分类： 线粒体

MT14/mtSOX Deep Red – Mitochondrial Superoxide Detection

MT14/mtSOX Deep Red – Mitochondrial Superoxide Detection,线粒体在生成ATP的同时会生成超氧化物。正常情况下，细胞的抗氧化酶等物质会保护细胞免受活性氧的伤害。但是，当线粒体功能异常时，活性氧过量积累会造成细胞的各种机能紊乱。因此在评价细胞氧化应激水平时，往往需要同时检测线粒体的膜电位和线粒体的活性氧。

货号：MT14
线粒体超氧化物检测用荧光染料
mtSOX Deep Red – Mitochondrial Superoxide Detection
储存条件：0-5℃，避光
运输条件：室温

特点：

对超氧化物的选择性高
独特的荧光特性(λex: 540 nm; λem: 670 nm)

选择规格：1set,3set

产品概述

        线粒体在生成ATP的同时会生成超氧化物。正常情况下，细胞的抗氧化酶等物质会保护细胞免受活性氧的伤害。但是，当线粒体功能异常时，活性氧过量积累会造成细胞的各种机能紊乱。因此在评价细胞氧化应激水平时，往往需要同时检测线粒体的膜电位和线粒体的活性氧。

与其他试剂的比较

对各种活性氧的反应选择性

mtSOXDeep Red相较于T公司的产品Red，在各种活性氧中，对超氧化物的选择性更高。

另外，与其他公司产品所不同的是，mtSOX  Deep Red拥有独特的荧光特性(λex: 540 nm; λem: 670 nm)，可以同时进行线粒体膜电位检测试剂(JC-1 货号MT09; MT-1 货号MT13)的共染色实验。

实验例

线粒体超氧化物和线粒体膜电位的同时检测

用HBSS清洗HeLa细胞后，使用mtSOX和同仁化学研究所的线粒体膜电位检测试剂(JC-1 货号MT09或MT-1 货号MT13)进行共染色实验，同时观察线粒体ROS和线粒体膜电位。

结果显示，伴随着线粒体ROS的产生，线粒体膜电位也逐渐降低。

<使用JC-1的实验操作>

<检测条件>

JC-1:绿Ex=488 nm; Em= 490-520 nm; 红Ex=561 nm; Em= 560-600 nm

mtSOX:Ex=633 nm; Em= 640-700 nm

Scale bar: 10 μm

<检测条件>

JC-1:绿Ex=485 nm; Em= 535 nm; 红Ex=535 nm; Em= 595 nm

mtSOX:Ex=550 nm; Em= 675 nm

<使用MT-1的实验操作>

<检测条件>

MT-1: Ex=561 nm; Em= 560-600 nm

mtSOX:Ex=633 nm; Em= 640-700 nm

Scale bar: 10 μm

<检测条件>

MT-1: Ex=545 nm; Em= 600 nm;

mtSOX:Ex=550 nm; Em= 675 nm

细胞内Total ROS和线粒体超氧化物的同时检测

用HBSS清洗HeLa细胞后，使用mtSOX和同仁化学研究所的细胞内ROS检测试剂(ROS Assay Kit -Highly Sensitive DCFH-DA- 货号：R252)进行共染色实验，通过线粒体超氧化物诱导剂Antimycin或过氧化氢诱导后进行荧光观察。

