renal epithelial cells by inhibiting NF-κB via PP2A activation., Life Sci.., 2020, DOI:10.1016/j.lfs.2020.117382.
16)	细胞（RAES）	荧光显微镜	N. Liu, J. Wu, L. Zhang, Z. Gao, Y. Sun, M. Yu, Y. Zhao, S. Dong, F. Lu and W. Zhang , “Hydrogen Sulphide modulating mitochondrial morphology to promote mitophagy in endothelial cells under high‐glucose and high‐palmitate “, J. Cell. Mol. Med., 2017, 21, (12), 3190.
17)	细胞（BAECs）	荧光显微镜	N. Kajihara, D. Kukidome, K. Sada, H. Motoshima, N. Furukawa, T. Matsumura, T. Nishikawa and E. Araki, “Low glucose induces mitochondrial reactive oxygen species via fatty acid oxidation in bovine aortic endothelial cells”, J Diabetes Investig, 2017, 8, (6), 750.
18)	细胞（HT22）	荧光显微镜	M. Jin, H. Ni and L. Li, “Leptin Maintained Zinc Homeostasis Against Glutamate-Induced Excitotoxicity by Preventing Mitophagy-Mediated Mitochondrial Activation in HT22 Hippocampal Neuronal Cells.”, Front Neurol, 2018, 9, (9), 332.
19)	细胞（BMDMs）	流式细胞仪	D. Bhatia, K. P. Chung, K. Nakahira, E. Patino, M. C. Rice, L. K. Torres, T. Muthukumar, A. M. Choi, O. M. Akchurin and M. E. Choi , “Mitophagy-dependent macrophage reprogramming protects against kidney fibrosis”, JCI Insight, 2019, 4, (23), e132826.
20)	细胞（U2OS）	荧光显微镜	J. Zheng, D. L. Croteau, V. A. Bohr and M. Akbari, “Diminished OPA1 expression and impaired mitochondrial morphology and homeostasis in Aprataxin-deficient cells. “, Nucleic Acids Res., 2019, 47, (8), 4086.
21)	细胞（HT22）	荧光显微镜	D. D. Wang, M. F. Jin, D. J. Zhao and H. Ni, “Reduction of Mitophagy-Related Oxidative Stress and Preservation of Mitochondria Function Using Melatonin Therapy in an HT22 Hippocampal Neuronal Cell Model of Glutamate-Induced Excitotoxicity”, Front Endocrinol (Lausanne), 2019, 10, 550.
22)	细胞（CD⁴⁺T-cells, HeLa）	荧光显微镜	A. Bektas, S. H. Schurman, M. G. Freire, A. Bektas, S. H. Schurman, M. G. Freire, C. A. Dunn, A. K. Singh, F. Macian, A. M. Cuervo, R. Sen and L. Ferrucci, “Age-associated changes in human CD⁴⁺ T cells point to mitochondrial dysfunction consequent to impaired autophagy.”, Aging (Albany NY)., 2019, 11, (21), 9234-9263.
23)	细胞（ALM）	流式细胞仪	T. Nechiporuk, S.E. Kurtz, O. Nikolova, T. Liu, C.L. Jones, A. D. Alessandro, R. C. Hill, A. Almeida, S. K. Joshi, M. Rosenberg, C. E. Tognon, A. V. Danilov, B. J. Druker, B. H. Chang, S. K McWeeney and J. W. Tyner, “The TP53 Apoptotic Network Is a Primary Mediator of Resistance to BCL2 Inhibition in AML Cells.”, Cancer Discov., 2019, 9, (7), 919.
24)	细胞（PK-15）	荧光显微镜	Y. Zhang, R. Sun, X. Li and W. Fang, “Porcine Circovirus 2 Induction of ROS Is Responsible for Mitophagy in PK-15 Cells via Activation of Drp1 Phosphorylation”, Viruses., 2020, 12, (3), 289.
25)	细胞（HCE）	荧光显微镜	Y. Huo, W. Chen, X. Zheng, J. Zhao, Q. Zhang, Y. Hou, Y. Cai, X. Lu and X. Jin , “The protective effect of EGF-activated ROS in human corneal epithelial cells by inducing mitochondrial autophagy via activation TRPM2.”, J. Cell. Physiol., 2020, DOI: 10.1002/jcp.29597.
26)	细胞（心肌细胞）	荧光显微镜	Y. Sun, F. Lu, X. Yu, B. Wang, J. Chen, F. Lu, S. Peng, X. Sun, M. Yu, H. Chen, Y. Wang, L. Zhang, N. Liu, H. Du, D. Zhao and W. Zhang, “Exogenous H2S Promoted USP8 Sulfhydration to Regulate Mitophagy in the Hearts of db/db Mice.”, Aging Dis., 2020, 11, (2), 269.
27)	细胞（HCFs）	荧光显微镜	R. Tanaka, M. Umemura, M. Narikawa, M. Hikichi, K. Osaw, T. Fujita, U. Yokoyama, T. Ishigami, K. Tamura and Y. Ishikawa, “Reactive fibrosis precedes doxorubicin-induced heart failure through sterile inflammation.”, ESC Heart Fail., 2020, 7, (2), 588.
28)	细胞（VSMCs）	荧光显微镜	C. Duan, L. Kuang, X. Xiang, J. Zhang, Y. Zhu, Y. Wu, Q. Yan, L. Liu and T. Li, “Drp1 regulates mitochondrial dysfunction and dysregulated metabolism in ischemic injury via Clec16a-, BAX-, and GSH- pathways “, Cell Death Dis., 2020, 11, 251.
29)	细胞（Bovine Sertoli）	荧光显微镜	E. O. Adegoke, W. Xue, N. S. Machebe, S. O. Adeniran, W. Hao, W. Chen, Z. Han, Z. Guixue and Z. Peng, “Sodium Selenite inhibits mitophagy, downregulation and mislocalization of blood-testis barrier proteins of bovine Sertoli cell exposed to microcystin-leucine arginine (MC-LR) via TLR4/NF-kB and mitochondrial signaling pathways blockage.”, Ecotoxicol. Environ. Saf., 2018, 116, 165.
30)	细胞（HeLa）	荧光显微镜	D. Takahashi, J. Moriyama, T. Nakamura, E. Miki, E. Takahashi, A. Sato, T. Akaike, K. I. Nakama and H. Arimoto, “AUTACs: Cargo-Specific Degraders Using Selective Autophagy. “, Mol. Cell, 2019, 76, (5), 797.
31)	细胞（primary hepatocyte）	荧光显微镜	H. Kim, J. H. Lee and J. W. Park, “IDH2 deficiency exacerbates acetaminophen hepatotoxicity in mice via mitochondrial dysfunction-induced apoptosis.”, Biochim Biophys Acta Mol Basis Dis, 2019, 1865, (9), 2333.
32)	细胞（C3H10T1/2s）	荧光显微镜	M. S. Rahman and Y. S. Kim, “PINK1-PRKN mitophagy suppression by Mangiferin promotes a brown-fat-phenotype via PKA-p38 MAPK signalling in murine C3H10T1/2”, Metabolism, 2020, 101, 154228.
33)	细胞（NHEKs）	荧光显微镜	S. Ikeoka and A. Kiso , “The Involvement of Mitophagy in the Prevention of UV-B-Induced Damage in Human Epidermal Keratinocytes “, J. Soc. Cosmet. Chem. Jpn., 2020, 54(3), 252.

M489/Mito-FerroGreen,Fe2+荧光法,铁死亡荧光试剂

M489/Mito-FerroGreen-铁离子荧光探针,研究证实铁是生物体内量最多的过渡金属元素。其参与多种生理活动。近几年，细胞内的游离铁离子由于具有很高的反应性，和细胞损伤、死亡有一定的关联而得到了越来越多的关注。在细胞内游离铁离子以稳定的Fe2+和 Fe3+形式存在。

货号：M489
铁死亡荧光试剂 (Fe2+荧光法)
Mito-FerroGreen
储存条件：-20度保存，避光
运输条件：室温

特点：

对二价铁离子的高度选择性和高灵敏度
适用于通用滤光片

选择规格：50μg*2

产品概述

该产品已在岐阜药科大学药物化学实验室的永澤秀子和平山祐博士的指导下开发。

测定原理

产品特点

铁离子检测试剂的选择

可以根据自己的实验方法和实验仪器选择检测试剂

	FerroOrange	Mito-FerroGreen
细胞内分布	细胞内	线粒体
荧光特性	λex : 543 nm、λem : 580 nm	λex : 505 nm、λem : 535 nm
检测仪器	荧光显微镜	荧光显微镜（FITC、GFP）
（滤镜）	荧光显微镜	荧光显微镜（FITC、GFP）
检测对象	活细胞	活细胞
染色次数	24 μg可染色35 mm dish 17块板	50 μg可染色35 mm dish 5块板
染色次数	（终浓度 1 μmol/l時）	（终浓度 5 μmol/l時）

MT05/Si-DMA for Mitochondrial Singlet Oxygen Imaging试剂

MT05/Si-DMA for Mitochondrial Singlet Oxygen Imaging试剂,单线态氧(Singlet Oxygen,1O2)是一种具有强氧化性的活性氧（ROS），是造成皮肤斑点及皱纹的重要因素。在化妆品等研究中，去除单线态氧是重要的研究目的。在癌症研究领域，单线态氧在光动力疗法（PDT：一种采用光敏药物和激光活化治疗肿瘤的新兴抗癌疗法）中起到关键作用。因此检测活细胞内的单线态氧对于了解PDT的抗癌机理至关重要。但是现有的荧光探针由于不能穿透细胞膜，所以无法用于活细胞检测。

货号：MT05
线粒体内单线态氧荧光探针试剂
Si-DMA for Mitochondrial Singlet Oxygen Imaging
储存条件：-20度保存，避光
运输条件：室温

分子式：C35H37ClN2Si
分子量：549.22

特点：

能够对活细胞进行荧光成像
对单线态氧的高选择性

选择规格：2μg

产品概述

单线态氧(Singlet Oxygen,¹O₂)是一种具有强氧化性的活性氧（ROS），是造成皮肤斑点及皱纹的重要因素。在化妆品等研究中，去除单线态氧是重要的研究目的。在癌症研究领域，单线态氧在光动力疗法（PDT：一种采用光敏药物和激光活化治疗肿瘤的新兴抗癌疗法）中起到关键作用。因此检测活细胞内的单线态氧对于了解PDT的抗癌机理至关重要。但是现有的荧光探针由于不能穿透细胞膜，所以无法用于活细胞检测。

Majima等人合成了一种由含硅罗丹明和蒽环构成的新型远红外荧光探针Si-DMA，分别作为发色团和单线态氧反应位点。当存在单线态氧时会在Si-DMA的蒽环部位生成内过氧化物，Si-DMA的荧光强度会增强¹⁾。在7种不同活性氧中，Si-DMA能够特异性地检测单线态氧（图3）。另外在用5-氨基乙酰丙酸（5-ALA，一种血红素前体）处理细胞后，Si-DMA可以实时观察到线粒体中原卟啉IX产生单线态氧的变化情况（图4）。

原理

图1. Si-DMA的细胞染色原理

荧光特性

图2. Si-DMA与单线态氧反应后的激发和发射光谱

反应特异性

图3. Si-DMA对各种ROS的选择性

实验例

实验例1 荧光显微镜观察用5-氨基乙酰丙酸 (5-ALA) 处理后的HeLa细胞中的单线态氧

1. 接种200 μl HeLa细胞 (2.4×10⁵ cells/ml) 在μ-slide 8孔板 (ibidi) ，培养基为DMEM (10%FBS，1%青霉素-链霉素)，

在37℃ 5% CO₂培养箱中过夜培养。

2. 用200 μl Hanks’ HEPES 缓冲液洗涤细胞2次。

3. 在μ-slide 8孔板中加入200 μl 含5-ALA的Hanks’ HEPES 缓冲液 (150 μg/ml)，在37℃ 5% CO₂培养箱中培养4 h。

4. 用Hanks’ HEPES 缓冲液洗涤细胞2次。

5. 加入200 μl Si-DMA工作液(40 nmol/l)，在37℃ 5% CO₂培养箱中培养45 min。

6. 用200 μl Hanks’ HEPES缓冲液洗涤细胞2次。

7. 加入200 μl Hanks’ HEPES缓冲液，并用荧光显微镜进行观察。

Si-DMA检测5-ALA处理的HeLa细胞线粒体中的单线态氧的荧光成像

5-ALA处理过的HeLa细胞经过2.5 min照射后，Si-DMA的荧光增强，因此Si-DMA可以用于实时监测线粒体中原卟啉IX产生的单线态氧。

滤镜 (波长/带通型滤光片)

荧光成像：600±25 nm (Ex), 685±25 nm (Em)

实验例2 线粒体中的单线态氧检测

用终浓度为50 μmol/l的过氧化氢和终浓度为50 μmol/l的次氯酸刺激或不刺激HeLa细胞，用Si-DMA检测到细胞中产生的单线态氧。和线粒体染料（MitoBright Green: MT06)共染，特异性地在线粒体中检测到了单线态氧。

波长（激发波长/发射波长）

Si-DMA: 600±25 nm/685±25 nm

MitoBright Green: 488 nm/501-563 nm

实验例3 观察用H₂O₂处理Primary Hepatocytes细胞后产生的单线态氧

Si-DMA检测用H₂O₂刺激Primary Hepatocytes细胞后产生的单线态氧荧光成像

实验条件：

用10 mM H₂O₂刺激Primary Hepatocytes 20 min。

细胞数量：1×10⁴/dish

容器：Nest 15 mm共聚焦培养皿801002

染色条件：在37℃ 5% CO₂培养箱中染色45 min

Si-DMA工作液浓度：100 nmol/l

检测仪器：激光共聚焦显微镜

仪器品牌：Leica,Cambridge, UK

仪器型号：BMI-6000

Ex:600 nm，Em: 685 nm

(以上数据由东方肝胆外科医院信号转导实验室友情提供)

常见问题Q&A

Q1、本试剂盒与现有方法相比有什么优势？
A1：本试剂盒的优点是“能够对活细胞进行荧光成像”和“对单线态氧的高选择性”。在操作说明中有详细的实验数据。
Q2、DMSO Stock Solution的稳定性怎么样？
A2：DMSO Stock Solution配制后在-20℃及避光条件下可以保存大约1个月，建议根据每次的用量进行分装保存。
Q3、配制Working Solution可以用Hanks’ HEPES以外的缓冲液吗？
A3：还可以用HBSS缓冲液。
Q4、Working Solution的稳定性怎么样？
A4：Working Solution不稳定，请在配制当天使用。

参考文献

NO	检测对象	检测仪器	论文名
1	HeLa; RAW264.7细胞	荧光显微镜	“Far-Red Fluorescence Probe for Monitoring Singlet Oxygen during Photodyanamic Therapy“, J.Am.Chem.Soc., 2014,136 (33),11707.
2	CT26、TK6细胞	流式细胞仪	“Physical plasma elicits immunogenic cancer cell death and mitochondrial singlet oxygen“, TRPMS., 2017, 99, DOI:10.1109/TRPMS.2017.2766027.
3	HeLa、HEK293细胞	荧光显微镜	“Green monomeric photosensitizing fluorescent protein for photo-inducible protein inactivation and cell ablation “,BMC Biol., 2018, 16, 50.
4	RIN-m5f细胞	荧光显微镜	“Sonodynamic therapy inhibits palmitateinduced beta cell dysfunction via PINK1/ Parkin-dependent mitophagy“, Cell Death Dis., 2019, 10, 457.
5	HepG2、NIH3T3细胞	荧光显微镜流式细胞仪酶标仪	“Quantitative kinetics of intracellular singlet oxygen generation using a fluorescence probe“, Sci.Rep., 2020, 10, 10616.

MT12/MitoBright LT Deep Red试剂

MT12/MitoBright LT Deep Red试剂,细胞内有各种各样的细胞器，承担着各种各样必须的生命活动。其中线粒体不仅是通过氧化磷酸化反应生成ATP 的场所，它还与癌症、细胞衰老、阿尔兹海默症、帕金森综合症等神经退行性疾病紧密相关，因此它是细胞内最重要的细胞器之一。

货号：MT12
线粒体长效荧光探针-深红色
MitoBright LT Deep Red
储存条件：-20度保存，避光
运输条件：室温

特点：

荧光持续时间长
可在含血清培养基中染色
荧光显微镜、流式细胞仪均可检测

选择规格：20 μl,400 μl

关联产品TOP5

NO.1. Mitophagy Detection Kit 线粒体自噬检测
NO.2. FerroOrange 细胞亚铁离子检测
NO.3. Annexin V, FITC Apoptosis Detection Kit 细胞凋亡检测
NO.4. Cellstain- Hoechst 33342 solution 细胞核染色
NO.5. Liperfluo 细胞脂质过氧化物检测

产品概述

细胞内有各种各样的细胞器，承担着各种各样必须的生命活动。其中线粒体不仅是通过氧化磷酸化反应生成ATP 的场所，它还与癌症、细胞衰老、阿尔兹海默症、帕金森综合症等神经退行性疾病紧密相关，因此它是细胞内最重要的细胞器之一。

在对线粒体的形态和动态进行观察以及定量检测时，通常使用小分子荧光探针标记和荧光蛋白的基因转染两种方法。荧光蛋白的基因转染存在转染效率不稳定等情况，因此操作简便的小分子荧光探针的使用更为广泛。现在市面上销售的小分子荧光探针中，多为含有氯甲基的探针，该探针存在观察时间短，染色时不能使用含血清的培养基，染色后荧光背景高等问题。MitoBright LT 荧光探针克服了这些问题，可在线粒体内稳定存在一天以上，条件合适的情况下可达到一周。而且与含有氯甲基的探针相比，染色后的荧光强度更高。本品直接采用DMSO 溶液包装，可快速方便的进行线粒体染色。荧光颜色有Green, Red, Deep Red 等多种选择，可满足多重染色等各种各样的实验要求。

产品特点

1.可长时间在细胞内存在

用HBSS 清洗 HeLa 细胞后，分别用 MitoBright LT 和其他公司的试剂进行染色，更换含血清的培养基，培养 4 天后观察线粒体染色情况。其他公司的染色试剂在 4 天后荧光强度大幅降低，而 MitoBrightLT 依然维持着高荧光强度，并且在染色 7 日后依然可以观察到荧光。

＜检测条件＞

MitoBright LT Green 、（T 公司）Green：Ex：488 nm/Em:500–560 nm

MitoBright LT Red 、（T 公司）Red：Ex 561：nm/Em:560–620 nm

MitoBright LT Deep Red 、（T 公司）Deep Red：Ex：640 nm/Em:650–700 nm

2.可以使用含血清培养基

用MitoBright LT 和其他公司试剂，分别用含有血清和不含血清的培养基染色。其他公司试剂在含有血清的培养基染色时，荧光明显减弱，而 MitoBright LT 在含有血清的培养基条件下，荧光没有减弱，可明显观察到线粒体的染色情况。