结果显示，可以分别观察到细胞内ROS诱导后的荧光增强和线粒体的ROS诱导后的荧光增强。

<实验操作>

<Antimycin刺激的结果>

<检测条件>

细胞内ROS:  Ex=488 nm; Em= 490-520 nm

mtSOX:Ex=633 nm; Em= 640-700 nm

Scale bar: 10 μm

常见问题Q&A

Q1：mtSOX Deep Red的检测原理是什么？
A1：mtSOX Deep Red被Superoxide特异性氧化后会发出荧光，同时它还可在线粒体处积累，因此可以检测线粒体Superoxide。伴随着Superoxide的增加，线粒体的膜电位消失的话，核小体和细胞质会被染料染色。
Q2：每个试剂盒可以检测多少个样品？
A2：可检测的样品数如下。
・ 96-well plate: 1块。
・ ibidi 8-well plate: 6块。
・ 35 mm dish: 5块。
Q3：是否可以用培养基以外的溶液配制Working solution？
A3：可以，可使用HBSS或PBS代替培养基。
Q4：各检测仪器适用的滤光片？
A4：荧光显微镜、流式细胞仪、荧光酶标仪均可检测。
・激光共聚焦显微镜
Ex/Em: 561/640-700 nm (无红色荧光染料共染时)
Ex/Em: 633/640-700 nm (与红色荧光染料共染时)
・荧光显微镜
TxRed Filter
・荧光酶标仪
Ex/Em: 535–565/660–690 nm
Q5：是否可以刺激后再染色？
A5：在线粒体膜电位正常的前提下是有可能的。
本染料依赖线粒体膜电位在线粒体处积累，因此如果药物刺激造成线粒体膜电位降低的话，染料将无法在线粒体处积累，影响检测结果。因此推荐先染色再进行药物刺激。

MT13/线粒体膜电位检测试剂盒

MT13/线粒体膜电位检测试剂盒,线粒体利用氧气合成ATP，从而产生细胞所需的能量，是重要的细胞器之一。线粒体活性低下和机能障碍与癌症、老化、阿尔茨海默病、帕金森病等神经变性疾病密切相关。因此，线粒体膜电位（MMP）作为线粒体相关疾病的一个有希望的靶点已被广泛研究。

货号：MT13
线粒体膜电位检测试剂盒
MT-1 MitoMP Detection Kit
运输条件：室温

特点：

固定后仍可检测
荧光滞留性强
灵敏度高

选择规格：1set

产品概述

线粒体利用氧气合成ATP，从而产生细胞所需的能量，是重要的细胞器之一。线粒体活性低下和机能障碍与癌症、老化、阿尔茨海默病、帕金森病等神经变性疾病密切相关。因此，线粒体膜电位（MMP）作为线粒体相关疾病的一个有希望的靶点已被广泛研究。

产品特点

解决传统试剂的三个问题

观察线粒体膜电位时，使用JC-1、TMRE、TMRM，但由于PFA不可固定、容易淬灭，数据的再现性等问题。MT-1 MitoMP Detection Kit是克服了这些问题的线粒体膜电位的检测试剂。

并且，通过本试剂盒中包含的Imaging Buffer，可以在抑制了荧光背景和对细胞的损伤的状态下进行观察。

①固定后也可检测

由于微小的细胞状态的变化，也会造成线粒体膜电位发生变化，所以取得数据的重现性需要特别注意。通用的线粒体膜电位检测试剂（JC-1、TMRE）如果对细胞进行固定处理的话会失去荧光，所以需要使用活细胞进行迅速的测定。MT-1即使进行染色后进行PFA固定操作，也能保持荧光，因此可以进行高重复性的实验。

 

②可监控

没有进行药物刺激的细胞通过各种试剂染色，确认了荧光强度的变化。结果，JC-1和TMRE在染色后约10分钟左右荧光强度下降，MT-1仍保持了一定的荧光强度

 

③高灵敏度

线粒体膜电位的细微变化在JC-1中有难以检测的情况，在这种情况下，使用四甲基罗丹明乙酯（TMRE）监测MMP。MT-1可提供与TMRE同等的检测灵敏度。

 

与各种试剂的比较

 

实验例

1.通过去极化的实验例

通过线粒体去极化剂的cyanide-p-trifluoromethoxyphenylhydrazone (FCCP)处理HeLa细胞，用该试剂观察膜电位的变化。

 

结果，确认了FCCP处理的细胞线粒体膜电位下降的情况。

2.凋亡诱导细胞线粒体膜电位的变化

预先在MT-1中染色的HL60细胞中添加Etoposide，诱导凋亡后，与Annexin V、FITC Conjugate一同染色，并通过流式细胞仪检测。

 

结果发现Annexin V-FITC产生的荧光强度变化（绿色荧光强度的增加）确认了凋亡的发生，以及从MT-1产生的荧光强度变化（红色荧光强度的降低）发现了线粒体膜电位的变化。