3.线粒体的分裂和融合

用100 nmol/l MitoBrightLT Red将HeLa细胞染色后，换入无血清培养基30分钟后观察线粒体形态。

＜检测仪器＞

共聚焦显微镜，放大倍率：63倍

＜检测条件＞

Ex:561 nm/Em:560–620 nm

实验例

用流式细胞仪检测

1. 用RPMI 培养基(10% fetal bovine serum, 1% penicillin-streptomycin)配制Jurkat 细胞悬液(3.2×10⁵cell/mL)播种于5 cm 培养皿，37℃，5% CO2 培养箱内培养一晚。

2. 去除培养基，加入MitoBright LT Working Solution (0.1 μmol/L, 5 mL)， 37℃培养30 分钟。

3. 去除溶液，用 5mL 的PRPMI 培养基清洗细胞2 次。

4. 添加RPMI 培养基，持续培养细胞，每隔2 天用流式细胞仪检测。

在胶原蛋白涂覆玻璃板上观察线粒体荧光成像

胶原蛋白涂覆玻璃板通常用于线粒体形态的高倍放大观察。

现有的线粒体染色试剂存在吸附胶原蛋白和升高背景的问题，但是MitoBright LT系列可以在不受背景影响的情况下清楚地对线粒体进行染色。

<染色条件>

将HeLa细胞接种在胶原蛋白涂覆玻璃板上，培养24小时，提取上清液并用HBSS洗涤。

加入100nmol / L的MitoBright LT Green工作溶液，培养30分钟后，提取上清液并用HBSS洗涤后用荧光显微镜观察。

<检测条件>

Ex488 nm，Em 500-560 nm

<结果>

现有的线粒体染色剂存在吸附胶原蛋白和升高背景的问题，但是MitoBright LT系列可以清晰地对线粒体染色，而不受背景影响。

通过超分辨率激光显微镜（STED）观察线粒体内部构造

线粒体疾病致突变的Cybrid细胞用MitoBright-LT-Deep Red染色，用超分辨激光显微镜(STED)观察，证实线粒体嵴结构异常。

＜实验条件＞

色素：MitoBrightLT Deep Red（100nmol/l）

仪器：Leica超分辨率激光显微镜TCS SP8 STED 3X

Ex. 640 nm / Em. 650-700 nm

STED激光：775nm

<实验步骤>

1将细胞接种在玻璃培养皿中，培养2天（37℃，5% CO₂）。

2去除培养基后，加入使用L-15培养基（含10%FBS）制备的MitoBrightLT Deep Red（100nmol/l）工作液。

3孵育45分钟（37度，5% CO₂）。

4去除上清液，用HBSS清洗两次。

5加入L-15培养基（含10%FBS），通过超分辨率激光显微镜（Leica TCS SP8 STED）进行观察。

以上数据由东京都老年学研究所衰老控制研究小组的大澤郁朗博士和藤田泰典博士友情提供。

产品文献

研究所开发的线粒体长效染色荧光探针MitoBright LT系列在世界范围内广受科研人员的好评。在上市后的很短时间内，就出现了多篇使用MitoBright LT系列探针的论文，下面收集整理了部分的论文，其中红色字体标记的是使用本产品标记线粒体后，长时间(最长至5天)观察线粒体动态的报道，供感兴趣的科研人员参考。

产品名	检测样品	染色后的观察时间	检测仪器	发表期刊(含原文链接)	影响因子
MitoBright LT Green	细胞 (U251)	立即	荧光显微镜	Pharmaceuticals	4.286
MitoBright LT Green	酵母 (Lipomyces starkeyi)	立即	荧光显微镜	Genes to Cells	1.655
MitoBright LT Green	细胞 (HeLa)	立即	荧光酶标仪	Biomaterials	10.317
MitoBright LT Green	细胞 (Naive CD4+ T cells)	立即	荧光显微镜	Cell Reports	9.423
MitoBright LT Green	细胞 (CT26)	立即	流式细胞仪	Journal of Radiation Research	2.841
MitoBright LT Green	细胞 (C2C12)	5 天	荧光显微镜	Polymers	4.329
MitoBright LT Green	细胞 (BMM)	36 小时 or 3 天	荧光显微镜/ 流式细胞仪	JCI Insights	8.315
MitoBright LT Green	细胞 (mouse erythrocytes)	立即	荧光显微镜	Front. Cell. Infect. Microbiol.	5.293
MitoBright LT Red	细胞 (SH-SY5Y)	立即	荧光显微镜	Free Radical Biol. Med.	7.376
MitoBright LT Red	细胞 (MRC-5)	立即	荧光显微镜	The FEBS Journal	5.542
MitoBright LT Red	细胞 (A11 cells/ P29 cells)	3 天	荧光显微镜	BMC Mol. Cell Biol.	5.293
MitoBright LT Deep Red	细胞 (HT-1080; MCF-10A; MCF-7; HCT-116 )	立即	荧光显微镜	Small	13.281
MitoBright LT Deep Red	细胞 (HT-1080; MCF-10A; MCF-7 )	8 小时	荧光显微镜	Advanced Therapeutics	–
MitoBright LT Deep Red	细胞 (4T1)	24 小时	荧光显微镜	Advanced Functional Materials	18.808
MitoBright LT Deep Red	细胞 (SW982)	立即	荧光显微镜	Gene	3.368

荧光特性

MitoBright LT 染料的荧光特性

常见问题Q&A

Q1：MitoBright LT需要用DMSO溶液配制，反复冻结融化也不会影响试剂质量吗？
A1：我们已经确认可以使用冻融30次的溶液进行染色。
Q2：MitoBright LT和MitoBright的区别。
A2：MitoBright LT是MitoBright具有更强细胞内滞留性性能的产品。另外MitoBright LT是溶于DMSO的产品，可以立即使用，而无需准备染色溶液。

Q3：用MitoBright LT系列染色后再去极化是否会影响染色效果？
A3：我们确认了去极化和细胞种类对于染色效果的影响，MitoBright LT的每种染料都有不同程度的影响。作为参考，本公司将HeLa细胞用不同的MitoBrightLT试剂进行染色，在以下条件下进行去极化处理，观察荧光染色的变化。
<染色条件>
HeLa细胞用MitoBright LT（100 μmol/l，孵育30分钟）染色，并用HBSS洗涤。
用FCCP（100 μmol/l，孵育60分钟）处理，用HBSS洗涤2次，然后观察荧光。

<检测条件>

MitoBright LT Green :Ex 488 nm/Em 500–560 nm

MitoBright LT Red :Ex 561 nm/Em 560–620 nm

MitoBright LT Deep Red :Ex 640 nm/Em 650–700 nm

规格性状

性状：本品是黄色液体

吸光度：0.600～0.800(490 nm附近）

MT11/MitoBright LT Red试剂

MT11/MitoBright LT Red试剂,细胞内有各种各样的细胞器，承担着各种各样必须的生命活动。其中线粒体不仅是通过氧化磷酸化反应生成ATP 的场所，它还与癌症、细胞衰老、阿尔兹海默症、帕金森综合症等神经退行性疾病紧密相关，因此它是细胞内最重要的细胞器之一。

货号：MT11
线粒体长效荧光探针-红色
MitoBright LT Red
储存条件：-20度保存，避光
运输条件：室温

特点：

荧光持续时间长
可在含血清培养基中染色
荧光显微镜、流式细胞仪均可检测

选择规格：20 μl,400 μl

产品概述

产品特点

1.可长时间在细胞内存在

用HBSS 清洗 HeLa 细胞后，分别用 MitoBright LT 和其他公司的试剂进行染色，更换含血清的培养

基，培养4天后观察线粒体染色情况。其他公司的染色试剂在4天后荧光强度大幅降低，而MitoBright

LT 依然维持着高荧光强度，并且在染色7日后依然可以观察到荧光。

＜检测条件＞

MitoBright LT Green 、（T 公司）Green：Ex：488 nm/Em：500–560 nm

MitoBright LT Red 、（T 公司）Red：Ex：561 nm/Em：560–620 nm

MitoBright LT Deep Red 、（T 公司）Deep Red：Ex：640 nm/Em：650–700 nm

2.可以使用含血清培养基

3.荧光显微镜观察

HeLa细胞用CCCP处理，并与线粒体检测试剂（Mtphagy Dye）和线粒体染色试剂（MitoBright LT Green）共同染色，并经过一段时间（6小时）后进行检测。

检测条件>

设备：LSM-700 Laser scanning confocal microscope (LSCM)

(Carl Zeiss, Oberkochen, Germany)

激发波长：

MitoBright LT Green 488 nm

Mtphagy Dye 555 nm

物镜：63x

拍摄时间：6小时

拍摄间隔：15秒

实验例

用流式细胞仪检测

1. 用RPMI 培养基(10% fetal bovine serum, 1% penicillin-streptomycin)配制Jurkat 细胞悬液(3.2×10⁵cell/ml)播种于5 cm 培养皿，37℃，5% CO2培养箱内培养一晚。

2. 去除培养基，加入MitoBright LT Working Solution (0.1 μmol/L,5 ml)， 37℃培养30 分钟。

3. 去除溶液，用 5mL 的PRPMI 培养基清洗细胞2次。

4. 添加RPMI培养基，持续培养细胞，每隔2天用流式细胞仪检测。

在胶原蛋白涂覆玻璃板上观察线粒体荧光成像

胶原蛋白涂覆玻璃板通常用于线粒体形态的高倍放大观察。

现有的线粒体染色试剂存在吸附胶原蛋白和升高背景的问题，但是MitoBright LT系列可以在不受背景影响的情况下清楚地对线粒体进行染色。

<染色条件>

将HeLa细胞接种在胶原蛋白涂覆玻璃板上，培养24小时，提取上清液并用HBSS洗涤。

加入100nmol / L的MitoBright LT Green工作溶液，培养30分钟后，提取上清液并用HBSS洗涤后用荧光显微镜观察。

<检测条件>

Ex：488 nm，Em：500-560 nm

<结果>

现有的线粒体染色剂存在吸附胶原蛋白和升高背景的问题，但是MitoBright LT系列可以清晰地对线粒体染色，而不受背景影响。

通过超分辨率激光显微镜（STED）观察线粒体内部构造

线粒体疾病致突变的Cybrid细胞用MitoBright-LT-Deep Red染色，用超分辨激光显微镜(STED)观察，证实线粒体嵴结构异常。

＜实验条件＞

色素：MitoBrightLT Deep Red（100 nmol/l）

仪器：Leica超分辨率激光显微镜TCS SP8 STED 3X

Ex：640 nm / Em： 650-700 nm

STED激光：775nm

<实验步骤>

1将细胞接种在玻璃培养皿中，培养2天（37℃，5% CO₂）。

2去除培养基后，加入使用L-15培养基（含10%FBS）制备的MitoBrightLT Deep Red（100 nmol/l）工作液。

3孵育45分钟（37度，5% CO₂）。

4去除上清液，用HBSS清洗两次。

5加入L-15培养基（含10%FBS），通过超分辨率激光显微镜（Leica TCS SP8 STED）进行观察。

以上数据由东京都老年学研究所衰老控制研究小组的大澤郁朗博士和藤田泰典博士友情提供。

产品文献

产品名	检测样品	染色后的观察时间	检测仪器	发表期刊(含原文链接)	影响因子
MitoBright LT Green	细胞 (U251)	立即	荧光显微镜	Pharmaceuticals	4.286
MitoBright LT Green	酵母 (Lipomyces starkeyi)	立即	荧光显微镜	Genes to Cells	1.655
MitoBright LT Green	细胞 (HeLa)	立即	荧光酶标仪	Biomaterials	10.317
MitoBright LT Green	细胞 (Naive CD4+ T cells)	立即	荧光显微镜	Cell Reports	9.423
MitoBright LT Green	细胞 (CT26)	立即	流式细胞仪	Journal of Radiation Research	2.841
MitoBright LT Green	细胞 (C2C12)	5 天	荧光显微镜	Polymers	4.329
MitoBright LT Green	细胞 (BMM)	36 小时 or 3 天	荧光显微镜/ 流式细胞仪	JCI Insights	8.315
MitoBright LT Green	细胞 (mouse erythrocytes)	立即	荧光显微镜	Front. Cell. Infect. Microbiol.	5.293
MitoBright LT Red	细胞 (SH-SY5Y)	立即	荧光显微镜	Free Radical Biol. Med.	7.376
MitoBright LT Red	细胞 (MRC-5)	立即	荧光显微镜	The FEBS Journal	5.542
MitoBright LT Red	细胞 (A11 cells/ P29 cells)	3 天	荧光显微镜	BMC Mol. Cell Biol.	5.293
MitoBright LT Deep Red	细胞 (HT-1080; MCF-10A; MCF-7; HCT-116 )	立即	荧光显微镜	Small	13.281
MitoBright LT Deep Red	细胞 (HT-1080; MCF-10A; MCF-7 )	8 小时	荧光显微镜	Advanced Therapeutics	–
MitoBright LT Deep Red	细胞 (4T1)	24 小时	荧光显微镜	Advanced Functional Materials	18.808
MitoBright LT Deep Red	细胞 (SW982)	立即	荧光显微镜	Gene	3.368

荧光特性

MitoBright LT 染料的荧光特性

常见问题Q&A

Q3：用MitoBright LT系列染色后再去极化是否会影响染色效果？

A3：我们确认了去极化和细胞种类对于染色效果的影响，MitoBright LT的每种染料都有不同程度的影响。作为参考，本公司将HeLa细胞用不同的MitoBrightLT试剂进行染色，在以下条件下进行去极化处理，观察荧光染色的变化。

<染色条件>

HeLa细胞用MitoBright LT（100 μmol/l，孵育30分钟）染色，并用HBSS洗涤。

用FCCP（100 μmol/l，孵育60分钟）处理，用HBSS洗涤2次，然后观察荧光。

<检测条件>

MitoBright LT Green :Ex 488 nm/Em 500–560 nm

MitoBright LT Red :Ex 561 nm/Em 560–620 nm

MitoBright LT Deep Red :Ex 640 nm/Em 650–700 nm

规格性状

性状：本品是黄色液体

吸光度：0.600～0.800(490 nm附近）

MT10/MitoBright LT Green试剂

MT10/MitoBright LT Green试剂,细胞内有各种各样的细胞器，承担着各种各样必须的生命活动。其中线粒体不仅是通过氧化磷酸化反应生成ATP的场所，它还与癌症、细胞衰老、阿尔兹海默症、帕金森综合症等神经退行性疾病紧密相关，因此它是细胞内最重要的细胞器之一。

货号：MT10
线粒体长效荧光探针-绿色
MitoBright LT Green
储存条件：-20度保存
运输条件：室温

特点：

荧光持续时间长
可在含血清培养基中染色
荧光显微镜、流式细胞仪均可检测

选择规格：20 μl,400 μl

关联产品TOP5

NO.1. Mitophagy Detection Kit 线粒体自噬检测
NO.2. FerroOrange 细胞亚铁离子检测
NO.3. DALGreen – Autophagy Detection 细胞自噬检测
NO.4. Liperfluo 细胞脂质过氧化物检测
NO.5. Lactate Assay Kit-WST 乳酸检测

产品概述

细胞内有各种各样的细胞器，承担着各种各样必须的生命活动。其中线粒体不仅是通过氧化磷酸化反应生成ATP的场所，它还与癌症、细胞衰老、阿尔兹海默症、帕金森综合症等神经退行性疾病紧密相关，因此它是细胞内最重要的细胞器之一。

在对线粒体的形态和动态进行观察以及定量检测时，通常使用小分子荧光探针标记和荧光蛋白的基因转染两种方法。荧光蛋白的基因转染存在转染效率不稳定等情况，因此操作简便的小分子荧光探针的使用更为广泛。现在市面上销售的小分子荧光探针中，多为含有氯甲基的探针，该探针存在观察时间短，染色时不能使用含血清的培养基，染色后荧光背景高等问题。MitoBright LT荧光探针克服了这些问题，可在线粒体内稳定存在一天以上，条件合适的情况下可达到一周。而且与含有氯甲基的探针相比，染色后的荧光强度更高。本品直接采用DMSO溶液包装，可快速方便的进行线粒体染色。荧光颜色有Green, Red, Deep Red等多种选择，可满足多重染色等各种各样的实验要求。

产品特点

1.可长时间在细胞内存在

用HBSS清洗HeLa细胞后，分别用MitoBright LT和其他公司的试剂进行染色，更换含血清的培养基，培养4天后观察线粒体染色情况。其他公司的染色试剂在4天后荧光强度大幅降低，而MitoBright LT依然维持着高荧光强度，并且在染色7日后依然可以观察到荧光。

＜检测条件＞

MitoBright LT Green 、（T公司）Green：Ex 488 nm/Em 500–560 nm

MitoBright LT Red 、（T公司）Red：Ex 561 nm/Em 560–620 nm

MitoBright LT Deep Red 、（T公司）Deep Red：Ex 640 nm/Em 650–700 nm

2.可以使用含血清培养基

用MitoBright LT和其他公司试剂，分别用含有血清和不含血清的培养基染色。其他公司试剂在含有血清的培养基染色时，荧光明显减弱，而MitoBright LT在含有血清的培养基条件下，荧光没有减弱，可明显观察到线粒体的染色情况。

实验例

实时荧光观察

HeLa细胞用CCCP处理，并与线粒体检测试剂（Mtphagy Dye）和线粒体染色试剂（MitoBright LT Green）共同染色，并经过一段时间（6小时）后进行检测。

<检测条件>

设备：LSM-700 Laser scanning confocal microscope (LSCM)

(Carl Zeiss, Oberkochen, Germany)

激发波长：

MitoBright LT Green 488 nm

Mtphagy Dye 555 nm

物镜：63x

拍摄时间：6小时

拍摄间隔：15秒

用流式细胞仪检测

1. 用RPMI培养基(10% Fetal Bovine Serum, 1% Penicillin-Streptomycin)配制Jurkat细胞悬液(3.2×10⁵cell/ml)接种于5 cm培养皿中，在37℃，5% CO₂培养箱内过夜培养。