常见问题Q&A

Q1:使用荧光显微镜检测时需要注意什么？

A1:请尽量减少激发光照射时间并提高检测灵敏度。

细胞长期暴露于激发光内可能导致细胞损伤和荧光染料降解，请优化检测时间。

Q2：MT-1检测后可以固定吗？

A2：应使用4%多聚甲醛（PFA）固定，且不能与（Triton X-100、NP-40等）一起使用，因为这可能导致染泄漏。

Q3：固定后可以对细胞染色吗？

A3：由于MT-1在线粒体中的积累取决于线粒体膜电位，因此固定后不适用于染色。

Q4：是否需要做阳性对照？

A4：作为阳性对照，可在技术手册中找到使用FCCP（羰基氰化物-对三氟甲氧基苯腙）的实验例。

Q5：优化染色条件时，应使用何种浓度的MT-1染料

A5：MT-1染料的浓度建议稀释1000倍。但在优化染色条件时，请参考以下内容。

<荧光强度弱>

请优化以下浓度：稀释500-1000倍。

<观察到非特异性吸附>

请优化以下浓度：稀释1000至2000倍。

Q6:我可以使用缓冲液来制备MT-1工作溶液吗？

A6:可以使用Hanks的HEPES和HBSS。也可以使用MEM、RPMI和含10%FBS的MEM制备。

Q7：添加MT-1工作液后，可以不清洗直接上机检测吗？

A7：染色后，无需清洗即可观察样品。但我们不建议在不清洗的情况下长期观察它们，因为它们可能具有细胞毒性。

我们建议去除上清液并用培养基替换。

Q8：MT-1染色后，是否可以用PBS代替HBSS来清洗？

A8：我们建议使用HBSS来减少细胞损伤。如果您没有HBSS，我们建议使用培养基来代替清洗。

参考文献

N. Okada, T. Yako, S. Nakamura, M. Shimazawa, H. Hara, “Reduced mitochondrial complex II activity enhances cell death via intracellular reactive oxygen species in STHdhQ111 striatal neurons Q1 with mutant huntingtin”, 2021, doi:10.1016/j.jphs.2021.09.001.

MT15/MitoBright IM Red for Immunostaining试剂

MT15/MitoBright IM Red for Immunostaining试剂,近年来，随着显微镜技术的发展，有关细胞器的研究正在由原来的“单独研究线粒体的机能””逐渐向“线粒体与其他细胞器之间的相互作用”的方向转移。因此，对于线粒体的更详细的形态观察需求越来越大。MitoBright IM Red克服了其他染料的靶向标记稳定性差的问题，是一种可以用于免疫荧光共染色线粒体荧光探针。

货号：MT15
免疫荧光用线粒体荧光染料
MitoBright IM Red for Immunostaining
储存条件：-20 保存
运输条件：室温

特点：

标记稳定性强、特异性高
可用于免疫荧光共染色

选择规格：20μl,20μl*3

规格性状

1 Tube 3Tubes
MitoBright lM Red for Immunostaining 20 ul ×1 20 ul × 3

产品概述

线粒体不仅是细胞中产生能量的场所，也是与癌症、衰老、神经退行性疾病（例如，阿尔茨海默症、帕金森症）等密切相关的最重要的细胞器之一。

近年来，随着显微镜技术的发展，有关细胞器的研究正在由原来的“单独研究线粒体的机能””逐渐向“线粒体与其他细胞器之间的相互作用”的方向转移。因此，对于线粒体的更详细的形态观察需求越来越大。

MitoBright IM Red克服了其他染料的靶向标记稳定性差的问题，是一种可以用于免疫荧光共染色线粒体荧光探针。

实验例：与内质网标记物KDEL的共染色

用MitoBrightIM Red标记HeLa细胞的线粒体，经固定化和膜透性处理后再用内质网标记物KDEL的抗体进行免疫共染色。并且在左图的箭头所示范围内进行了荧光强度的检测。从荧光图像可以清晰的观察线粒体与附近的内质网的形态。

<检测条件>

MitoBright IM Red (红) Ex: 561 nm,  Em: 560-620 nm

KDEL抗体-Alexa488 (绿) Ex: 488 nm, Em= 490-550 nm

Scale bar: 10 μm

MitoBright IM Red与其他试剂的不同

传统的小分子荧光染料在染色后的固定化操作或透膜剂处理后，往往会失去靶向性。而MitoBright IM Red与其他染料相比，提高了靶向稳定性，可以抑制免疫荧光实验时固定化操作造成的荧光强度减弱等问题。

・荧光强度差的比较

MitoBright IM与(T公司的)传统荧光染料相比，在活细胞线粒体染色后的固定化处理和透膜剂处理后的荧光强度如下图所示。固定化处理和透膜剂处理后，荧光强度都有一定的下降，但是MitoBright IM比传统染料的靶向标记稳定性更高，因此可以观察到更清晰的线粒体染色情况。