2. 去除培养基，加入MitoBright LT Working Solution (0.1 μmol/l, 5 ml)，在37℃培养30分钟。

3. 去除溶液，用 5 ml的PRPMI培养基清洗细胞2 次。

4. 更换RPMI培养基，持续培养细胞，每隔2 天用流式细胞仪检测。

在胶原蛋白涂覆玻璃板上观察线粒体荧光成像

胶原蛋白涂覆玻璃板通常用于线粒体形态的高倍放大观察。

现有的线粒体染色试剂存在吸附胶原蛋白和升高背景的问题，但是MitoBright LT系列可以在不受背景影响的情况下清楚地对线粒体进行染色。

<染色条件>

将HeLa细胞接种在胶原蛋白涂覆玻璃板上，培养24小时，提取上清液并用HBSS洗涤。

加入100 nmol/l的MitoBright LT Green工作溶液，培养30分钟后，提取上清液并用HBSS洗涤后用荧光显微镜观察。

<检测条件>

Ex 488 nm，Em 500-560 nm

<结果>

现有的线粒体染色剂存在吸附胶原蛋白和升高背景的问题，但是MitoBright LT系列可以清晰地对线粒体染色，而不受背景影响。

通过超分辨率激光显微镜（STED）观察线粒体内部构造

线粒体疾病致突变的Cybrid细胞用MitoBright-LT-Deep Red染色，用超分辨激光显微镜(STED)观察，证实线粒体嵴结构异常。

＜实验条件＞

色素：MitoBrightLT Deep Red（100 nmol/l）

仪器：Leica超分辨率激光显微镜TCS SP8 STED 3X

Ex. 640 nm / Em. 650-700 nm

STED激光：775nm

<实验步骤>

1将细胞接种在玻璃培养皿中，培养2天（37℃，5% CO₂）。

2去除培养基后，加入使用L-15培养基（含10%FBS）制备的MitoBrightLT Deep Red（100 nmol/l）工作液。

3孵育45分钟（37度，5% CO₂）。

4去除上清液，用HBSS清洗两次。

5加入L-15培养基（含10%FBS），通过超分辨率激光显微镜（Leica TCS SP8 STED）进行观察。

以上数据由东京都老年学研究所衰老控制研究小组的大澤郁朗博士和藤田泰典博士友情提供。

产品文献

开发的线粒体长效染色荧光探针MitoBright LT系列在世界范围内广受科研人员的好评。在上市后的很短时间内，就出现了多篇使用MitoBright LT系列探针的论文，下面收集整理了部分的论文，其中红色字体标记的是使用本产品标记线粒体后，长时间(最长至5天)观察线粒体动态的报道，供感兴趣的科研人员参考。

产品名	检测样品	染色后的观察时间	检测仪器	发表期刊(含原文链接)	影响因子
MitoBright LT Green	细胞 (U251)	立即	荧光显微镜	Pharmaceuticals	4.286
MitoBright LT Green	酵母 (Lipomyces starkeyi)	立即	荧光显微镜	Genes to Cells	1.655
MitoBright LT Green	细胞 (HeLa)	立即	荧光酶标仪	Biomaterials	10.317
MitoBright LT Green	细胞 (Naive CD4+ T cells)	立即	荧光显微镜	Cell Reports	9.423
MitoBright LT Green	细胞 (CT26)	立即	流式细胞仪	Journal of Radiation Research	2.841
MitoBright LT Green	细胞 (C2C12)	5 天	荧光显微镜	Polymers	4.329
MitoBright LT Green	细胞 (BMM)	36 小时 or 3 天	荧光显微镜/ 流式细胞仪	JCI Insights	8.315
MitoBright LT Green	细胞 (mouse erythrocytes)	立即	荧光显微镜	Front. Cell. Infect. Microbiol.	5.293
MitoBright LT Red	细胞 (SH-SY5Y)	立即	荧光显微镜	Free Radical Biol. Med.	7.376
MitoBright LT Red	细胞 (MRC-5)	立即	荧光显微镜	The FEBS Journal	5.542
MitoBright LT Red	细胞 (A11 cells/ P29 cells)	3 天	荧光显微镜	BMC Mol. Cell Biol.	5.293
MitoBright LT Deep Red	细胞 (HT-1080; MCF-10A; MCF-7; HCT-116 )	立即	荧光显微镜	Small	13.281
MitoBright LT Deep Red	细胞 (HT-1080; MCF-10A; MCF-7 )	8 小时	荧光显微镜	Advanced Therapeutics	–
MitoBright LT Deep Red	细胞 (4T1)	24 小时	荧光显微镜	Advanced Functional Materials	18.808
MitoBright LT Deep Red	细胞 (SW982)	立即	荧光显微镜	Gene	3.368

荧光特性

MitoBright LT 染料的荧光特性

常见问题Q&A

Q3：用MitoBright LT系列染色后再去极化是否会影响染色效果？

A3：我们确认了去极化和细胞种类对于染色效果的影响，MitoBright LT的每种染料都有不同程度的影响。作为参考，本公司将HeLa细胞用不同的MitoBrightLT试剂进行染色，在以下条件下进行去极化处理，观察荧光染色的变化。
<染色条件>

HeLa细胞用MitoBright LT（100 μmol/l，孵育30分钟）染色，并用HBSS洗涤。

用FCCP（100 μmol/l，孵育60分钟）处理，用HBSS洗涤2次，然后观察荧光。

<检测条件>

MitoBright LT Green :Ex 488 nm/Em 500–560 nm

MitoBright LT Red :Ex 561 nm/Em 560–620 nm

MitoBright LT Deep Red :Ex 640 nm/Em 650–700 nm

规格性状

性状：本品是黄色液体

吸光度：0.600～0.800(490 nm附近）

MT09/JC-1 MitoMP Detection Kit-线粒体膜电位检测试剂盒

货号：MT09
线粒体膜电位检测试剂盒
JC-1 MitoMP Detection Kit
储存条件：0-5度保存
运输条件：室温

特点：

灵敏度高
易上手
多种仪器均可检测

选择规格：1set

关联产品TOP5

试剂盒内含

1 set
JC-1 Dye 100 nmolx1
lmaging Buffer (10x) 11 mlx1

产品概述

细胞中的线粒体作为有氧呼吸产生ATP的主要场所，是体内重要的细胞器之一，常被用于早期细胞毒性、氧化应激、细胞凋亡等研究中1)。线粒体活性的降低与机能失调，已被证实与癌症、衰老、神经退行性疾病 (如阿尔兹海默症、帕金森病等) 等密切相关2)3)。

当JC-1工作液的浓度为2 μmol/l, 每次用量为100 μl时，可以检测500次。

产品特点

1.为什么要检测线粒体膜电位

2.初次使用也很容易上手

3.去极化的检测实例

使用去极化剂carbonylcyanide-p-trifluoromethoxyphenylhydrazone（FCCP）对HeLa细胞进行处理，用本试

剂盒进行检测。可以发现与未加药物的细胞相比，加药组细胞的红色荧光明显减少。

实验条件

JC-1浓度： 2 μmol/l in MEM, 染色时间30 min

FCCP浓度：100 μmol/l， FCCP处理时间1 h

检测条件

Green : Ex 488 nm/ Em 500-550 nm;

Red : Ex 561 nm/ Em 560-610 nm;

标尺: 20 μm

操作步骤

实验例

1.诱导凋亡的实验例

1.1 荧光显微镜

通过荧光颜色的改变判断由凋亡导致的线粒体膜电位的变化。

检测条件

Green: Ex 488 nm / Em 500-550 nm

Red : Ex 561 nm / Em 560-610 nm

标尺: 80 μm

1.2 流式细胞仪

定量分析单个细胞的膜电位变化

检测条件

Green: Ex 488 nm / Em 515-545 nm

Red : Ex 488 nm / Em 564-604 nm

1.3 酶标仪

确认孔板中吸光度来判断线粒体膜电位的变化

检测条件

Green: Ex 485 nm / Em 525-545 nm

Red : Ex 535 nm / Em 585-605 nm

2.诱导自噬的实验例

<检测条件>

线粒体自噬检测

Ex：561 nm，Em：570-700 nm

线粒体膜电位检测

绿色Ex：488 nm，Em：500-550 nm

红色Ex：561 nm，Em：560-610 nm

实验条件

1.将Parkin质粒导入HeLa细胞

使用HilyMax（货号：H357）将Parkin质粒引入HeLa细胞中（Parkin质粒/HilyMax试剂：0.1 μg/0.2 μl）

然后过夜培养，收集细胞进行以下检测。

2.自噬检测

3.线粒体膜电位检测

3.线粒体膜电位与细胞周期关联性

将已知能在细胞周期的G2/M期起作用以终止细胞增殖并诱导细胞衰老的阿霉素（DOX）加入A549细胞后，

使用细胞周期检测试剂盒蓝色（产品代码：C549）/深红色（产品代码：C548）后检测。

参考文献

文献No.	检测对象	检测仪器	引用
1)	细胞（U2OS, HeLa）	荧光显微镜	T. Namba, “BAP31 regulates mitochondrial function via interaction with Tom40 within ER-mitochondria contact sites “, Sci Adv., 2019, 5, (6), 1386.
2)	细胞（Neuron）	荧光显微镜	I. Kawahata, L. Luc Bousset, R. Melki and K. Fukunaga , “Fatty Acid-Binding Protein 3 is Critical for α-Synuclein Uptake and MPP+-Induced Mitochondrial Dysfunction in Cultured Dopaminergic Neurons “, Int J Mol Sci., 2019, 20, 5358.
3)	细胞（3T3L1, C2C12）	流式细胞仪	M. Kurano, K. Tsukamoto, T. Shimizu, H. Kassai, K. Nakao, A. Aiba, M. Hara and Yatomi , “Protection Against Insulin Resistance by Apolipoprotein M/Sphingosine 1-Phosphate “, Diabetes, 2020, DOI: 10.2337/db19-0811.
4)	细胞	流式细胞仪	T. Nechiporuk, S.E. Kurtz, O. Nikolova, T. Liu, C.L. Jones, A. D. Alessandro, R. C. Hill, A. Almeida, S. K. Joshi, M. Rosenberg, C. E. Tognon, A. V. Danilov, B. J. Druker, B. H. Chang, S. K McWeeney and J. W. Tyner , “The TP53 Apoptotic Network Is a Primary Mediator of Resistance to BCL2 Inhibition in AML Cells.”, Cancer Discov, 2019, 9,
5)	细胞	荧光显微镜	G. Yang, M. Fan, J. Zhu, C. Ling, L. Wu, X. Zhang, M. Zhang, J. Li, Q. Yao, Z. Gu and X. Cai, “A multifunctional anti-inflammatory drug that can specifically target activated macrophages massively deplete intracellular H2O2 and produce large amounts CO for a highly efficient treatment of osreoarthritis” , Biomaterials, 2020, doi:10.1016/j.biomaterials.2020.120155.
6)	细胞（ARPE-19)	荧光显微镜	J. H. Quan, F. F. Gao, H. A. Ismail, J. M. Yuk, G. H. Cha, J. Q. Chu and Y. H. Lee, “Silver Nanoparticle-Induced Apoptosis in ARPE-19 Cells Is Inhibited by Toxoplasma gondii Pre-Infection Through Suppression of NOX4-Dependent ROS Generation”, Int J Nanomedicine , 2020, 15, 3695–3716.

常见问题Q&A

Q1: 本试剂盒可以检测多少次？

A1:大概的使用次数请参考下表：

检测装置	容器	使用次数	液量
流式细胞仪	–	100次	0.5 ml/次
荧光显微镜荧光酶标仪	35 mm dish	25次	2 ml/孔
	8孔Chamber Slide	30次	200 μl/孔
	96孔板	5次	100 μl/孔

Q2：在JC-1染色后，可以使用PBS代替HBSS洗涤吗？

A2：我们建议使用HBSS来减少对细胞的损伤。如果您手边没有HBSS的话，建议使用培养基洗净。

Q3：可以使用含血清的培养基吗？

A3：在清洗细胞和Working Solution中可以使用含血清的培养基。在观察荧光时建议使用Imaging Buffer。如果一定要使用含血清的培养基的话，建议不要加酚红。

Q4：染色后细胞固定或者固定后进行染色可以实现吗？

A4：细胞固定操作会使得线粒体去极化，所以染色前后均不能进行细胞固定。

Q5：处理后的样品与对照组相比较，红和绿两种荧光值都增加（或减少）了，结果该如何解释？

A5：请先比较实验组和对照组的荧光比值，两者相比，荧光比越低，线粒体膜电位越低。

用荧光之比进行结果分析的理由。

JC-1由于膜电位依存性地在细胞中积蓄，根据细胞的状态，每个细胞的JC-1的浓度有可能不同。

由于对照组和实验组处理样品的细胞状态不同，JC-1的累积浓度不同。)

另外，在线粒体膜电位较高的状态下，JC-1会聚集在一起，使荧光从绿色转移到红色。

该聚集体的量取决于膜电位的程度，因此可以用红/绿之比来比较样品之间的线粒体膜电位。

＜参考文献＞

1) Cossarizza, A. et al., Biochem Biophys Res Commun., 1993, 197(1), 40.

2) Perelman, A. et al., Cell Death and Disease, 2012, 3, e430

3) Smiley, S. T. et al., Proc. Nail. Acad. Sci., 1991, 88, 3671.

C549/Cell Cycle Assay Solution Blue试剂

C549/Cell Cycle Assay Solution Blue试剂,细胞周期的调控系统与细胞增殖密切相关。一个细胞产生两个子细胞的细胞分裂是细胞周期的一部分。细胞周期可以通过流式细胞术测量细胞DNA染色，然后分析染色细胞核在细胞周期阶段的比例来分析。细胞周期分为两个主要阶段：间期和有丝分裂（M）期。间期由G1期（发生在细胞分裂之前的DNA合成准备）、S期（DNA合成和复制）和G2期（具有重复染色体的单个细胞）组成。M期包括有丝分裂和胞质分裂。

货号：C549
细胞周期检测试剂盒-蓝色
Cell Cycle Assay Solution Blue
储存条件：0-5 ℃
运输条件：常温

特点：

检测时间短
固定和不固定都可以用
悬浮细胞核贴壁细胞都可以用

选择规格：50 tests

产品概述

细胞周期的调控系统与细胞增殖密切相关。一个细胞产生两个子细胞的细胞分裂是细胞周期的一部分。细胞周期可以通过流式细胞术测量细胞DNA染色，然后分析染色细胞核在细胞周期阶段的比例来分析。细胞周期分为两个主要阶段：间期和有丝分裂（M）期。间期由G1期（发生在细胞分裂之前的DNA合成准备）、S期（DNA合成和复制）和G2期（具有重复染色体的单个细胞）组成。M期包括有丝分裂和胞质分裂。细胞周期的进展受细胞周期蛋白和细胞周期蛋白依赖性激酶的调控。分析细胞周期检查点的作用机制，对确定抗癌药物及其他药物的作用具有重要意义

产品特性

产品特点：检测时间短

碘化丙啶（PI）通常用于使用流式细胞仪进行细胞周期分析。与这种分析方法相比，深红色细胞周期测定溶液具有良好的膜渗透性，并使用对DNA具有高特异性的染料，因此仅需将试剂添加到细胞悬液中就可以分析细胞周期。此外，深红色细胞周期测定解决方案中还提供了633 nm激光器，使您可以同时使用高度通用的488 nm激光器。

实验案例

对比实验：准确的判段活细胞的细胞周期

用细胞周期流式检测试剂（蓝色和深红色）染色的活CHO细胞，同时使用广泛应用的PI染色产品和同仁已有的细胞周期检测试剂盒，进行了类似的实验。结果，通过细胞周期流式检测试剂获得的结果与PI染色结果相同（如下所示）。与四种不同的产品相比，我们的产品在活细胞中获得了清晰的直方图峰。

示例：抗癌剂引起的细胞功能的变化

阿霉素（DOX）在细胞周期的G2 / M期抑制细胞增殖，并诱导细胞衰老。将DOX加入A549细胞后，G2 / M期的峰值增高（Cell Cycle Assay Solution Deep Red、Blue;C548\C549），诱导细胞衰老（Cellular Senescence Detection Kit – SPiDER-βGal；SG03）和线粒体膜电位发生变化（JC-1 MitoMP Detection Kit；MT09)

常见问题Q&A

Q1:悬浮细胞和贴壁细胞都可以检测吗？

A1:悬浮细胞和贴壁细胞都可以使用。

Q2:胰酶会影响检测吗？

A2：如果实验中有胰酶残留，会影响检测；

如果回收细胞时使用胰酶，请确保按照方案进行清洁操作，去除残留胰酶。

Q3:需要固定细胞吗？

A3:固定和不固定细胞都可以。

Q4:如果需要对要检测的固定细胞进行保存，是应该染色前保存还是染色后保存？

A4：都可以，本公司实际对比案例：

分别在保存固定细胞前后做了染色实验，检测结果没有差异

・将固定细胞冷藏（4℃）后保存1周，根据使用说明书对细胞进行染色。

・根据使用说明书对固定细胞进行染色，将细胞冷藏（4℃）后保存1周。

*冷冻保存细胞的话有可能会沉淀不溶物，所以不推荐冷冻保存。

Q5:用Cell Cycle Assiay Soluton染色后，为了除去过量的试剂可以清洗细胞吗？

A5:不推荐染色后清洗细胞。

由于洗涤时的离心操作，有可能影响细胞周期解析的实验结果。

Q6:做流式检测时，应该注意哪些方面呢？

A6：流式检测时，需要在合适的条件下进行测检测。

以下列举了一些失败的案例。

1、检测通道选择不合适

例如一般的细胞周期检测都会使用PI（PE）通道，但是我们试剂盒选择PI通道并不能得到最适结果，请参照一下波段选择最适通道：

2、检测时电压过高（或过低）。

当流式检测时电压过高（或过低）时，都无法得到最适结果。

请通过直方图将G0/G1期、S期、G2/M期调整为清晰的测量电压。

3、细胞数量选择不合适

例如流式检测是圈门选择不恰当，会导致结果不好。

分析时请对选择所有细胞。

C548/Cell Cycle Assay Solution Deep Red试剂

C548/Cell Cycle Assay Solution Deep Red试剂,细胞周期的调控系统与细胞增殖密切相关。一个细胞产生两个子细胞的细胞分裂是细胞周期的一部分。细胞周期可以通过流式细胞术测量细胞DNA染色，然后分析染色细胞核在细胞周期阶段的比例来分析。细胞周期分为两个主要阶段：间期和有丝分裂（M）期。间期由G1期（发生在细胞分裂之前的DNA合成准备）、S期（DNA合成和复制）和G2期（具有重复染色体的单个细胞）组成。M期包括有丝分裂和胞质分裂。

货号：C548
细胞周期检测试剂盒-深红色
Cell Cycle Assay Solution Deep Red
储存条件：0-5 ℃
运输条件：常温

特点：

检测时间短
固定和不固定都可以
悬浮细胞和贴壁细胞都可以

选择规格：50 tests

产品概述

产品特性

产品特点：检测时间短

实验案例

对比实验：准确的判段活细胞的细胞周期

示例：抗癌剂引起的细胞功能的变化

常见问题Q&A

Q1:悬浮细胞和贴壁细胞都可以检测吗？

A1:悬浮细胞和贴壁细胞都可以使用。

Q2:胰酶会影响检测吗？

A2：如果实验中有胰酶残留，会影响检测；

如果回收细胞时使用胰酶，请确保按照方案进行清洁操作，去除残留胰酶。Q3:需要固定细胞吗？

A3:固定和不固定细胞都可以。

Q4:如果需要对要检测的固定细胞进行保存，是应该染色前保存还是染色后保存？

A4：都可以，本公司实际对比案例：

分别在保存固定细胞前后做了染色实验，检测结果没有差异

・将固定细胞冷藏（4℃）后保存1周，根据使用说明书对细胞进行染色。

・根据使用说明书对固定细胞进行染色，将细胞冷藏（4℃）后保存1周。

*冷冻保存细胞的话有可能会沉淀不溶物，所以不推荐冷冻保存。

Q5:用Cell Cycle Assiay Soluton染色后，为了除去过量的试剂可以清洗细胞吗？

A5:不推荐染色后清洗细胞。

由于洗涤时的离心操作，有可能影响细胞周期解析的实验结果。

Q6:做流式检测时，应该注意哪些方面呢？

A6：流式检测时，需要在合适的条件下进行测检测。

以下列举了一些失败的案例。

1、检测通道选择不合适

例如一般的细胞周期检测都会使用PI（PE）通道，但是我们试剂盒选择PI通道并不能得到最适结果，请参照一下波段选择最适通道：

2、检测时电压过高（或过低）。

当流式检测时电压过高（或过低）时，都无法得到最适结果。

请通过直方图将G0/G1期、S期、G2/M期调整为清晰的测量电压。

3、细胞数量选择不合适

例如流式检测是圈门选择不恰当，会导致结果不好。

分析时请对选择所有细胞。

关联产品

细胞周期检测试剂盒-PI/RNase Staining

细胞周期检测试剂盒

C543/PI/RNase Staining-细胞周期检测试剂盒

C543/PI/RNase Staining-细胞周期检测试剂盒, Cell Cycle Assay Kit-PI/RNase Staining试剂盒，可快速完成细胞周期的分析，操作简便。本产品使用碘化丙啶 (PI) 作为DNA荧光染料，通过流式细胞术得到细胞周期中G0/G1，G2和S期细胞的比例。

货号：C543
细胞周期检测试剂盒
Cell Cycle Assay Kit – PI/RNase Staining
储存条件：0-5度保存，避光
运输条件：室温

特点：

日本原装进口试剂盒
固定和不固定都可使用

选择规格：50tests

关联产品TOP5

NO.1. Annexin V, FITC Apoptosis Detection Kit 细胞凋亡检测
NO.2. Cell Counting Kit-8 细胞增殖毒性检测
NO.3. ROS Assay Kit -Highly Sensitive DCFH-DA- ROS检测
NO.4. Cellular Senescence Detection Kit 细胞衰老检测
NO.5. Annexin V, 633 Apoptosis Detection Kit 细胞凋亡检测

试剂盒内含

50 tests

Pl Solution
RNase Solution
Assay Buffer

1.25 ml×1
0.125 ml×
25 mlx

产品概述

DNA含量分析在流式细胞检测中，占有相当大的比例。通过这种方法，研究者可以进行抗癌药物的毒性评估，并对恶性肿瘤细胞的预后效果及进展程度进行分析。在细胞周期检测中，DNA含量也同样作为重要的分析手段而被广泛应用。通过细胞DNA含量的测定，可计算各细胞周期的百分率，也可通过DNA片段化检测、DNA双染标记等方法检测细胞凋亡。

Cell Cycle Assay Kit-PI/RNase Staining试剂盒，可快速完成细胞周期的分析，操作简便。本产品使用碘化丙啶 (PI) 作为DNA荧光染料，通过流式细胞术得到细胞周期中G0/G1，G2和S期细胞的比例。

所需的设备和材料

– 流式细胞仪（碘化丙啶PI:λex=535 nm，λem=617 nm）

– 37℃培养箱

– PBS缓冲液

– 1.5 ml微量管

– 100-1000 μl、20-200 μl、2-20 μl移液器

溶液制备

本产品在固定细胞及不细胞固定的情况下皆可使用。

配置Working solution (1 sample)

取500 μl Assay Buffer 后，分别加入25 μl PI Solution和2.5 μl RNase Solution。

＊工作液易遇光分解，请在使用前立即配置并用铝箔纸包裹避光保存。

配置好的工作液1天内用完。

基本操作

非固定细胞

1. 将细胞密度调整为1-5×106cells/ml a)。

2. 取1 ml的细胞悬液加入到1.5 ml微型管中，在1,000×g离心3 min b)。

3. 去除上清液后加入1 ml PBS缓冲液清洗细胞，在1,000×g离心3 min。

4. 去除上清液后加入0.5 ml Working Solution。

5. 在4℃避光培养30 min。

6. 涡旋振荡使细胞分散，在37℃避光培养30 min。

7. 涡旋振荡使细胞分散，用尼龙筛网过滤，以去除样品中的细胞团块 c)。

8. 用流式细胞仪检测。

a) 贴壁细胞用胰蛋白酶-EDTA消化细胞后，用PBS洗涤并离心收集细胞。

b) 根据不同的细胞种类，需适当调整转速与离心时间。

c) 样品处理后，剩余部分无法继续保存并使用。

固定细胞

1. 将细胞密度调整为1-5×106cells/ml a)。

2. 取1 ml的细胞悬液加入到1.5 ml微型管中，在1,000×g 离心3 min。

3. 去除上清，并在细胞团中加入1 ml的-20℃保存的70%乙醇。

4. 涡旋振荡使细胞分散，在4℃下静置2 h b)。

5. 在1,000×g 离心3 min后，去除乙醇 c)。

6. 加入1 ml PBS缓冲液清洗细胞，在1,000×g 离心3 min。

7. 去除上清液后加入0.5 ml Working Solution。

8. 涡旋振荡使细胞分散，在37℃避光培养30 min。

9. 涡旋振荡使细胞分散，在4℃避光培养30 min。

10. 涡旋振荡使细胞分散，用尼龙筛网过滤，以去除样品中的细胞团块 d)。

11. 用流式细胞仪检测。

a) 贴壁细胞用胰蛋白酶-EDTA消化细胞后，用PBS洗涤并离心收集细胞。

b) 根据不同的细胞种类，需适当调整固定时间。

c) 根据不同的细胞种类，需适当调整转速与离心时间。

d) 样品处理后可以在4℃以下保存并继续使用，但是保存时间长短与细胞种类有关。

常见问题Q&A

Q1、C543用于分散细胞团聚的筛网的品牌、型号信息?
A1:FALCON 5mL Polystyrene Round-Bottom Tube with Cell-Strainer Cap 型号：352235

Q2:实验需要在37度、4度环境中分别培养30min，这个先后顺序对实验结果有影响吗?

A2：从做出的实验结果来看，没有影响。可以自由选择。
Q3:流式管作用是什么?

A3:检测时必须将细胞悬液放入流式管中，流式管的最上方有滤膜，这层滤膜的作用是把细胞打散，使其不团聚，也方便流式仪器吸取细胞的时候更容易)

关联产品

Cell Cycle Assay Solution Blue试剂
细胞周期检测试剂盒-蓝色

C551/Caspase-3 Assay Kit -Colorimetric-试剂盒

Caspase是与细胞凋亡密切相关的重要的一组蛋白酶。其中 Caspase-3是细胞凋亡过程中最主要的终末剪切酶，因此 Caspase-3经常被作为细胞凋亡的标志物来进行检测。同仁化学研发的 Caspase-3 Assay Kit-Colorimetric-是一套操作简单的比色法胞内 Caspase-3活性检测试剂盒。与其他市面上的检测试剂盒相比，由于具有更高的灵敏度，因此可以在更短的培养时间内快速检测。通过比较凋亡组细胞和正常组细胞的 pNA吸光度，即可确定 Caspase-3活性的增加倍率。

货号：C551
Caspase-3检测试剂盒-比色法
Caspase-3 Assay Kit-Colorimetric-
储存条件：0-5度保存，避光
运输条件：室温

特点：

酶标仪检测，操作简单
稳定性好，保存时间长

选择规格：50 tests

关联产品TOP5

NO.1. Cell Counting Kit-8 细胞增殖毒性检测
NO.2. Annexin V, FITC Apoptosis Detection Kit 细胞凋亡检测
NO.3. Cytotoxicity LDH Assay Kit-WST 乳酸脱氢酶(LDH)检测
NO.4. FerroOrange 细胞亚铁离子检测
NO.5. ROS Assay Kit 活性氧检测

产品概述

凋亡相关检测方法

检测原理	凋亡阶段	检测方法	使用装置
细胞膜构造变化	早期/晚期	Annexin V/PI	荧光显微镜、流式细胞仪
线粒体膜电位降低	早期	JC-1	荧光显微镜、流式细胞仪、荧光酶标仪
凋亡关联酶活性	早期~中期	caspase 3	酶标仪
DNA片段化	晚期	DNA染料	流式细胞仪

试剂概要

260 ul
. Substrate ×2
.Lysis Buffer 1
14 ml
.Assay Buffer ×1
.Reconstitution Buffer ×1

操作步骤

Lysis Buffer的配制

向Lysis Buffer瓶中加入 10 ml Reconstitution Buffer后超声波震荡 2 min。（建议使用注射器添加 Reconstitution Buffer。如不使用注射器，请注意瓶内为真空状态，剥除铝制封口和打开橡胶瓶盖时请小心操作。）

Lysis Buffer配制好后需 -20 保存。

配制好的 Lysis Buffer 在 -20 可稳定保存 1 个月。

经测试 Lysis Buffer 反复冻融 8次以内可正常使用。

Assay Buffer的配制

向Assay Buffer瓶中加入 3 ml Reconstitution Buffer后超声波震荡 2 min。（建议使用注射器添加 Reconstitution Buffer。如不使用注射器，请注意瓶内为真空状态，剥除铝制封口和打开橡胶瓶盖时请小心操作。）

Assay Buffer配制好后需 -20 保存。

配制好的 Assay Buffer 在 -20 可稳定保存 1 个月。

经测试， Assay Buffer 反复冻融 8次以内可正常使用。

4。在37C培养箱中培养2h。
*如果检测的吸光度值过低，可适当延长培养时间。(最长可过夜培养)
5、用酶标仪检测405nm处的波长。

实验例

1. 将 Jurkat细胞（ 3.38×106 Cells/ ml）接种到两个 100 mm培养皿中（两个培养皿中分别含

有 0 μmol/ l和 5 μmol/ l Staurosporine的 RPMI培养基并在 5 CO2培养箱中 37 培

养 5小时。

2. 将细胞收集到两个不同的锥形管中并离心（ 300×g 3 min 。

3. 去除上清液后，用 1 ml PBS重悬细胞。

4. 离心（ 300×g 3 min）后去除上清液。

5. 将 Lysis Buffer 200 μl）加入至每个管中。

6. 将两个样品在冰上孵育 15 min。

7. 将两个样品离心（ 10,000×g 1 min）。

8. 将每个样品的上清液转移到新的微管中。

9. 通过 Bradford法定量每个上清液中的蛋白质浓度。

10. 使用 Lysis Buffer将每个样品的蛋白质浓度调节至 1.0mg / ml。

11. 将 Substrate 10 μl Assay Buffer 40 μl）和样品 50 μl）加入至 96孔板中。

12. 37 培养 2 h。

13. 用酶标仪测定 405nm处的吸光度。

常见问题Q&A

Q1:实验结果吸光度低怎么办？

本试剂盒，完全显色时，405 nm检测OD值约为0.5左右。如诱导凋亡后样品的吸光度低于0.1，请确认是否为以下原因。

<原因1>

孵育时间不足。

请延长孵育时间后测定，可过夜培养。

<原因2>

蛋白质量不足。

由于缓冲液中含有DTT，请使用Bradford的方法检测蛋白质含量，并通过增加细胞数量的方法，准备蛋白质浓度为1-3 mg/ml的细胞裂解液，。

<原因3>

Caspase-3活化不足。

Caspase-3激活可能不足。请考虑优化诱导细胞凋亡的条件（药物浓度和治疗时间）。

（阳性对照，可参考使用说明书中的Staurosporine进行诱导。）

Q2:本试剂盒可以检测几个样品？

该试剂盒可检测50 tests。

当复孔以n = 3进行测量时，可以测量15个样品，不包括空白。

Q3:误差很大的原因是什么？

如测量的孔中有气泡，则会增加测量误差。在测量前请确保已去除气泡。

Q4：如何作成标准曲线？

该试剂盒中不包括标准品（p-Nitroaniline）。需要您自行准备，并可按照以下步骤作成校准曲线。

（1）将p-Nitroaniline溶于DMSO中，制备浓度为20 mmol / l的DMSO储存溶液。

（2）用396 µl Lysis Buffer 稀释4 µl p-Nitroaniline DMSO储备液，以制备200 µmol / l的标准品溶液。并将该标准品溶液依次稀释2倍，制备出浓度分别为200、100、50、25、0 µmol / l的标准品溶液。

（3）向每孔中加入10 µl Substrate，40 µl Assay Buffer和50 µl标准溶液。

（4）37°C下孵育2小时。

（5）用酶标仪测量405 nm处的吸光度。

（6）通过试剂中Caspase-3的显色作成p-Nitroaniline含量的标准曲线。

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参考文献

1) S. Zhang, J. Zhou, Q. Fan, X. Lv, T. Wang, F. Wang, Y. Chen, S. Hong, X. Liu, B. Xu, L. Hu, C. Zhang, Y. Zhang, “Discovery of hydroxytyrosol as thioredoxin reductase 1 inhibitor to induce apoptosis and G1/S cell cycle arrest in human colorectal cancer cells via ROS generation”,Exp. Ther. Med., 2021, doi:10.3892/etm.2021.10261.

2) B. Wang, Q. Sun, W. Ye, L. Li and P. Jin, “Long non‑coding RNA CDKN2B‑AS1 enhances LPS‑induced apoptotic and inflammatory damages in human lung epithelial cells via regulating the miR‑140‑5p/TGFBR2/Smad3 signal network”,BMC Pulm. Med., 2021, doi:10.1186/s12890-021-01561-z.

3) Z. Lin, S. Yang, Y. Zhou, Z. Hou, L. Li, M. Meng, C. Ge, B. Zeng, J. Lai, H. Gao, Y. Zhao, Y. Xie, S. He, W. Tang, R. Li, J. Tan, W. Wang., “OLFM4 depletion sensitizes gallbladder cancer cells to cisplatin through the ARL6IP1/caspase-3 axis”,Translational Oncology, 2022, doi:10.1016/j.tranon.2021.101331.

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AD11/Annexin V, 633 Apoptosis Detection Kit-细胞凋亡检测试剂盒,Annexin V染色的细胞可以用于检测细胞凋亡早期的细胞膜变化。在细胞凋亡早期，膜磷脂酰丝氨酸由脂膜内侧翻向外侧。Annexin V是一种分子量为35-36kD的Ca2+依赖性磷脂结合蛋白，与磷脂酰丝氨酸有高度亲和力，可通过细胞外侧暴露的磷脂酰丝氨酸与凋亡早期细胞的胞膜特异性结合，因此Annexin V 被作为检测细胞早期凋亡的灵敏指标之一

货号：AD11
Annexin V, 633/PI凋亡检测试剂盒
Annexin V, 633 Apoptosis Detection Kit
储存条件：0-5度保存，避光
运输条件：室温

特点：

灵敏度&稳定性高
性价比之选。
无需荧光补偿调节

选择规格：50assays,50assays*2

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NO.5. DAPGreen – Autophagy Detection 细胞自噬检测

试剂盒内含

50次
Annexin v，633结合物 ×1
Pl Solution x1
10×Annexin V Binding Buffer x 1
*注:规格中的每“次”是以细胞浓度1×106cells/ml计

产品概述

细胞凋亡是指为维持有机体内环境稳定，由基因控制的细胞自主的有序的死亡。正常情况下任何细胞在形成过程中发生的异常都会通过凋亡消除。例如体内的癌细胞增长为肿瘤的过程会受细胞凋亡的引导而被抑制。然而在抑癌基因p53出现问题时，凋亡就不会诱导发生，从而导致癌细胞的不断增长。细胞凋亡可以通过细胞形态的变化或生物化学的变化来检测。目前常用的指标有caspase活性变化、DNA碎片、磷脂酰丝氨酸的外翻等。

原理

Annexin V染色的细胞可以用于检测细胞凋亡早期的细胞膜变化。在细胞凋亡早期，膜磷脂酰丝氨酸由脂膜内侧翻向外侧。Annexin V是一种分子量为35-36kD的Ca2+依赖性磷脂结合蛋白，与磷脂酰丝氨酸有高度亲和力，可通过细胞外侧暴露的磷脂酰丝氨酸与凋亡早期细胞的胞膜特异性结合，因此Annexin V 被作为检测细胞早期凋亡的灵敏指标之一。用红色荧光633标记的Annexin V通过流式细胞仪或荧光显微镜可以检测到细胞凋亡的发生。碘化丙啶 (Propidium Iodide, PI) 是一种核酸染料，PI只能透过凋亡晚期和死细胞的细胞膜，因此Annexin V和PI结合使用，可以区分凋亡早晚期的细胞及死细胞。

荧光参数

流式细胞仪检测

1. 加样到流式细胞仪检测，

633：激发波长Ex: 633 nm；

发射波长Em: 650-670 nm。

PI：激发波长Ex: 488 nm；

发射波长Em: 564-606 nm。

2. 633的红色荧光通过633通道(FL4)检测;

PI的红色荧光通过PI通道 (FL2或FL3)检测 (建议使用FL3)。

设定对照

1. 未染色细胞。

2. Annexin V, 633染色细胞 (没有PI)。

3. PI染色细胞 (没有Annexin V, 633)。

荧光显微镜检测

将细胞悬液滴到玻片上，置于显微镜上使用合适的滤光片检测。

* 由于EDTA会对细胞膜的特定部位有损伤，建议使用不含EDTA的胰酶消化贴壁细胞

注意事项

1. Annexin V, 633和PI均对光敏感。所有染色过程和培养过程均需避光。

2. 若细胞收集过程中使用胰酶，需设法去除残留的胰酶，这些胰酶会消化并降解Annexin V, 633，最终导致染色失败。

3. 用 APC和PE通道检测基本不用调节荧光补偿，但是如果细胞中还有其它荧光，例如细胞中有GFP，GFP荧光会影响PI通道的信息采集，需要调节荧光补偿。

参考文献

1. Deregulated lncRNA expression profile in the mouse lung adenocarcinomas with KRAS-G12D mutation and P53 knockout,Journal of Cellular and Molecular Medicine, 2019, 00:1-11

2. Curcumin Inhibits Growth of Human NCI-H292 Lung Squamous Cell Carcinoma Cells by Increasing FOXA2 Expression,Front. Pharmacol., 2018, doi: 10.3389/fphar.2018.00060

3. UCP2 ameliorates mitochondrial dysfunction, inflammation, and oxidative stress in lipopolysaccharide-induced acute kidney injury,International Immunopharmacology, 2019, 71, 336-349