<检测条件>

Ex=561 nm; Em= 560-620 nm

・荧光背景的比较

使用线粒体标记物TOM20抗体比较MitoBrightIM和传统试剂的免疫染色后的线粒体定位情况。 用MitoBrightIM和传统试剂对HeLa细胞进行染色，然后用TOM20抗体进行二抗免疫荧光染色。 结果显示， 用MitoBrightIM或现有试剂对HeLa细胞进行染色，然后用TOM20抗体进行二抗染色。 结果显示，传统试剂有扩散到线粒体以外区域的情况，导致背景很高，而MitoBrightIM的背景更低，而且定位与TOM20抗体一致。

<检测条件>

Ex=561 nm; Em= 560-620 n

与传统试剂的对比

 

可检测的次数

MitoBright IM Red

规格

 荧光显微镜
（35 mm dish,  working   solution 2 ml/dish时)
20 μl 10   枚
20 µl x3 30   枚

荧光特性

激发波长(λex) ： 548 nm
发射波长(λem) ： 566 nm

常见问题Q&A

Q: MitoBright IM Red出厂就是是DMSO溶液状态，反复冻融是否会影响染色结果？

我们做过反复冻融5次的稳定性实验，染色结果正常。如果长时间保存时需要反复冻融，保险起见建议提前分装，分开保存。

Q：先药物刺激再进行MitoBright IM染色时，发现有荧光辉斑产生，请问是否有好的解决办法？
A：请在药物刺激前进行MitoBright IM的染色。
由于本试剂是依靠线粒体膜电位在线粒体处积累的，如果线粒体膜电位大幅降低，会导致试剂无法在线粒体处聚集。

(参考实验)

分别采用“先FCCP刺激后染色” 和“先染色后FCCP刺激” 的方法对HeLa细胞进行实验并观察荧光。

先进行MitoBright IM染色再FCCP刺激的实验组很顺利的观察到了荧光，而相反的实验组没有观察到荧光。

MT09/JC-1 MitoMP Detection Kit-线粒体膜电位检测试剂盒

MT09/JC-1 MitoMP Detection Kit-线粒体膜电位检测试剂盒,细胞中的线粒体作为有氧呼吸产生ATP的主要场所，是体内重要的细胞器之一，常被用于早期细胞毒性、氧化应激、细胞凋亡等研究中1)。线粒体活性的降低与机能失调，已被证实与癌症、衰老、神经退行性疾病 (如阿尔兹海默症、帕金森病等) 等密切相关2)3)。

货号：MT09
线粒体膜电位检测试剂盒
JC-1 MitoMP Detection Kit
储存条件：0-5度保存
运输条件：室温

特点：

灵敏度高
易上手
多种仪器均可检测

选择规格：1set

试剂盒内含

1 set

JC-1 Dye

100 nmolx1

lmaging Buffer (10x)

11 mlx1

关联产品TOP5

NO.1. Cell Counting Kit-8 细胞增殖毒性检测
NO.2. ROS Assay Kit 活性氧检测
NO.3. FerroOrange 细胞亚铁离子检测
NO.4. GSSG/GSH Quantification Kit II 氧化型/还原型谷胱甘肽
NO.5. Mitophagy Detection Kit 线粒体自噬检测

产品概述

细胞中的线粒体作为有氧呼吸产生ATP的主要场所，是体内重要的细胞器之一，常被用于早期细胞毒性、氧化应激、细胞凋亡等研究中1)。线粒体活性的降低与机能失调，已被证实与癌症、衰老、神经退行性疾病 (如阿尔兹海默症、帕金森病等) 等密切相关2)3)。

JC-1是一种被广泛使用的小分子线粒体膜电位探针，依赖于线粒体膜电位在线粒体中聚集，染料伴随聚集过程，荧光从绿色 (530 nm) 变为红色 (590 nm)。当线粒体发生去极化，红/绿荧光强度比值降低。以往的研究者反映，JC-1不易溶于水并有大量沉淀产生。但与其他公司的产品不同，同仁化学研究所研制的JC-1试剂解决了这一问题，避免了沉淀的产生。同时使用试剂盒中配制的成像缓冲液 (Imaging Buffer)，可大幅降低荧光背景并在检测过程中保护细胞不受损伤。