4. γ-Glutamyl cyclotransferase contributes to endometrial carcinoma malignant progression and upregulation of PD-L1 expressionduring activation of epithelial-mesenchymal transition,International Immunopharmacology, 2019, 106039, doi:10.1016/j.intimp.2019.106039

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AD10/Annexin V, FITC Apoptosis Detection Kit-细胞凋亡检测试剂盒,Annexin V染色的细胞可以用于检测细胞凋亡早期的细胞膜变化。在细胞凋亡早期，膜磷脂酰丝氨酸由脂膜内侧翻向外侧。Annexin V是一种分子量为35-36kD的Ca2+依赖性磷脂结合蛋白，与磷脂酰丝氨酸有高度亲和力，可通过细胞外侧暴露的磷脂酰丝氨酸与凋亡早期细胞的胞膜特异性结合，因此Annexin V 被作为检测细胞早期凋亡的灵敏指标之一。

货号：AD10
Annexin V-FITC/PI凋亡检测试剂盒
Annexin V, FITC Apoptosis Detection Kit
储存条件：0-5度保存，避光
运输条件：室温

特点：

灵敏度&稳定性高
性价比高
荧光显微镜和流式检测双重方法检测

选择规格：50assays,50assays*2

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NO.2. PI/RNase Staining 细胞周期检测
NO.3. Caspase-3 Assay Kit -Colorimetric 细胞凋亡检测
NO.4. ROS Assay Kit 活性氧检测
NO.5. Calcein-AM/PI细胞双染试剂盒活死细胞双染

试剂盒内含

50次
Annexin V，FITC结合物 ×1
Pl Solution ×1
10×Annexin V Binding Buffer ×1
*注:规格中的每“次”是以细胞浓度1×10cells/ml计

产品概述

原理

Annexin V染色的细胞可以用于检测细胞凋亡早期的细胞膜变化。在细胞凋亡早期，膜磷脂酰丝氨酸由脂膜内侧翻向外侧。Annexin V是一种分子量为35-36kD的Ca2+依赖性磷脂结合蛋白，与磷脂酰丝氨酸有高度亲和力，可通过细胞外侧暴露的磷脂酰丝氨酸与凋亡早期细胞的胞膜特异性结合，因此Annexin V 被作为检测细胞早期凋亡的灵敏指标之一。用绿色荧光FITC标记的Annexin V通过流式细胞仪或荧光显微镜可以检测到细胞凋亡的发生。碘化丙啶 (Propidium Iodide, PI) 是一种核酸染料，PI只能透过凋亡晚期和死细胞的细胞膜，因此Annexin V和PI结合使用，可以区分凋亡早晚期的细胞及死细胞。

荧光参数

-流式细胞仪检测

1. 加样到流式细胞仪检测，激发波长Ex = 488 nm；发射波长Em = 530 nm。

2. Annexin V-FITC的绿色荧光通过FITC通道 (FL1) 检测；PI的红色荧光通过PI 通道 (FL2或FL3) 检测 (建议使用FL3)。

-荧光显微镜检测

将细胞悬液滴到玻片上，置于显微镜上使用合适的滤光片检测。* 由于EDTA会对细胞膜的特定部位有损伤，建议使用不含EDTA的胰酶消化贴壁细胞。

常见问题Q&A

Q1:贴壁细胞凋亡实验是否能够不消化？

A1：不选择消化的原因是什么？
=>主要是担心胰酶对细胞膜损伤而影响结果判断。

贴壁细胞在检测凋亡之前，如果没有出现团聚的情况，那么是可以尝试不消化直接镜检。理由是基于Annexin V- FITC与细胞反应的一个机理，凋亡早期的膜磷脂酰丝氨酸由膜内外翻，与Annexin V特异性结合，那么FITC标记的Annexin V呈现一个绿色荧光，所以我们保证足够的细胞膜暴露在工作液中，那即使没有经过胰酶消化，最终也是能够用荧光显微镜观察凋亡的情况。

不消化有几点好的地方：

1.避免一个对细胞膜的损伤，那结果能够很好的反应促凋亡的结果

2.操作简便，避免消化以及清洗过程中出现的操作失误

不消化有几点担心的地方：

1.无法制成细胞悬液，染色可能出现不充分

2.可能无法观察凋亡晚期PI和FITC双染的细胞

Q2:目前用Tunel的检测试剂盒做凋亡实验。和Tunel比较，用Annexin V-FITC的优点是什么？

A2: TUNEL这种方法灵敏度很高，但是特异性比较低，只能标记出凋亡中期和凋亡晚期的细胞，而且细胞坏死也会发生DNA断裂，不能算是真正的凋亡细胞，造成假阳性的现象。
建议老师两种方法都进行，以Tunel方法为主，Annexin V的方法为辅，这样两种方法都进行，互相也可以验证结果是否准确，互作参考。

参考文献

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Cell Metabolism, 2019, 30, 1-13

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Treatment of Hepatocellular Carcinoma, Advanced Science, 2017, 4(4), 1600460

3. Biogenic (R)-(+)-Lipoic Acid Only Constructed Cross-LinkedVesicles with Synergistic Anticancer Potency，

Advanced Functional Materials, 2018, 1806567

4. Anti-mitotic chemotherapeutics promote apoptosis through TL1A-activated death receptor 3 in cancer cells,

Cell Research, 2018, 28, 544-555

5. Bacteria-Driven Hypoxia Targeting for Combined Biotherapy and Photothermal Therapy, ACS Nano, 2018, 12(6), 5995-6005

6. Nanoenzyme-Augmented Cancer Sonodynamic Therapy by Catalytic Tumor Oxygenation, ACS Nano, 2018, 12, 3780-3795

7. Tumor-Specific Multiple Stimuli-Activated Dendrimeric Nanoassemblies with Metabolic Blockade Surmount Chemotherapy

Resistance, ACS Nano, 2017, 11(1), 416-429

8. Near Infrared-Guided Smart Nanocarriers for MicroRNA-Controlled Release of Doxorubicin/siRNA with Intracellular ATP as Fuel,

ACS Nano, 2016, 10(3), 3637-47

9. Noninvasive small-animal imaging of galectin-1 upregulation for predicting tumor resistance to radiotherapy,

Biomaterials, 2018, 158, 1-9

10. Cytotoxicity of guanine-based degradation products contributes to the antiproliferative activity of guanine-rich oligonucleotides,Chemical Science, 2015, 6, 3834-3836

11. A Novel Strategy through Combining iRGD Peptide with Tumor-icroenvironment-Responsive and Multistage Nanoparticles

for Deep Tumor Penetration, ACS Appl.Mater.Interfaces, 2015, 7(49), 27458-27466

12. JOSD1 inhibits mitochondrial apoptotic signalling to drive acquired chemoresistance in gynaecological cancer by stabilizing MCL1,Cell Death & Differentiation, 2020, 27, 55-70

13. The influence of printing parameters on cell survival rate and printability in microextrusion-based 3D cell printing technology,Biofabrication, 2015, 7(4), 045002

14. Downregulation of MCL-1 and upregulation of PUMA using mTOR inhibitors enhance antitumor efficacy of BH3 mimetics in triple-negative breast cancer, Cell Death & Disease, 2018, 9, 137

15. Mutations in the P10 region of procaspase-8 lead to chemotherapy resistance in acute myeloid leukemia by impairing procaspase-8 dimerization, Cell Death & Disease, 2018, 9(5), 516

16. Preclinical evaluation of antitumor of the proteasome inhibitor MLN2238 (ixazomib) in hepatocellular carcinoma cells,Cell Death & Disease, 2018, 9, 28

17. Long Noncoding RNA HCAL Facilitates the Growth and Metastasis of Hepatocellular Carcinoma by Acting as a ceRNA of LAPTM4B,Molecular Therapy: Nucleic Acids, 2017, 9, 440-451

18. TMEM74 promotes tumor cell survival by inducing autophagy via interactions with ATG16L1 and ATG9A,Cell Death & Disease, 2017, 8, e3031-3045

19. Nogo-C regulates cardiomyocyte apoptosis during mouse myocardial infarction, Cell Death & Disease, 2016, 7, e2432

20. TonEBP modulates the protective effect of taurine in ischemia-induced cytotoxicity in cardiomyocytes,Cell Death & Disease, 2015, 6, e2025

CK17/Viability/Cytotoxicity Multiplex Assay Kit-细胞活性/毒性双重检测试剂盒

CK17/Viability/Cytotoxicity Multiplex Assay Kit-细胞活性/毒性双重检测试剂盒,细胞毒性检测通常通过检测活细胞数量或者死细胞数量来确定。而为了更加全面的评价细胞毒性情况，多种评价方法相互验证的需求与日俱增。Viability/CytotoxicityMultiplex Assay Kit可以综合评价细胞毒性。试剂盒内含Cell Counting Kit-8 (CCK-8) 和Cytotoxicity LDH Assay Kit-WST® (LDH Assay Kit)，分别用于测定活细胞和死细胞数量。

货号：CK17
细胞活性/毒性双重检测试剂盒
Viability/Cytotoxicity Multiplex Assay Kit
储存条件：0-5度保存
运输条件：室温

特点：

1. CCK-8与LDH双指标检测毒性，数据更全面。
2. 准备1次细胞，同时检测2项数据。
3. 内含500T的CCK-8与LDH检测试剂盒，
4. 价格优于单独购买。

选择规格：500 tests

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NO.5. Caspase-3 Assay Kit-Colorimetric- 细胞凋亡检测

试剂盒内含

500 tests Dye Mixture 5mlX1
[500 tests]
.WST-8,1-Methoxy PMS混合液

Cytotoxicity LDH Assay Kit-WST
[500 tests]
.Dye Mixture X1
.Assay Buffer 15.5mlX1
.Lysis Buffer 155mlX1
.Stop Solutin 27.5mlX1

产品概述

细胞毒性检测通常通过检测活细胞数量或者死细胞数量来确定。而为了更加全面的评价细胞毒性情况，多种评价方法相互验证的需求与日俱增。Viability/CytotoxicityMultiplex Assay Kit可以综合评价细胞毒性。试剂盒内含Cell Counting Kit-8 (CCK-8) 和Cytotoxicity LDH Assay Kit-WST^®(LDH Assay Kit)，分别用于测定活细胞和死细胞数量。

CCK-8通过检测活细胞中脱氢酶活性来确定活细胞数，而LDH Assay Kit通过检测受损细胞膜释放LDH的量来确定死细胞数。LDH Assay Kit可以直接添加到含有细胞的培养基中检测 (一步法)。也可以分离细胞后，加到细胞培养基上清液中检测 (低损伤法，分离的细胞可以做其它实验)。两种细胞毒性评价指标，CCK-8和LDH Assay Kit(低损伤法) 可以使用同一批细胞同时进行实验。

产品特点

不同细胞毒性指标，双重印证。增加结果可信性。

单独检测CCK-8，细胞毒性判断不准确

1、单纯检测活细胞数量（CCK-8、MTT、MTS、XTT等）

2种指标一起检测，增加数据准确性

1、单纯检测活细胞数量（CCK-8、MTT、MTS、XTT等）
2、活细胞检测+死细胞检测（细胞膜损伤）

检测原理

LDH Assay Kit：细胞膜损伤，LDH外漏，通过检测LDH活性判断细胞毒性。

CCK-8：可以使用NADH作为指标来确认活细胞中的代谢活性。

同时检测的操作方法

本试剂盒包括用于测量活细胞的CCK-8和用于测量死细胞的LDH分析试剂盒，两者均可通过平板分析法在相同的吸收波长下进行评估。此外，同一细胞样本可用于同时评估活细胞和死细胞，从而节省了时间和精力。

性价比高

本产品作为CCK-8（500 tests）与Cytotoxicity LDH Assay Kit（500 tests）组合套装，低于单独购买的总价。适合新接触细胞毒性检测的用户，用于前期摸索实验条件。单独产品链接见下方。大包装购买，单价会降低很多。

Cell Counting Kit-8

Cytotoxicity LDH Assay Kit-WST

参考文献

1. Integrated Omics Reveals Tollip as an Regulator and Therapeutic Target for Hepatic Ischemia-Reperfusion Injury in Mice,

Hepatology., 2019, doi: 10.1002/hep.30705

2. Amplified Cancer Immunotherapy of Surface Engineering Antigenic Microparticles Vaccine by Synergistically Modulating Tumor

Microenvironment, ACS Nano, 2019, 13, 11, 12553-12566

3. A novel IFNα-induced long noncoding RNA negatively regulates immunosuppression by interrupting H3K27 acetylation in head

and neck squamous cell carcinoma, Molecular Cancer, 2020,19, 4, doi: 10.1186/s12943-019-1123-y

4. Untangling the co-effects of oriented nanotopography and sustained anticoagulation in a biomimetic intima on neovessel

remodeling, Biomaterials, 2019, 119654

5. In Vitro and in Vivo Analysis of Mineralized Collagen-Based Sponges Prepared by a Plasma- and Precursor-Assisted

Biomimetic Process, ACS Applied Materials & Interfaces, 2017, 9, 27, 22185-22194

6. MoS2-LA-PEI nanocomposite carrier for real-time imaging of ATP metabolism in glioma stem cells co-cultured with

endothelial cells on a microfluidic system, Biosensors and Bioelectronics, 2018, 99, 142-149

7. Biocompatible carbon nanotube fiber for implantable supercapacitors, Carbon, 2017, 122, 162-167

8. Genomic sequencing and editing revealed the GRM8 signaling pathway as potential therapeutic targets of squamous cell

lung cancer, Cancer Letters, 2019, 442, 53-67

9. Knockdown of TGF-β1 expression in human umbilical cord mesenchymal stem cells reverts their exosome-mediated EMT

promoting effect on lung cancer cells, Cancer Letters, 2018, 428:34-44

10. Restriction of exogenous DNA expression by SAMHD1, Science Bulletin, 2020, https://doi.org/10.1016/j.scib.2019.12.028

11. PARP1 inhibition alleviates injury in ARH3-deficient mice and human cells, JCI Insight, 2019, 4(4), e124519

12. Downregulation of MCL-1 and upregulation of PUMA using mTOR inhibitors enhance antitumor efficacy of BH3 mimetics in

triple-negative breast cancer, Cell Death & Disease, 2018, 9(2), 137

13. Ischemic preconditioning attenuates ischemia/reperfusion-induced kidney injury by activating autophagy via the SGK1

signaling pathway, Cell Death & Disease, 2018, 9, 338

14. Pathological Endogenous a-Synuclein Accumulation in Oligodendrocyte Precursor Cells Potentially Induces Inclusions in

Multiple System Atrophy, Stem Cell Reports, 2018, 10(2), 356-365

15. PDH-mediated metabolic flow is critical for skeletal muscle stem cell differentiation and myotube formation during regeneration

in mice, FASEB Journal, 2019, 33(7), 8094-8109

16. Benzo[a]pyrene-decreased gap junctional intercellular communication via calcium/calmodulin signaling increases apoptosis in

TM4 cells, Journal of Applied Toxicology, 2018, 38(8), 1091-1103

Stop Solution for CCK-8试剂

Stop Solution for CCK-8试剂,CCK-8反应终止液,必要时使用，可使CCK-8数据保持最多7天不变。

货号：CK13
CCK-8反应终止液
Stop Solution for CCK-8
储存条件：0-5度保存
运输条件：室温

特点：

CCK-8专用终止液。
必要时使用，可使CCK-8数据保持最多7天不变。

选择规格：500 tests

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细胞增殖-毒性检测试剂盒CCK-8(CCK8)

Cell Count Normalization Kit试剂盒

Cell Count Normalization Kit试剂盒,货号：C544,本试剂盒包含细胞核染色试剂（Hoechst 33342）和优化微孔板法的专用缓冲液，只需添加到细胞培养基中即可轻松测得细胞数量。

货号：C544
细胞计数标准化试剂盒
Cell Count Normalization Kit
储存条件：0-5度保存，避光
运输条件：室温

特点：

荧光强度与细胞（核）呈正相关，线性好。
作为细胞数量的二次校正，用于计算各种指标在细胞中的平均值。

选择规格：200tests,1000tests

试剂盒内含

200 tests	-Staining Solution ·Dilution Buffer ·Quenching Buffer	50 uL×1 10 mL×4 10 mL×2
1000 tests	-Staining Solution ·Dilution Buffer ·Quenching Buffer	250 uL×1 100 mL×2 100 mL×1

产品概述

本试剂盒包含细胞核染色试剂（Hoechst 33342）和优化微孔板法的专用缓冲液，只需添加到细胞培养基中即可轻松测得细胞数量。

原理

细胞计数校正的必要性

使用微孔板分析细胞时。细心的实验者会发现：每次获得的结果可能会有所不同，这是因为因为孔板中实际的细胞数量会有所不同。

在这种情况下，有必要根据样品中细胞的实际数量来校正测量值（达到归一化）。

主流方法比较

作为吸光度实验校正的方法，细胞计数检测的指标（细胞核、蛋白质的质量）有很多，

在这之中细胞核染色作为最简便的操作方法，并可以实验多样本同时检测。

	本试剂盒（细胞核染色法）	细胞计数法	蛋白定量法
操作简便性	○	×	△
对应多种样品处理	○	×	△
可检测活细胞	○	○	×
细胞裂解后检测	×	×	○
和实际细胞数的一致性	△*1	○	△*2

※1 : 细胞核数量改变的话，可能会有和实际数目不一致的情况。
※2 : 蛋白质的量改变的话，可能会有和实际数目不一致的情况。

与细胞数量的关联性

在微孔法测定实验中，需要进行数据校正时，必须使用与细胞数相对应的评估方法。在下面的实验中，证实了荧光强度与细胞数一致性，并且作为实验例，证实了方法的可靠性。

荧光强度与细胞数的一致性比较

荧光强度根据细胞数而变化，并且获得高度线性的结果。

梯度稀释HeLa细胞，接种于96孔板上，培养过夜，然后用该试剂盒进行测量。

与细胞计数方法的比较

实验过程中，校正产生的结果与细胞计数方法。

HeLa细胞中添加2-DG（2-脱氧葡萄糖）后培养24小时，使用乳酸检测试剂盒Lactate Assay Kit-WST（货号：L256）测量培养基上清液中乳酸的含量。

然后分别使用本试剂盒或细胞计数法对获得的结果进行校正。

关联产品

Cell Counting Kit-8细胞增殖毒性检测试剂盒CCK-8(CCK8)
细胞增殖-毒性检测试剂盒CCK-8(CCK8)

Stop Solution for CCK-8试剂
CCK-8反应终止液

Cell Counting Kit-8细胞增殖毒性检测试剂盒CCK-8(CCK8)