当JC-1工作液的浓度为2 μmol/l, 每次用量为100 μl时，可以检测500次。

产品特点

1.为什么要检测线粒体膜电位

线粒体不仅是细胞内产生能量的场所，它还与癌症、衰老、阿尔兹海默症、帕金森等神经变异性疾病密切相关。因此，针对线粒体状态的研究非常重要，其中线粒体膜电位的变化经常被作为重要的指标之一检测。

当线粒体正常、膜电位差保持不变时，JC-1会聚集并发出红色荧光，而当膜电位降低时，JC-1会作为单体存在并发出绿色荧光。红色和绿色荧光强度的变化可以作为检测线粒体状态的指标。

2.初次使用也很容易上手

3.去极化的检测实例

使用去极化剂carbonylcyanide-p-trifluoromethoxyphenylhydrazone（FCCP）对HeLa细胞进行处理，用本试

剂盒进行检测。可以发现与未加药物的细胞相比，加药组细胞的红色荧光明显减少。

实验条件

JC-1浓度： 2 μmol/l in MEM, 染色时间30 min

FCCP浓度：100 μmol/l， FCCP处理时间1 h

检测条件

Green : Ex 488 nm/ Em 500-550 nm;

Red : Ex 561 nm/ Em 560-610 nm;

标尺: 20 μm

操作步骤

实验例

1.诱导凋亡的实验例

1.1 荧光显微镜

通过荧光颜色的改变判断由凋亡导致的线粒体膜电位的变化。

检测条件

Green: Ex 488 nm / Em 500-550 nm

Red : Ex 561 nm / Em 560-610 nm

标尺: 80 μm

1.2 流式细胞仪

定量分析单个细胞的膜电位变化

检测条件

Green: Ex 488 nm / Em 515-545 nm

Red : Ex 488 nm / Em 564-604 nm

1.3 酶标仪

确认孔板中吸光度来判断线粒体膜电位的变化

检测条件

Green: Ex 485 nm / Em 525-545 nm

Red : Ex 535 nm / Em 585-605 nm

2.诱导自噬的实验例

使用表达Parkin的HeLa细胞，分别使用线粒体自噬试剂盒（Mitophagy Detection Kit：MD01）和线粒体膜电位检测试剂盒（JC-1 MitoMP Detection Kit： MT09）来观察添加和不添加CCCP（羰基氰化物间氯苯）的线粒体状态的变化。

结果证明在未经CCCP处理的细胞中几乎未检测到线粒体自噬的发生，并且线粒体膜电位正常维持。 而在添加了CCCP的细胞中，证实了线粒体膜电位的降低（JC-1的红色荧光的降低）和线粒体的自噬（Mtphagy染料的荧光的增强）。

<检测条件>

线粒体自噬检测

Ex：561 nm，Em：570-700 nm

线粒体膜电位检测

绿色Ex：488 nm，Em：500-550 nm

红色Ex：561 nm，Em：560-610 nm

实验条件

1.将Parkin质粒导入HeLa细胞

使用HilyMax（货号：H357）将Parkin质粒引入HeLa细胞中（Parkin质粒/HilyMax试剂：0.1 μg/0.2 μl）

然后过夜培养，收集细胞进行以下检测。

2.自噬检测

向表达Parkin的HeLa细胞中添加0.1 μmol/l Mtphagy工作溶液，并在37°C下孵育30分钟。然后将细胞用HBSS洗涤，加入10 μg/ml CCCP/MEM溶液，并在37℃下孵育2小时。荧光显微镜下观察处理后的细胞。

3.线粒体膜电位检测

将10 μg/ml的CCCP/MEM溶液添加至表达Parkin的HeLa细胞中，并在37℃下孵育1.5小时。加入4 μmol/l的JC-1工作溶液使终浓度至2 μmol/l，并将细胞溶液在37℃下孵育30分钟。孵育后将细胞用HBSS洗涤，加入成像缓冲液，在荧光显微镜下观察细胞。

3.线粒体膜电位与细胞周期关联性

将已知能在细胞周期的G2/M期起作用以终止细胞增殖并诱导细胞衰老的阿霉素（DOX）加入A549细胞后，

使用细胞周期检测试剂盒蓝色（产品代码：C549）/深红色（产品代码：C548）后检测。

结果证实了A549细胞的细胞周期确实发生了变化，同时用细胞衰老检测试剂盒–SPiDER-βGal（产品代码：SG03）证实了细胞产生衰老，实验证实了线粒体膜电位会发生变化。

 

常见问题Q&A

Q1: 本试剂盒可以检测多少次？

A1:大概的使用次数请参考下表：

检测装置 容器 使用次数 液量
流式细胞仪 – 100次 0.5 ml/次
荧光显微镜
荧光酶标仪		 35 mm dish 25次 2 ml/孔
8孔Chamber Slide 30次 200 μl/孔
96孔板 5次 100 μl/孔

Q2：在JC-1染色后，可以使用PBS代替HBSS洗涤吗？

A2：我们建议使用HBSS来减少对细胞的损伤。如果您手边没有HBSS的话，建议使用培养基洗净。

Q3：可以使用含血清的培养基吗？

A3：在清洗细胞和Working Solution中可以使用含血清的培养基。在观察荧光时建议使用Imaging Buffer。如果一定要使用含血清的培养基的话，建议不要加酚红。

Q4：染色后细胞固定或者固定后进行染色可以实现吗？

A4：细胞固定操作会使得线粒体去极化，所以染色前后均不能进行细胞固定。

Q5：处理后的样品与对照组相比较，红和绿两种荧光值都增加（或减少）了，结果该如何解释？

A5：请先比较实验组和对照组的荧光比值，两者相比，荧光比越低，线粒体膜电位越低。

用荧光之比进行结果分析的理由。

JC-1由于膜电位依存性地在细胞中积蓄，根据细胞的状态，每个细胞的JC-1的浓度有可能不同。

由于对照组和实验组处理样品的细胞状态不同，JC-1的累积浓度不同。)

另外，在线粒体膜电位较高的状态下，JC-1会聚集在一起，使荧光从绿色转移到红色。

该聚集体的量取决于膜电位的程度，因此可以用红/绿之比来比较样品之间的线粒体膜电位。

＜参考文献＞

1) Cossarizza, A. et al., Biochem Biophys Res Commun., 1993, 197(1), 40.

2) Perelman, A. et al., Cell Death and Disease, 2012, 3, e430

3) Smiley, S. T. et al., Proc. Nail. Acad. Sci., 1991, 88, 3671.

参考文献

文献No. 检测对象 检测仪器 引用
1) 细胞（U2OS, HeLa） 荧光显微镜 T.     Namba, “BAP31 regulates mitochondrial function via   interaction with   Tom40 within ER-mitochondria contact sites   “, Sci   Adv., 2019, 5, (6), 1386.
2) 细胞（Neuron） 荧光显微镜 I.   Kawahata, L. Luc   Bousset, R. Melki and K.   Fukunaga , “Fatty   Acid-Binding Protein 3 is Critical   for α-Synuclein Uptake and MPP+-Induced   Mitochondrial Dysfunction in   Cultured Dopaminergic Neurons “, Int J   Mol   Sci., 2019, 20, 5358.
3) 细胞（3T3L1, C2C12） 流式细胞仪 M.   Kurano, K. Tsukamoto, T.   Shimizu, H. Kassai, K. Nakao, A. Aiba, M.   Hara and   Yatomi , “Protection Against Insulin   Resistance by   Apolipoprotein M/Sphingosine     1-Phosphate “, Diabetes, 2020, DOI:     10.2337/db19-0811.
4) 细胞 流式细胞仪 T.   Nechiporuk, S.E. Kurtz, O.   Nikolova, T. Liu, C.L. Jones, A. D.   Alessandro, R. C. Hill, A. Almeida, S. K.   Joshi, M. Rosenberg, C. E.   Tognon, A. V. Danilov, B. J. Druker, B. H. Chang,   S. K McWeeney and J.   W. Tyner , “The TP53 Apoptotic Network Is   a Primary   Mediator of Resistance to BCL2 Inhibition in AML     Cells.”, Cancer Discov, 2019, 9,
5) 细胞 荧光显微镜 G.   Yang, M.   Fan, J. Zhu, C. Ling, L. Wu, X. Zhang, M. Zhang, J. Li, Q.   Yao, Z. Gu and X.   Cai, “A multifunctional anti-inflammatory   drug that can   specifically target activated   macrophages  massively deplete   intracellular H2O2 and   produce large amounts CO for a highly efficient   treatment of     osreoarthritis”  , Biomaterials, 2020,  doi:10.1016/j.biomaterials.2020.120155.
6) 细胞（ARPE-19) 荧光显微镜 J.   H. Quan, F. F. Gao, H.   A. Ismail, J. M.  Yuk, G. H. Cha, J. Q.   Chu and Y. H.   Lee,  “Silver Nanoparticle-Induced   Apoptosis in ARPE-19 Cells   Is Inhibited by Toxoplasma gondii   Pre-Infection Through Suppression of   NOX4-Dependent ROS   Generation”, Int J   Nanomedicine , 2020, 15,   3695–3716.