Cell Counting Kit-8细胞增殖毒性检测试剂盒CCK-8(CCK8),Cell Counting Kit-8是用于化学药物等对细胞增殖或毒性实验时进行细胞计数的试剂盒。试剂盒中使用高灵敏度的新型水溶性四唑盐WST-8甲臜染料作为显色底物，与传统的细胞计数试剂盒相比，灵敏度大幅度的提高。

货号：CK04
细胞增殖-毒性检测试剂盒CCK-8(CCK8)
Cell Counting Kit-8
储存条件：0-5度保存
运输条件：室温

特点：

CCK-8为本司DOJINDO最早研发
高分文献超10000+篇
试剂盒稳定性高。
试剂可以与酚红同时使用。

选择规格：100 tests,500 tests,1000 tests,3000 tests,10000 tests

性能简介

Cell Counting Kit-8是用于化学药物等对细胞增殖或毒性实验时进行细胞计数的试剂盒。试剂盒中使用高灵敏度的新型水溶性四唑盐WST-8甲臜染料作为显色底物，与传统的细胞计数试剂盒相比，灵敏度大幅度的提高。WST-8被细胞内的脱氢酶还原产生水溶性的甲臜染料。通过直接测量甲臜染料（450 nm）的吸光度，即可测出活细胞的数量。细胞数量与甲臜染料成正比关系。同时试剂盒为配置好的1瓶溶液，易于使用。

产品特点

1）对比[3H]法，无需放射性同位素。

2）使用水溶性四唑盐与水溶性甲臜染料，因此无需DMSO换液操作步骤。（如MTT分析等需要）

3）与其他水溶性四唑盐法（XTT，MTS）相比，灵敏度更高的同时毒性更低。

4）试剂盒为1瓶装，无需提前配置，无需准备其他试剂。

5）试剂盒稳定性高。

6）试剂可以与酚红同时使用。

原理

Cell Counting Kit-8 (CCK-8) 包含了Dojindo开发的水溶性四唑盐—WST®-8和电子载体(1-Methoxy PMS)。由于WST®-8具有高水溶性，它存在于细胞外而不渗透活细胞膜，通过1-Methoxy PMS接受乳酸脱氢酶的辅酶NADH的电子而被还原，生成水溶性WST®-8甲臜染料（最大吸收波长450nm：详见下方吸收光谱）。

产品概述

Cell Counting Kit-8 (CCK-8) 利用了Dojindo开发的水溶性四唑盐—WST®-8 (2- (2-甲氧基-4-硝苯基) -3- (4-硝苯基) -5- (2,4-二磺基苯) -2H-四唑单钠盐)，它在电子载体1-Methoxy PMS存在的情况下能够被还原成水溶性的橙黄色甲臜。 CCK-8溶液可以直接加入到细胞样品中，无需配制。CCK-8法是用于测定细胞增殖或毒性实验中活细胞数目的一种高灵敏度，无放射性的比色检测法。WST®-8被细胞内脱氢酶氧化还原后生成的橙黄色甲臜能够溶解在培养基中，生成的甲臜物的数量与活细胞数量成正比。

操作步骤

本试剂盒测定方法简单，只需一瓶试剂即可操作，无需二次配制工作液，从而提高实验者的效率。

CCK-8使用例

细胞增殖实验(左)与细胞毒性实验(右)

CCK-8与LDH

Cell Counting Kit-8 与Cytotoxicity LDH Assay Kit-WST同时检测细胞毒性

检测药物： Mitomycin C
细胞: HeLa
培养基: MEM, 10% FBS
孵育条件: 37℃, 5% CO2, 48小时
检测波长: Cell Counting Kit-8 (450 nm), Cytotoxicity LDH Assay Kit-WST® (490 nm)

使用Mitomycin C 检测检测HeLa细胞毒性。通过使用Cell Counting Kit-8和Cytotoxicity LDH Assay Kit-WST® [货号: CK12]两种方法检测。Cell Counting Kit-8以细胞活性为指标，Cytotoxicity LDH Assay Kit-WST以游离的LDH为指标，实验证实两种指标检测存在差异性。二者联用，能更全面的表征细胞毒性。

WST®-8甲臜染料

WST®-8甲臜染料吸光度与续细胞数量的关系

培养基: MEM, 10%FBS(HeLa ) , RPM1640(HL60)

孵育条件:37℃, 5%CO2, 2hr (HeLa、HL60)

检测试剂:Cell Counting Kit-8

(●) 450 nm, XTT (◆) 450 nm, MTS

(▲) 490 nm, MTT(■) 570 nm

将HeLa细胞和HL60细胞以不同的细胞数接种到96孔板中，按孵育条件处理后加入以上每种试剂测定吸光度。根据细胞数量增加吸光度。CCK-8灵敏度、线性范围优于以上其他方法。

试剂稳定性比较

Cell Counting Kit-8可冷藏保存1年以上，避免试剂浪费！

试剂毒性评价

试剂本身对细胞毒性的比较

HeLa细胞在96孔板中孵育(5000个/孔)。在CO2培养箱中开始显色反应，每隔3、6、24小时在显微镜下观察细胞形态。Cell Counting Kit-8在24小时后细胞形态没有改变。在使用药物进行细胞毒性试验时，应选择测量试剂本身对细胞毒性影响更小的试剂。

3D培养检测

3D培养检测细胞毒性指南，

详见OECD Guidelines for the Testing of Chemicals, Section 4 Test No. 492

常见问题Q&A

Q1：96孔板操作实例外，24孔板，12孔板如何检测？

A1：与培养基1:10的比例加入。

Q2：如何测定空白孔？

A2：空白读值的来源有两部分，还原性物质与细胞本身活性。请确认以下细节。

·还原性物质：可在正式实验之前，在培养基中加入CCK-8和待测药物。如果变色，证明药物有还原性。正式实验检测时，请在加入CCK-8前更换培养基。

·细胞活性变化：CCK-8检测细胞活性，因此细胞活性变化，即使细胞数量不变，空白也会变化。因此需要确认细胞活性是否存在变化。

Q3：如何终止反应？

A3：有一下几种方法（96孔板）：

1、在显色反应后，将培养板放置4℃冰箱内。

2、每孔加10 μl 0.1 M HCL溶液。

3、每孔加10 μl 1%（w/v）的SDS（十二烷基硫酸钠）溶液。

注意：反应停止后，应在24小时之内测定。

4、使用本公司Stop Solution for CCK-8(货号:CK13).

Q4：我可以使用450 nm以外的滤光片吗？

A4：可使用430-490nm的滤光片，450nm滤光片最优。WST-8甲臜染料吸收光谱：

Q5：CCK-8运输与保存条件？

A5：试剂在4℃下可稳定保存24个月。如需长期存放可保存-20℃，但不要反复冻融。如更换其他容器，请先进行稳定性实验，确认试剂稳定性。

Q6：一个孔中应接种多少个细胞？

A6：当使用标准96孔板时，贴壁细胞的最小接种量至少为1,000 个/孔 (100 μl 培养基)。检测白细胞时的灵敏度相对较低，因此推荐接种量不低于2,500 个/孔 (100 μl 培养基)。如果要使用24孔板或6孔板实验，请先计算每孔相应的接种量，并按照每孔培养基总体积的10%加入CCK-8溶液。

Q7：能否用384孔板进行试验？

A7：可以。向各孔中加入培养基体积10%的CCK-8溶液，如果加入的CCK-8体积太少，可以先将CCK-8溶液稀释1倍，然后加入培养基体积20%的量

Q8：能否用24孔板进行试验？

A8：可以。向各孔中加入培养基体积10%的CCK-8溶液。

Q9：酚红会影响检测吗？

A9：不会。培养基中酚红的吸光度可以在计算时，通过扣除空白孔中本底的吸光度而消去，因此不会对检测造成影响。

Q10：CCK-8与胸苷结合检测之间是否有相关性？

A10：有。然而，请注意由于CCK-8使用的检测原理与胸苷检测的不同，因此结果可能不同。

Q11：CCK-8能否检测细菌细胞？

A11：可以检测E.coli，但不能检测酵母细胞。向100 μl E.coli培养液中加入10 μl CCK-8溶液，并培养1-4个小时或过夜。但是更推荐使用我公司货号M439的：细菌活性检测试剂盒。

Q12：如何减少由于CCK-8试剂在枪头上或孔壁上的残留所带来的误差？

A12：可以在加样前用培养基稀释CCK-8试剂并混匀后加样。

Q13：CCK-8是什么颜色？

A13：应该是粉红色。若颜色不一样，有可能会影响测定。

Q14：CCK-8能否对活细胞进行染色？

A14：不能。因为CCK-8的主要成分是一种水溶性的四唑盐 (WST®-8)，并通过电子载体1-Methoxy PMS将活细胞中的电子交换到培养基中的WST®-8上。由于生成的甲臜也是高度水溶性的，因此CCK-8不能对细胞进行染色。

Q15：CCK-8检测溶液对细胞是否有毒？

A15：CCK-8溶液自身因为高浓度的1-Methoxy PMS的存在而具有一点毒性。但是，加到培养基中的CCK-8是没有毒性的，因为被稀释了10倍。因此，长时间的培养，如过夜或者培养数天是可以的。同一个细胞培养液在CCK-8检测后还可以用于其他细胞增殖检测，如结晶紫检测，中性红检测或者DNA荧光检测等。由于每种细胞对于CCK-8的耐受力都不同，因此在需要进行长时间培养时，先检测一下细胞在加入CCK-8培养后的活力。

Q16：在做加药实验时，药物对测定是否有影响？如何解决？

A16：有时会有影响。如果药物具有还原性，会和CCK-8发生显色反应，增加吸光度。解决办法：首先要确认药物是否有吸收，在含有药物的培养基中加入CCK-8，测定450 nm的吸光度，如果它的吸光度比不含药物的培养基 (加CCK-8)的吸光度高，则证明药物有影响，可在加CCK-8之前更换培养基，去掉药物的影响。

Q17：每次测定的数值不一样，是什么原因？如何解决？

A17：可能会有以下几个原因： 1. 当在培养箱内培养时，培养板最外一圈的孔最容易干燥挥发，由于体积不准确而增加误差。一般情况下，最外一圈的孔只加培养基，不作为测定孔用。 2. 有可能会因为CCK8沾在壁上而产生误差，建议在加入CCK-8后，轻轻敲击培养板以帮助混匀。 3. 每孔的细胞数量过多或过少。请预先在1,000-100,000个/孔范围内摸索条件。

Q18：如何设定空白对照？

A18：在不含细胞的培养基中加入CCK-8，培养一定的时间，测定450 nm的吸光度即为空白对照。在做加药实验(细胞毒性实验)时，还应考虑药物的吸收，可在不含细胞，加入药物的培养基中加入CCK-8，培养一定的时间，测定450 nm的吸光度作为空白对照。

Q19：哪些物质会影响CCK-8的测定？

A19：当有还原性物质存在时会影响CCK-8的测定，例如含有维生素C的Glucose等 (一般培养基中的量不多，酚红或血清不影响测定)。在有酚红存在的情况下，会增加空白吸收，但不影响测定，扣除空白吸收即可。

Q20：在实验中吸光度值太高，如果不能减少细胞数量，如何解决？

A20：可以缩短加入CCK-8后的培养时间。例如：可以把加入CCK-8试剂后的培养时间由2小时缩短为1小时。

Q21：设定参比波长的目的是什么？必须设定吗？

A21：不一定要设定。CCK-8试剂在参比波长没有吸光度。设定参比波长的目的是为了取出由于样品混浊所带来的吸收。

Q22：说明书上仅写了96孔板的测定方法，如果使用24孔板货12孔板，应该加多少量的CCK-8试剂？

A22：一般情况下建议加入CCK-8试剂的量是培养基体积的1/10。

Q23：必须预培养细胞吗？

A23：不一定。如果要向保持细胞的最好状态，建议预培养细胞。如果不做细胞预培养，细胞内的脱氢酶可能会不稳定。也有人不做细胞预培养，但在做标准曲线和检测时需要统一检测条件。

Q24：如果加入的药物中含有金属，是否会有影响？

A24：金属对CCK-8显色有影响。当终浓度为1 Mm的氯化亚铅、氯化铁、硫酸铜会抑制5%、15%、90%的显色反应，使灵敏度降级。如果终浓度是10 Mm的话，将会100%抑制。

Q25：预培养后，更换培养基需要细胞计数吗？

A25：一般情况下用胰蛋白酶处理对数增长期的细胞，用血球计数盘计数，制备成一定浓度的细胞悬液即可。如果想要精密计数细胞的话，可以预培养后取培养基用血球计数盘进行计数。

Q26：CCK-8对于不同的细胞，灵敏度是否一样？

A26：不一样，悬浮细胞与贴壁细胞相比较难染色。对于贴壁细胞，一般加入CCK-8培养1-4小时吸光度已经很高，但对于悬浮细胞则可能吸光度较低，可以通过延长CCK-8的加入时间或增加细胞数量来解决。

Q27：悬浮细胞和贴壁细胞在数量上有何区别？

A27：悬浮细胞由于显色比较困难，一般需要增加细胞数量和延长培养时间。贴壁细胞显色比较容易，若细胞数量过大，有时吸光度会超过酶标仪的读数。

Q28：应该每次做标准曲线吗？

A28：建议每次做。虽然细胞是一样的，但是细胞的状态不一定一样，对于状态不一样的细胞，建议每次做标准曲线。如果试剂的批号不一样，灵敏度可能会有轻微的差异，对于不同的批号建议分别做标准曲线。

Q29：有时在药物作用情况下，细胞已经死亡，但是脱氢酶的活性还在，是否能计算细胞数量？

A29：不能。由于CCK-8是通过和细胞内的脱氢酶进行反应间接反映活细胞数量

参考文献

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Epigenetic therapy inhibits metastases by disrupting premetastatic niches.Nature,2020,doi.org/10.1038/s41586-020-2054-x

2.Chimeric peptidomimetic antibiotics against Gram-negative bacteria，Nature,2019,doi:10.1038/s41586-019-1665-6

PU.1 controls fibroblast polarization and tissue fibrosis.Nature,2019,566,344–349

3.Mitochondrial unfolded protein response controls matrix pre-RNA processing and translation,Nature,2016,534,710-713

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6.The sonic hedgehog factor GLI1 imparts drug resistance through inducible glucuronidation.Nature,2014,511(7507),90-93

7.The sonic hedgehog factor GLI1 imparts drug resistance through inducible glucuronidation.Nature,2014,511(7507),90-93

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10.Embryonic lethal phenotype reveals a function of TDG in maintaining epigenetic stability.Nature,2011,470(7334),419-423

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12.Frequent inactivation of A20 in B-cell lymphomas.Nature,2009,459(7247),712-716

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14.Oncogenic mutations of ALK kinase in neuroblastoma.Nature,2008,455(7215),971-4

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22.Fusobacterium nucleatum Promotes Chemoresistance to Colorectal Cancer by Modulating Autophagy

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23.Methyltransferase SETD2-Mediated Methylation of STAT1 Is Critical for Interferon Antiviral Activity

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24.Loss of 5-Hydroxymethylcytosine Is an Epigenetic Hallmark of Melanoma.Cell,2012,150(6),1135-1146

25.Mapping the Hallmarks of Lung Adenocarcinoma with Massively Parallel Sequencing.Cell,2012,150(6),1107-1120

26.Iron-Export Ferroxidase Activity of β-Amyloid Precursor Protein Is Inhibited by Zinc in Alzheimers D….Cell,2010,142(6),857-867

27.Autocrine VEGF Signaling Is Required for Vascular Homeostasis.Cell,2007,130(4),691-703

28.Genetic risk of extranodal natural killer T-cell lymphoma: a genome-wide association study in multipl…

Lancet Oncology,2019,pii: S1470-2045(19)30799-5

29.Precise targeting of?POLR2A?as a therapeutic strategy for human triple negative breast cancer.Nature Nanotechnology,2019,14 , 388–397

30.Metal nanoparticles in the presence of lipopolysaccharides trigger the onset of metal allergy in mice…

Nature Nanotechnology,2016,11,808–816

31.Chemical modification of PS-ASO therapeutics reduces cellular protein-binding and improves the therap…

Nature Biotechnology,2019,37640–650

32.Multi-omic measurements of heterogeneity in HeLa cells across laboratories

Nature Biotechnology,2019,37,314–322

33.Dual effects of carbon monoxide on pericytes and neurogenesis in traumatic brain injury.