M466/MitoPeDPP试剂

M466/MitoPeDPP试剂,MitoPeDPP是一种新型荧光染料，由于其具有三苯基膦结构，因此可以穿过细胞膜并在线粒体中聚集。聚集在线粒体内膜上的MitoPeDPP可以被脂质过氧化物氧化而释放出强荧光。由于氧化的MitoPeDPP(Ox-MitoPeDPP) 的激发和发射波长分别是452 nm和470 nm，可以减小样品的光损伤和自发荧光，因此利用荧光显微镜MitoPeDPP可以检测活细胞中的脂质过氧化物。

货号：M466
3-[4-(Perylenylphenylphosphino)phenoxy]propyltriphenylphosphonium iodide
MitoPeDPP
储存条件：0-5度保存，避光
运输条件：室温

特点：

特异性的在细胞中线粒体内聚集
可以检测线粒体膜内的脂质过氧化物
可以在488 nm和535 nm的荧光波长下进行检测

选择规格：5μg*3

产品概述

MitoPeDPP是一种新型荧光染料，由于其具有三苯基膦结构，因此可以穿过细胞膜并在线粒体中聚集。

聚集在线粒体内膜上的MitoPeDPP可以被脂质过氧化物氧化而释放出强荧光。由于氧化的MitoPeDPP

(Ox-MitoPeDPP) 的激发和发射波长分别是452 nm和470 nm，可以减小样品的光损伤和自发荧光，因此利用

荧光显微镜MitoPeDPP可以检测活细胞中的脂质过氧化物。

特点

1.特异性的在细胞中线粒体内聚集

2.可以检测线粒体膜内的脂质过氧化物

3.可以在488 nm和535 nm的荧光波长下进行检测

* 本产品由福冈大学化学系的Dr. Shioji开发

*由于MitoPeDPP量极少不宜看到，可以通过观察MitoPeDPP DMSO溶液的颜色是否为黄色来判断。

检测原理

MitoPeDPP可以穿过细胞膜并在线粒体中聚集。聚集在线粒体内膜上的MitoPeDPP可以被脂质过氧化物氧化而释放出强荧光。

 

实验例

1.MitoPeDPP和线粒体染色试剂MitoBright共同染色的实施例

在HeLa细胞中添加t-BHP（氢过氧化叔丁基），检测脂质过氧化物

波长（wavelength/band pass）

MitoPeDPP：470/40（Ex），525/50（Em）

MitoBright DeepRed：600/50（Ex），685/50（Em）

结果证实在HeLa细胞内的线粒体中，MitoPeDPP受t-BHP氧化后会发出荧光。另外通过与线粒体染色试剂（MitoBright Deep Red:MT08）的共染色，确认了MitoPeDPP的荧光是定位在线粒体中。

 

2.检测添加Rotenone产生的脂质过氧化物

向HeLa细胞[μ-slide，8孔（由Ibidi制造）]中添加MitoPeDPP之后，添加Rotenone溶液并使用荧光显微镜观察。实验结果证实，添加Rotenone后，检测到细胞中产生了脂质过氧化物。

Rotenone的刺激时间：0 min(左)，90 min(中)，180 min(右)

 

上部）荧光图，下部）明场图

3.神经细胞使用MitoPeDPP的实验例

A.荧光显微镜检测

向NIE-115细胞（小鼠神经芽细胞瘤）添加异黄素，诱导Ca2+流入细胞内，并通过MitoPeDPP的荧光染色来观察线粒体膜内的脂溶性过氧化物的产生。实验结果证实添加了异霉素的实验组相比对照组来说荧光更强。

 