Nature Medicine,2016,22,1335–1341

34.Orphan nuclear receptor NR4A1 regulates transforming growth factor-β signaling and fibrosis.Nature Medicine,2015,21(2),150–158

35.Randomized dose-finding clinical trial of oncolytic immunotherapeutic vaccinia JX-594 in liver cancer….Nature Medicine, 2013,19,329–336

36.Compromised CDK1 activity sensitizes BRCA-proficient cancers to PARP inhibition.Nature Medicine, 2011, 17(7), 875-882

37.Mesenchymal stem cell–based tissue regeneration is governed by recipient T lymphocytes via IFN-γ an….Nature Medicine, 2011,17(12), 1594-1601

38.Monoclonal antibody targeting of N-cadherin inhibits prostate cancer growth, metastasis and castratio….Nature Medicine, 2010, 16(12), 1414-1420

39.Identification of tendon stem/progenitor cells and the role of the extracellular matrix in their nich….Nature Medicine, 2007, 13(10), 1219-1227

CK12/Cytotoxicity LDH Assay Kit-WST-LDH检测试剂盒

LDH检测试剂盒—Cytotoxicity LDH Assay Kit-WST,Cytotoxicity LDH Assay Kit-WST,Cytotoxicity LDH Assay Kit-WST®是通过测定细胞释放到培养基中的乳酸脱氢酶 (LDH) 活性进而测定细胞损害的试剂盒。LDH是存在于细胞质的一种酶，当细胞膜受到损伤时，LDH会释放到培养基中。由于释放出的LDH稳定，检测培养基中LDH量可以作为测定死细胞和受损细胞数量的指标。

货号：CK12
乳酸脱氢酶(LDH)检测试剂盒
Cytotoxicity LDH Assay Kit-WST
储存条件：0-5度保存，避光
运输条件：室温

特点：

不与细胞内LDH反应，可直接检测（一步法）或取上清液检测（低损伤法）。
更适合Car-T、ADCC、CDC等效靶杀伤实验。
Working Solution配制后，可稳定保存6个月以上。
试剂盒稳定性高，数据重复性好。
搭配CCK-8检测，细胞毒性双指标认证。

选择规格：100 tests,500 tests,2000 tests

关联产品:

NO.1. Cell Counting Kit-8 细胞增殖毒性检测

NO.2. Annexin V, FITC Apoptosis Detection Kit 细胞凋亡检测

NO.3. Caspase-3 Assay Kit -Colorimetric 细胞凋亡检测

NO.4. Biotin Labeling Kit – NH2 生物素抗体标记-氨基

NO.5. Cell Counting Kit-Luminescence 细胞增殖/毒性检测

试剂盒内含

100 tests	Dye Mixture ·Assay Buffer -Lysis Buffer Stop Solution	×1 11 ml×1 1.1 ml×1 5.5 ml×1
500 tests	· Dye Mixture -Assay Buffer -Lysis Buffer -Stop Solution	x1 55ml×1 5.5 ml×1 27.5 ml×1
2000 tests	-Dye Mixture ·Assay Buffer Lysis Buffer -Stop Solution	x4 55ml×4 5.5 ml×4 27.5 ml×4

产品概述

Cytotoxicity LDH Assay Kit-WST®是通过测定细胞释放到培养基中的乳酸脱氢酶 (LDH) 活性进而测定细胞损害的试剂盒。LDH是存在于细胞质的一种酶，当细胞膜受到损伤时，LDH会释放到培养基中。由于释放出的LDH稳定，检测培养基中LDH量可以作为测定死细胞和受损细胞数量的指标。本试剂盒可以测定受损细胞所释放出的LDH，其原理是LDH催化乳酸生成丙酮酸和NADH，NADH通过电子载体可将水溶性四唑盐WST® (无色) 还原成甲臜产物 (橙色)， WST®甲臜产物的吸光度与LDH量呈正比，利用此原理可以测定死细胞和受损细胞的数量。

本试剂盒中试剂不会和活细胞反应，而且对细胞无损害，可以直接添加到含有细胞的培养基中检测 (一步法)。也可以分离细胞后，加到培养基中检测 (低损伤法，分离的细胞可以做其他实验)。本试剂盒采用稳定性高的WST®，配制后的溶液可以长时间保存，不需要现配现用，适用于高通量筛选。

原理

Cytotoxicity LDH Assay Kit-WST®是通过测定细胞释放到培养基中的乳酸脱氢酶(LDH)活性进而测定细胞损害的试剂盒。LDH（乳酸脱氢酶）是存在于细胞质的一种酶，当细胞膜受到损伤时，LDH 会释放到培养基中。由于释放出的LDH 稳定，检测培养基中LDH 的量可以作为测定死细胞和受损细胞数量的指标。

本试剂盒可以测定受损细胞所释放出的LDH，其原理是LDH 催化乳酸生成丙酮酸和NADH，NADH 通过电子载体可将水溶性四唑盐WST®（无色）还原成甲臜产物（橙色），WST®甲臜产物的吸光度与LDH 的量呈正比，利用此原理可以测定死细胞和受损细胞的数量。

本试剂盒中试剂不会和活细胞反应，而且对细胞无损害，可以直接添加到含有细胞的培养基中检测（一步法）。也可以分离细胞后，加到培养基中检测（低损伤法，分离的细胞可以做其他实验）。本试剂盒采用稳定性高的WST®，配置后的溶液可以长时间保存6个月，不需要现配现用，适用于高通量筛选。

产品特点

-双重选择：有2种检测方法（一步法、低损伤法）

-操作简单：不需要分离死细胞和活细胞，就可检测死细胞的LDH ＊一步法

-仪器常用：采用常规酶标仪检测

-稳定方便：Working Solution可冷藏保存6个月，不需要现配现用

-双重验证：配合使用CCK-8可获得死细胞和活细胞的结果

操作示意图

本试剂盒不与细胞内的LDH反应，因此可选择两种检测方法。

1、一步法，直接添加的培养基中检测（左）

2、低损伤法，取上清液检测（右）

工作液稳定性

配制后的工作液，可冷藏保存6个月，无需现配现用

CCK-8与LDH

Cell Counting Kit-8 与Cytotoxicity LDH Assay Kit-WST®同时检测细胞毒性

检测药物： Mitomycin C
细胞: HeLa
培养基: MEM, 10% FBS
孵育条件: 37℃, 5% CO2, 48小时
检测波长: Cell Counting Kit-8 (450 nm), Cytotoxicity LDH Assay Kit-WST® (490 nm)

使用Mitomycin C 检测检测HeLa细胞毒性。通过使用Cell Counting Kit-8和Cytotoxicity LDH Assay Kit-WST [货号: CK12]两种方法检测。Cell Counting Kit-8以细胞活性为指标，Cytotoxicity LDH Assay Kit-WST以游离的LDH为指标，实验证实两种指标检测存在差异性。二者联用，能更全面的表征细胞毒性。

本文为LDH法检测细胞毒性的相关研究介绍。

实验例

RAJI细胞CDC实验

实验证实：吸光度O.D.值与抗体浓度成正相关，因此确认CD20抗体与细胞结合而激活细胞损伤

抗癌药阿霉素（DOX）的细胞毒性机制

近年来，与抗氧化剂能力相关的指标（NADP + / NADPH，GSSG / GSH等）与细胞毒性评估一起被测量的案例越来越多。

在本文中，我们将以DOX为例，其中抗氧化能力的下降与细胞毒性的增加有关。

常见问题Q&A

Q1：可以使用490 nm以外的滤光片吗？

A1：可以使用450 nm滤光片，吸光度会高于490 nm。

Q2：细胞毒性检测时，Cytotoxicity LDH Assay Kit-WST和Cell Counting Kit-8法结果一致吗？

A2：二者测定的原理和指标不同，建议同时检测。可更好说明问题。

Cell Counting Kit-8：检测细胞活性

Q3：LD50差异性过大，如何处理？

A3：细胞状态不同，对药物的耐受性也会有很大变化，最终影响LD50的数值。请尽可能使用相同条件下处理、相同代数的细胞。在准备药物稀释液时，可降低稀释梯度倍数，从而得到更准确的LD50。

Q4：这个试剂盒能检测LDH的酶活吗？

A4：本产品通过LDH活性检测细胞毒性，不能检测如：LDH1, LDH2, LDH3的活性。

Q5：LDH本身的稳定性如何？

A5：文献报道，培养基中LDH活性的1天内降低＜5%（文献1），也可冷藏1周左右（文献2）。具体可因实验条件不同存在差异。

文献1：

A. Wagner, A. Marc, JM. Engasser, A. Einsele, “The use of lactate dehydrogenase (LDH) release kinetics for the evaluation of death and growth of mammalian cells in perfusion reactors.”, Biotechnol Bioeng. 1992; 39, (3), :320..

文献2：

M. Allen, P. Millett, E. Dawes, N. Rushton., “Lactate dehydrogenase activity as a rapid and sensitive test for the quantification of cell numbers in vitro.”, Clin Mater. 1994; 16, (4), 189.

Q6：Cytotoxicity LDH Assay Kit-WST带LDH标准品吗？

A6：因为是检测细胞毒性使用，不带标准品。

Q7：试剂盒中的Stop solution添加后需立即检测吗？

A7：Stop solution添加后可避光保存3小时。

Q8：显色背景过高，有什么原因？

A8：考虑以下原因。

培养基中血清中的乳酸脱氢酶升高了背景。请用此培养基配制小于5%的血清或血清培养基。

如果培养基中含有待测物质具有强还原性，会与WST®显色。因此可预实验时单独检测判断。

（一般情况下，培养基如DMEM、RPMI、F-12，通常不含还原性物质

参考文献

1.Antitumor Effect by Hydroxyapatite Nanospheres: Activation of Mitochondria-Dependent Apoptosis and Ne…

ACS Nano,2018,12(8)7838-7854

2.Magnetic Nano-Clusters Armed with Responsive PD-1 Antibody

3.Synergistically Improved Adoptive T C….ACS Nano,2019, 13(2)1469-1478

4.Layer by layer cell coating technique using extracellular matrix facilitates rapid fabrication and fu….Biomaterials,2018,160,82-91

5.Oxidative stress–dependent phosphorylation activates ZNRF1 to induce neuronal/axonal degeneration

J.Cell Biol.，2015,211(4)881-896

6.Protein carbamylation exacerbates vascular calcification.Kidney International ,2018,94(1),72-90

7.In vitro cellular behaviors and toxicity assays of small-sized fluorescent silicon nanoparticles.Nanoscale,2017, 9(22),7602-7611

8.Pathological Endogenous a-Synuclein Accumulation in Oligodendrocyte Precursor Cells Potentially Induc…

Stem Cell Reports,2018,10(2),356-365

9.Biocompatible carbon nanotube fiber for implantable supercapacitors.Carbon,2017,122,162-167

10.Lower Expression of MicroRNA-155 Contributes to Dysfunction of Natural Killer Cells in Patients with ….Frontiers in Immunology，2017,8,1173

11.Melatonin Mediates Protective Effects against Kainic Acid-Induced Neuronal Death through Safeguarding….Frontiers in Immunology,2017,10,49

ChIP-酶解法试剂盒

如果您是第一次做ChIP，或者您是做转录因子或者辅因子的，强烈建议您选择酶解法试剂盒，原因如下：酶解法操作简便，每个IP只需要加入试剂盒中的0.5ul的微球菌核酸酶，37℃作用20分钟即可可重复性强，且样品间酶处理效率差异小

Chromatin immunoprecipitation，中文称作染色质免疫共沉淀，是研究DNA和蛋白质相互作用的一种实验方法，并且是目前公认的最佳选择。
如果您是第一次做ChIP，或者您是做转录因子或者辅因子的，强烈建议您选择酶解法试剂盒，原因如下：
酶解法操作简便，每个IP只需要加入试剂盒中的0.5ul的微球菌核酸酶，37℃作用20分钟即可
可重复性强，且样品间酶处理效率差异小
对染色质结构和蛋白-DNA作用破坏小，可以最大程度保证染色质完整性
另外，如果您下游需要采用全基因组测序方法进行检测，请一定要选择磁珠产品（因琼脂糖微珠工艺制作原因，表面有细微小孔，需要使用鲑鱼精子进行封闭，这样相当于引入了异源DNA，会影响下游的测序结果）：
SimpleChIP® Enzymatic Chromatin IP Kit (Magnetic Beads) #9003
SimpleChIP® Plus Enzymatic Chromatin IP Kit (Magnetic Beads) #9005
如果下游只是做简单的定量PCR，可选择琼脂糖珠产品：
SimpleChIP® Enzymatic Chromatin IP Kit (Agarose Beads) #9002
SimpleChIP® Plus Enzymatic Chromatin IP Kit (Agarose Beads) #9004
Plus版更可应用于组织和细胞双重样本，普通版只可应用于细胞样本。
如果您使用过超声法进行ChIP实验，实验条件步骤摸索的很好并且您有很好的超声破碎仪，强烈推荐您选择：
SimpleChIP® Plus Sonication Chromatin IP Kit #56383
特制的低去污剂配方，减少抗原表位丢失，最大程度保护染色质完整性。磁珠配Plus，差一点就完美了！
一点：所有磁珠试剂盒（9003/9005/56383）需额外搭配磁力架，旨在IP之后分离DNA和蛋白质，6孔和12孔磁力架如下：
6-Tube Magnetic Separation Rack #7017
12-Tube Magnetic Separation Rack #14654

IP级别抗体能不能用来做ChIP实验？

ChIP级别抗体能不能用来做ChIP-seq实验?

ChIP级别的抗体都是经过实际实验验证过，可以用于ChIP实验。CST更有ChIP-Seq级别的抗体，是经过ChIP下游测序验证可用的，他们的区别在于：

ChIP级抗体 / IP级抗体

与DNA结合后构象变化
固定后染色质不同表位遮蔽
不同结合缓冲体系

ChIP-seq级抗体 / ChIP级抗体

全基因组不同表位遮蔽
抗体在全基因组上的结合强度高
全基因组水平上非特异结合低

目前CST有超过300种ChIP级别的抗体和100多种ChIP-Seq级别的抗体可供您选择，并且都是单克隆抗体，信噪比较好！

如果我得到的DNA量很低，只有1ng，如何建立一个优质的DNA文库？

ChIP之后得到的DNA，如果您已知这个DNA的基因序列，可进行qPCR进行定量检测；如果您是研究细胞或组织中基因组中的特定蛋白－DNA间相互作用或者研究多个未知基因，就需要进行二代测序，测序前需要建立DNA文库，文库的质量决定测序的质量！
CST可提供高质量DNA文库构建的建库试剂盒，最低起始DNA量为0.5ng
SimpleChIP® ChIP-seq DNA Library Prep Kit for Illumina® #56795
搭配单端或者双端引物接头试剂盒，即可完成一个优质的DNA文库构建！
SimpleChIP® ChIP-seq Multiplex Oligos for Illumina®(Single Index Primers) #29580
SimpleChIP® ChIP-seq Multiplex Oligos for Illumina®(Dual Index Primers) #47538

做ChIP实验还有好多小问题呀，怎么解决呢？

1．片段化的染色质浓度过低。	染色质制备时所用的细胞或组织不足或蛔隗/组坦裂解不充分。	如果制备的染色质样品的DN浓度接近于50ugml.则每个P样品中需额外添加染色质，达到至少5ugP的水平.然后继续操作流程. 在交联前对单独的细胞板计数以测定准确的细照数目- 酶处理:在超声处理前后在显微镜下观察细胞核以确认细胞核的完全裂解。
2染色质片段化不足或片段过大。染色质片段较大会导致本底增加和分朗率降低-	蛔胞可能交联过度和/或使用了过多的染色质样本(细随/组织-	缩短交联时间至10-30分钟内和/或减少每次超声处理的蠕胞l组织数量。酶处理:向染色质消化物增加微球菌核酸酶的量或进行一项优化酶消化剂量的预实验。超声处理:进行一项超声处理时间梯度的预实验
染色质片瞪化过度。染色质消化为单糯小体长度的DNA可能在PCR定量期间使信号消失，尤其对于扩增长度在 150 bp以上的序列。过度超声处理染色质可能破坏染色质的完整性井令抗体表位变性.	酶处理:在消化中添加的缑胞不足或微球菌核酸酯过多。超声处理:条件过于苛刻。	酶处理:在交联前对组织称重或对单独的细胞极计数以测定准确的细胞数目。在染色质消化中添加更多组织或细胞,或更少微球菌核酸酯。超声处理:对超声时间及间隔进行优化,以找出可实现适当超声处理的最少输出/持续时间.
4Input PCR反应中没有产物威产物极少。	添加到PCH反应的DA不足或条件不是最优条件。	在PCH反应中添加更多DN4或增加扩增循环次数使用来自交联和片段化的染色质的纯化DNA.优化实验引物组的PC条件。
	PCR扩增区域可能跨越无核小体的区域。	设计另外一个引物组并将扩增片段的长度减少至150 tp以下.
	添加到IP的染色质不足或染色质片段化过度	为获得最佳的ChP结果,每次IP添加5至10冈的染色质。参见上述问题1和3 的建议。
5。阳性对照Histone H3-IP RPL30 PCR反应中无产物。	添加至P反应的染色质或抗体不足，或者P癖育时间过短。	确保在每个P反应中添加5至10闪的染色质和1⑩0的抗体并用抗体孵育一夜.然后在添加蛋白G微珠后再孵育2小时。
5。阳性对照Histone H3-IP RPL30 PCR反应中无产物。	蛋白G教珠中的染色质未完全洗脱。	在65°下.从蛋白G微珠中洗涤染色质是最优的.应频繁混合以保持微珠悬浮在洛液中。
用性对照 Rabbit Normal lgG-IP与阳性对丽Histone H-IP PCR反应中产物的数量相等。	IP反血中添加的染色质过多或不足。或者. IP反应中添加的抗体过多	在每个IP反应中应添加不多于15的染色质和10的 HistoneH3抗体。将每个P中的 Rabot Norma lgG含量减少至1.
用性对照 Rabbit Normal lgG-IP与阳性对丽Histone H-IP PCR反应中产物的数量相等。	PCR反应中添加的D4过多或扩增循还过多。	在PCH反应中添加更少DNA或减少PCR循环次数。为了精确定量.在PCR的线性扩增阶段内分析PCR产物为笑健因素-
7．实验抗体IPPCR反应中无产物.	PCH反应中添加的DWA不足。	在PCHR反应中添加更多DN4或增加扩增循环次数
	IP反应中添加的抗体不足。	通常.在IP反应中添加1至5闻范围的抗体:但是.准确使用量极大地取决于所使用抗体。增加P中添加的抗体含量
	抗体不适用于P.	选择可替代的ChP验证级抗体。

ChIP相关产品

货号	产品名称	应用
56383S	SimpleChIPR Plus Sonication Chromatin IP Kit(超声法，磁珠)	ChlP ChIP-seq
9005s	SimpleChIPR plus Enzymatic Chromatin IP Kit (Magnetic Beads)(酶解法，磁珠)	ChIP ChIP-seq
9004s	SimpleChIPR plus Enzymatic Chromatin IP Kit(Agarose Beads)(酶解法，琼脂糖微珠)	ChIP
9003s	SimpleChIPR Enzymatic Chromatin lP Kit(Magnetic Beads)(第解法，磁珠)	ChIP ChIlP-seq
9o02s	SimpleChIPR Enzymatic Chromatin IP Kit(Agarose Beads)(酶解法，琼胳糖微珠)	ChIP
56795s	SimpleChlPR ChIP-seq DNA Library Prep Kit for IlluminaR(DNA文库构建)	ChlP-seq

货号	产品名称	规格	反应种属	应用
9733T	Tri-Methyl-Histone H3 (Lys27)(C36B11) Rabbit mAb	20 ul	HMR Mk ()(Z)	wWIHC-P IF-ICF ChIP ChlP-seq
9751T	Tri-Methyl-Histone H3 (Lys4)(C42D8) Rabbit mAb	20 ul	HMRMk Dm Sc (Z)	WlHC-P IF-ICF ChIP ChlP-seq
9649T	Acetyl-Histone H3(Lys9)(C5B11)Rabbit mAb	20 ul	HMRMk Z(Sc)	WIP IHC-P IF-ICF ChIP ChlP-seq
8173T	Acetyl-Histone H3(Lys27)(D5E4)XPR Rabbit mAb	20 ul	HMRMk (Hm)( (Z)(GP)(Hr)	WIF-ICF ChIP ChIP-seq
5246T	Ezh2(D2C9)xPR Rabbit mAb	20 ul	HMRMk	WIP lHC-P IF-F IF-ICF ChIP ChlP-seq
3724T	HA-Tag(C29F4)Rabbit mAb	20ul	All	WIP HC-P IF-ICF ChIP
12698T	His-Tag (D3110)XPR Rabbit mAb	20ul	All	WIP IF-ICF ChIP
8242T	NF-kappa-B p65(D14E12)XPR Rabbit mAb	20ul	HMRHm Mk Dg	WIP IHC-P IF-ICF ChIP ChlP-seq
9145T	Phospho-Stat3 (Tyr705)(D3A7)XPR Rabbit mAb	20ul	HMRMk	ELISA W IP IHC-P IHC-F IF-ICF ChlP ChIP-seq
8480T	beta-Catenin(D10A8)XPR Rabbit mAb	20ul	HMRMk	WIP IHC-P IHC-F IF-F IF-ICF ChIP ChlP-seq
8685T	Smad2/3 (D7G7)XPRRabbit mAb	20ul	HMRMk	W IP IF-ICF ChIP ChIP-seq
14074T	YAP(D8H1x)XPR Rabbit mAb	20ul	HMRHm Mk	WIP 1HC-P IF-ICF ChIP ChlP-seq

ENZO新品ENZ-KIT175，CYTO-ID自噬试剂盒2.0

CYTO-ID® Autophagy Detection Kit 2.0 使用新型染料检测自噬小泡和监控活细胞自噬流，选择性标记积累的自噬小泡。染料已通过优化，不染溶酶体，在自噬前体、自噬体和自噬溶酶体里呈现出明亮的荧光。该试剂盒提供了一种无需细胞转染，可以在活细胞中监控细胞自噬的快速定量方法

CYTO-ID^® Autophagy Detection Kit 2.0 使用新型染料检测自噬小泡和监控活细胞自噬流，选择性标记积累的自噬小泡。染料已通过优化，不染溶酶体，在自噬前体、自噬体和自噬溶酶体里呈现出明亮的荧光。该试剂盒提供了一种无需细胞转染，可以在活细胞中监控细胞自噬的快速定量方法。

自噬（Autophagy）是调节真核细胞生长、死亡和能量代谢的重要生物学机制。细胞自噬行使其生物学功能的前提是自噬流（Autophagic Flux）的活化。大量证据表明自噬流受损与多种慢性炎性疾病，特别是肿瘤、神经退行性疾病及组织纤维化的发病密切相关，目前对于自噬流的检测是自噬与其相关疾病研究领域的热点。

什么才是活细胞自噬分析金标准呢？

作为专业的生命科学医药原料供应商，上海金畔生物科技有限公司为您推荐Enzo Life Sciences（Enzo）荣誉出品，Nature/Cell海量引用，升级款- CYTO-ID Autophagy detection kit 2.0

特点

更明亮，更耐光，特异性染色自噬小泡
无需转染及转染效率验证
快速量化原生异质性细胞群中的自噬
不染溶酶体，减少其他染料的背景干扰
便于高通量筛选自噬激活剂和抑制剂

原理

该产品所用探针是阳离子两亲性示踪剂（CAT）染料，以类似诱导磷脂药物的方式迅速进入到细胞中。染料的功能基团能够选择性标记与自噬通路相关的小泡，而不会在溶酶体中聚集。胞内物质被扩大的膜囊包裹，吞噬泡形成双层膜囊泡，成为自噬体。自噬体外膜随后与溶酶体融合，和内部物质被自噬性溶酶体降解。

应用

CYTO-ID自噬检测试剂盒 2.0- 替代品-用量说明：以ENZ-KIT175-0200为例，流式分析（200次）；荧光显微镜（250次）；96孔板（3*96well）

ENZ-KIT175-0050	CYTO-ID Autophagy detection kit 2.0	50 tests
ENZ-KIT175-0200	CYTO-ID Autophagy detection kit 2.0	200 tests

升级款

ENZ-51031-0050	CYTO-ID Autophagy detection kit	50 tests
ENZ-51031-K200	CYTO-ID Autophagy detection kit	200 tests

老款

CYTO-ID自噬检测试剂盒 2.0 —相关产品

产品编号	产品名称	包装	备注	应用
ENZ-51002-25	GFP-Certified Apoptosis/ Necrosis detection kit 细胞凋亡/坏死检测试剂盒	25 assays	多重检测，区分正常、早期凋亡、晚期凋亡和坏死细胞，与GFP和其他绿色荧光探针兼容。	FC，荧光显微镜，荧光检测
ENZ-51002-100	100 assays
ENz-51021-K200	Nuclear-IDGreen hromatin condensation detection kit 细胞核绿色染色体皱缩检测试剂盒	1 Kit	高渗透性的绿色荧光染色增强了细胞凋亡诱导染色质固缩。	FC，荧光显微镜，荧光检测
ENZ-52406	NUCLEAR-IDRed DNA stain DNA染色试剂盒(红色荧光)	200 uL	， -ooorra ion – 细胞可渗透的DNA染色查版权容
ENZ-CHM103-0200	Nuclear-IDBlue DNA stain (GFP-CertifiedR) Nuclear ID蓝色DNA染色 (GFP细胞系)	200 uL	细胞可渗透的DNA染色应用广泛。	≥93%(HPLC), FC，荧光检测
ENZ-51015-KPO02	Lyso-IDRedcytotoxicity kit (GFP-CertifiedR) 溶酶体细胞寿理检测试剂盒 (红色荧光)(绿色细胞系)	1 Kit	快速，定量和HTS-兼容的检测活细胞毒性试剂。	荧光显微镜，荧光检测
ENZ-51035-0025	ProteostatR Aggresome etection kit 蛋白内稳态聚集体检测试剂盒	25 tests	Robust、定量的聚集小体用于神经退行性疾病，肝病和毒理学研究。	FC，荧光显微镜，荧光检测
ENZ-51035-K100	100 tests

Lumiprobe 活性荧光染料分类简介

Near infrared (NIR) imaging, BDP 558/568, AF568, Cyanine3.5, Microscopy, sulfo-Cyanine3.5, Protein labeling, AF488, NHS esters, Cyanine7, sulfo-Cyanine7, sulfo-Cyanine7.5, Cyanine5, Cross linking reagents, AF594, BDP 581/591, BDP 650/665, FAM (Fluorescein), BDP 576/589, BDP FL, BDP TMR, BDP 630/650, sulfo-Cyanine5, Cyanine7.5, ROX (Rhodamine X, Rhodamine 101), TAMRA (TMR, tetramethylrhodamine), AF430, BDP TR, BDP 564/570, Fluorescence polarization, Cyanine5.5, BDP R6G, sulfo-Cyanine3, Cyanine3, Pyrene, sulfo-Cyanine5.5, Coumarin 343

Lumiprobe Corporation是美国一家高品质生物技术公司，专业提供分子生物学研究用的活性荧光染料。从2006年起，公司开始生产并销售生命科学研究和诊断学应用的优质化学药品。主要产品有：活性染料（ReactiveDye）和SYBRGreen I染料，定制合成荧光双标记引物。产品主要应用：点击化学（CLickChemistry）、蛋白质组学研究中的双向荧光差异凝胶电泳（2DDIGE）和实时荧光定量PCR（ReaLtimePCR）。Lumiprobe是通过ISO 9001认证的生命科学应用标准和定制试剂制造商。

荧光染料又称为荧光探针, 因具备检测速度快、重复性好、用样量少、无辐射等优点，成为大家广泛使用的荧光标示剂。同时也是细胞生物学等科学研究中不可或缺的重要工具，利用荧光探针可测定RNA和DNA的结构、研究DNA碱基损伤修复、辨别蛋白质分子中氨基的状态和蛋白质分子的活性区, 检测pmol级的蛋白质 ,区分不同构象的核酸以及有关药物的化学反应活性。荧光免疫分析采用时间-分辨技术可用于许多蛋白质、激素、病毒抗原及DNA杂交体的分析。激光诱导荧光光谱在活细胞、活体体液、DNA碱基序列和细菌原体的鉴定、恶性肿瘤的早期诊断和治疗中起到了重要的作用。

由于大多数荧光染料不具备选择性，被固载在生物活性载体的荧光染料，可利用生物活性物质之间的选择性（抗原抗体，生物素链霉亲和素），或者通过染料分子用适当的修饰官能团，通过官能团之间的相互反应，实现对目标物质的靶向性标记，下面我们就来给大家介绍常见的几类活性荧光染料：

活性荧光素及其衍生物广泛用于共价标记生物分子，例如抗体，碳水化合物，核酸，蛋白质，肽和寡核苷酸。各活化官能团对应的反应基团如下：

名称	用途
琥珀酰亚胺酯（Succinimidyl esters）/ NHS酯	Near infrared (NIR) imaging, BDP 558/568, AF568, Cyanine3.5, Microscopy, sulfo-Cyanine3.5, Protein labeling, AF488, NHS esters, Cyanine7, sulfo-Cyanine7, sulfo-Cyanine7.5, Cyanine5, Cross linking reagents, AF594, BDP 581/591, BDP 650/665, FAM (Fluorescein), BDP 576/589, BDP FL, BDP TMR, BDP 630/650, sulfo-Cyanine5, Cyanine7.5, ROX (Rhodamine X, Rhodamine 101), TAMRA (TMR, tetramethylrhodamine), AF430, BDP TR, BDP 564/570, Fluorescence polarization, Cyanine5.5, BDP R6G, sulfo-Cyanine3, Cyanine3, Pyrene, sulfo-Cyanine5.5, Coumarin 343 荧光染料 NHS 酯是具有活化酯基的胺活性染料。
马来酰亚胺（Maleimides）	Near infrared (NIR) imaging, BDP 558/568, Microscopy, Cyanine7, sulfo-Cyanine7, sulfo-Cyanine7.5, Cyanine5, BDP 581/591, BDP 650/665, FAM (Fluorescein), BDP FL, BDP TMR, Maleimides, BDP 630/650, sulfo-Cyanine5, Cyanine7.5, ROX (Rhodamine X, Rhodamine 101), TAMRA (TMR, tetramethylrhodamine), AF430, BDP TR, Fluorescence polarization, Cyanine5.5, BDP R6G, sulfo-Cyanine3, Cyanine3, Pyrene, sulfo-Cyanine5.5 染料马来酰亚胺是硫醇反应性荧光染料，用于标记蛋白质中的巯基（硫醇）基团。
叠氮化物(Azides)	Near infrared (NIR) imaging, BDP 558/568, AF568, Phenylethynyl-pyrene (PEP), Cyanine3.5, Microscopy, sulfo-Cyanine3.5, AF488, Cyanine7, sulfo-Cyanine7, sulfo-Cyanine7.5, Cyanine5, HEX (Hexachlorofluorescein), BDP 581/591, BDP 650/665, FAM (Fluorescein), BDP FL, BDP TMR, BDP 630/650, sulfo-Cyanine5, Click chemistry, Cyanine7.5, Perylene, ROX (Rhodamine X, Rhodamine 101), TAMRA (TMR, tetramethylrhodamine), Azides, AF430, JOE, BDP TR, R6G, Fluorescence polarization, Cyanine5.5, BDP R6G, sulfo-Cyanine3, Cyanine3, Pyrene, sulfo-Cyanine5.5, Coumarin 343 用于点击化学标记的荧光染料叠氮化物。
炔烃(Alkynes)	Near infrared (NIR) imaging, BDP 558/568, AF568, Microscopy, sulfo-Cyanine3.5, Cyanine7, sulfo-Cyanine7, sulfo-Cyanine7.5, Cyanine5, BDP 581/591, BDP 650/665, FAM (Fluorescein), BDP FL, Alkynes, BDP TMR, BDP 630/650, sulfo-Cyanine5, Cyanine7.5, Perylene, ROX (Rhodamine X, Rhodamine 101), TAMRA (TMR, tetramethylrhodamine), AF430, BDP TR, R6G, Fluorescence polarization, Cyanine5.5, BDP R6G, sulfo-Cyanine3, Cyanine3, Pyrene, sulfo-Cyanine5.5 用于铜催化点击化学的荧光染料炔烃。含有末端炔基。
酰肼(Hydrazides)	Near infrared (NIR) imaging, BDP 558/568, Microscopy, Cyanine7, Cyanine5, BDP 581/591, FAM (Fluorescein), BDP FL, BDP 630/650, Cyanine7.5, TAMRA (TMR, tetramethylrhodamine), Hydrazides, BDP TR, Fluorescence polarization, Cyanine5.5, BDP R6G, sulfo-Cyanine3, Cyanine3, Pyrene 染料酰肼是用于标记醛和酮的羰基反应性荧光染料。
羧酸(Carboxylic acids)	Near infrared (NIR) imaging, BDP 558/568, Cyanine3.5, Microscopy, sulfo-Cyanine3.5, Cyanine7, sulfo-Cyanine7, sulfo-Cyanine7.5, Cyanine5, BDP 581/591, BDP FL, BDP TMR, BDP 630/650, sulfo-Cyanine5, Cyanine7.5, Carboxylic acids, AF430, BDP TR, BDP 564/570, Fluorescence polarization, Cyanine5.5, BDP R6G, sulfo-Cyanine3, Cyanine3, Pyrene, sulfo-Cyanine5.5, Coumarin 343 荧光染料的羧酸衍生物。可用于在碳二亚胺预活化后标记胺，也可用于醇的 Steglich 酯化。
氨基(Amines)	Near infrared (NIR) imaging, BDP 558/568, Microscopy, Cyanine7, sulfo-Cyanine7, Cyanine5, BDP 581/591, Amines, FAM (Fluorescein), BDP FL, BDP TMR, BDP 630/650, sulfo-Cyanine5, Cyanine7.5, TAMRA (TMR, tetramethylrhodamine), AF430, BDP TR, Fluorescence polarization, Cyanine5.5, BDP R6G, sulfo-Cyanine3, Cyanine3, sulfo-Cyanine5.5 具有游离氨基的荧光染料，用于与各种亲电化合物如活化酯和环氧化物偶联。
四嗪（Tetrazines）	Near infrared (NIR) imaging, BDP 558/568, Microscopy, Cyanine7, sulfo-Cyanine7, Copper free Click chemistry, Tetrazine, Cyanine5, BDP 581/591, FAM (Fluorescein), BDP 576/589, BDP FL, BDP TMR, BDP 630/650, sulfo-Cyanine5, Cyanine7.5, AF430, BDP TR, Cyanine5.5, BDP R6G, sulfo-Cyanine3, Cyanine3, PEG3 (triethylene glycol) 四嗪是通过反向电子需求[4+2]-环加成反应与反式环辛烯、环丙烯和其他活化烯烃反应的衍生物——无铜点击化学反应的一个例子。
亚磷酰胺(Phosphoramidite)	Oligonucleotide synthesis, Cyanine5, TET, HEX (Hexachlorofluorescein), Amines, PEG6 (hexaethylene glycol), FAM (Fluorescein), Alkynes, Phosphoramidite, TAMRA (TMR, tetramethylrhodamine), JOE, R6G, Cyanine5.5, Cyanine3, Pyrene, SIMA 用于固相自动化寡核苷酸合成的亚磷酰胺（亚酰胺）改性剂。荧光亚磷酰胺，用于点击化学 DNA 修饰的亚酰胺。
环炔(Cycloalkyne)	BDP 558/568, Cyanine3.5, Cyanine7, Copper free Click chemistry, Cyanine5, BDP 581/591, BDP 650/665, FAM (Fluorescein), BDP FL, BDP TMR, sulfo-Cyanine5, Cycloalkyne, ROX (Rhodamine X, Rhodamine 101), BDP TR, Cyanine5.5, BDP R6G, sulfo-Cyanine3, Cyanine3, sulfo-Cyanine5.5 用于无铜点击化学的具有环炔烃部分的染料。

1．片段化的染色质浓度过低。	染色质制备时所用的细胞或组织不足或蛔隗/组坦裂解不充分。	如果制备的染色质样品的DN浓度接近于50ugml.则每个P样品中需额外添加染色质，达到至少5ugP的水平.然后继续操作流程. 在交联前对单独的细胞板计数以测定准确的细照数目- 酶处理:在超声处理前后在显微镜下观察细胞核以确认细胞核的完全裂解。
2染色质片段化不足或片段过大。染色质片段较大会导致本底增加和分朗率降低-	蛔胞可能交联过度和/或使用了过多的染色质样本(细随/组织-	缩短交联时间至10-30分钟内和/或减少每次超声处理的蠕胞l组织数量。酶处理:向染色质消化物增加微球菌核酸酶的量或进行一项优化酶消化剂量的预实验。超声处理:进行一项超声处理时间梯度的预实验
染色质片瞪化过度。染色质消化为单糯小体长度的DNA可能在PCR定量期间使信号消失，尤其对于扩增长度在 150 bp以上的序列。过度超声处理染色质可能破坏染色质的完整性井令抗体表位变性.	酶处理:在消化中添加的缑胞不足或微球菌核酸酯过多。超声处理:条件过于苛刻。	酶处理:在交联前对组织称重或对单独的细胞极计数以测定准确的细胞数目。在染色质消化中添加更多组织或细胞,或更少微球菌核酸酯。超声处理:对超声时间及间隔进行优化,以找出可实现适当超声处理的最少输出/持续时间.
4Input PCR反应中没有产物威产物极少。	添加到PCH反应的DA不足或条件不是最优条件。	在PCH反应中添加更多DN4或增加扩增循环次数使用来自交联和片段化的染色质的纯化DNA.优化实验引物组的PC条件。
	PCR扩增区域可能跨越无核小体的区域。	设计另外一个引物组并将扩增片段的长度减少至150 tp以下.
	添加到IP的染色质不足或染色质片段化过度	为获得最佳的ChP结果,每次IP添加5至10冈的染色质。参见上述问题1和3 的建议。
5。阳性对照Histone H3-IP RPL30 PCR反应中无产物。	添加至P反应的染色质或抗体不足，或者P癖育时间过短。	确保在每个P反应中添加5至10闪的染色质和1⑩0的抗体并用抗体孵育一夜.然后在添加蛋白G微珠后再孵育2小时。
5。阳性对照Histone H3-IP RPL30 PCR反应中无产物。	蛋白G教珠中的染色质未完全洗脱。	在65°下.从蛋白G微珠中洗涤染色质是最优的.应频繁混合以保持微珠悬浮在洛液中。
用性对照 Rabbit Normal lgG-IP与阳性对丽Histone H-IP PCR反应中产物的数量相等。	IP反血中添加的染色质过多或不足。或者. IP反应中添加的抗体过多	在每个IP反应中应添加不多于15的染色质和10的 HistoneH3抗体。将每个P中的 Rabot Norma lgG含量减少至1.
用性对照 Rabbit Normal lgG-IP与阳性对丽Histone H-IP PCR反应中产物的数量相等。	PCR反应中添加的D4过多或扩增循还过多。	在PCH反应中添加更少DNA或减少PCR循环次数。为了精确定量.在PCR的线性扩增阶段内分析PCR产物为笑健因素-
7．实验抗体IPPCR反应中无产物.	PCH反应中添加的DWA不足。	在PCHR反应中添加更多DN4或增加扩增循环次数
	IP反应中添加的抗体不足。	通常.在IP反应中添加1至5闻范围的抗体:但是.准确使用量极大地取决于所使用抗体。增加P中添加的抗体含量
	抗体不适用于P.	选择可替代的ChP验证级抗体。

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试剂盒内含 1 set .Anti yH2AX antibody x1 . Secondary antibody -Green ×1 .Blocking Solution 22 ml×1

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DAPRed荧光光谱

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5 assays
[5 assays: 35 mm dish]
SPiDER-BGal X1
Bafilomycin A1 X1

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.Anti yH2AX antibody X1
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