B. 平均荧光强度数据比较

为了量化对照组细胞和添加了离子霉素的细胞的荧光强度，对两组数据进行基于平均荧光强度的比较。

结果证实，加入离子霉素后30分钟的细胞对比对照组的细胞，观察到的荧光强度显着增加。

数据提供（Free Radical Research, in press)

 

参照芝浦工业大学系统理工学院 福井浩二副教授、中村沙希[参考文献3]

4.MitoPeDPP反应的选择性

在不含细胞的反应体系中，MitoPeDPP可以与各种过氧化物如H2O2，t-BHP和ONOO- 反应，但是在细胞中，积

累在线粒体中的MitoPeDPP可以被t-BHP氧化而释放出较强荧光 (图3A)，却和其它ROS或RNS反应很弱 (图3B)。

A) 在HepG2细胞中加入MitoPeDPP培养15 min，然后用100 μmol / l的t-BHP处理。

B) 在HepG2细胞中加入MitoPeDPP培养15 min后，加入ROS、RNS诱导剂。

分别加入100 μmol / l (H2O2，NO和ONOO-诱导剂)和10  μmol / l  PMA（O2-.诱导剂） 。

左边为明场图，右边为荧光图

* t-BHP：tert-Butylhydroperoxide; PMA, Phorbol myristate acetate;

SIN-1, 3-(Morpholinyl)sydnonimine, hydrochloride;

NOC 7, 1-Hydroxy-2-oxo-3-(N-methyl-3-aminopropyl)-3-methyl-1-triazene

波长/带通滤波器：470/40 (Ex), 525 /50 (Em)

 

参考文献

1) K. Shioji K, Y. Oyama, K. Okuma and H. Nakagawa, “Synthesis and properties of fluorescence probe for detection of peroxides in mitochondria.”, Bioorg Med Chem Lett., 2010, 20, (13), 3911.

2) S. Oka, J. Leon, K. Sakumi, T. Ide, D. Kang, F. M. LaFerla and Y. Nakabeppu, “Human mitochondrial transcriptional factor A breaks the mitochondria-mediated vicious cycle in Alzheimer’s disease”, Scientific Reports ., 2016, DOI: 10.1038/srep37889 , .

3) S. Nakamura, A. Nakanishi, M. Takazawa, S. Okihiro, S. Urano and K. Fukui, “Ionomycin-induced calcium influx induces neurite degeneration in mouse neuroblastoma cells: Analysis of a time-lapse live cell imaging system”, Free Radical Research., 2016, 50, (11), 1214.

4) M. Akimoto, R. Maruyama, Y. Kawabata, Y. Tajima and K. Takenaga, “Antidiabetic adiponectin receptor agonist AdipoRon suppresses tumour growth of pancreatic cancer by inducing RIPK1/ERKdependent necroptosis”, Cell Death Dis., 2018, 9, 804.

5) M. Álvarez-Córdoba, A. Fernández Khoury, M. Villanueva-Paz, C. Gómez-Navarro, I. Villalón-García, J. M. Suárez-Rivero, S. Povea-Cabello, M. Mata, D. Cotán, M. Talaverón-Rey, A. J. Pérez-Pulido, J. J. Salas, E. M. Pérez-Villegas, A. Díaz-Quintana, J. A. Armengol, J. A. Sánchez-Alcázar , “Pantothenate Rescues Iron Accumulation in Pantothenate Kinase-Associated Neurodegeneration Depending on the Type of Mutation.”, Mol. Neurobiol. ., 2019, 56, (5), 3638.

MD01/Mitophagy Detection Kit-线粒体自噬

MD01/Mitophagy Detection Kit-线粒体自噬,线粒体 (Mitochondria) 是细胞中重要的细胞器之一，可以为细胞活力提供能量 。近年有报道去极化线粒体的积累引起的阿尔茨海默病 (Alzheimer’s Disease) 与帕金森病(Parkinson’s Disease)，可能与线粒体自噬有关。

货号：MD01
线粒体自噬检测试剂盒
Mitophagy Detection Kit

特点：

只需添加小分子量荧光试剂即可轻松检测线粒体
可以使用荧光显微镜进行活细胞成像
可以与附着的溶酶体染色剂同时染色

选择规格：1set

试剂盒内含

1 set . Mtphagy Dye
. Lyso Dye		 ×1管
×1管

产品概述

线粒体 (Mitochondria) 是细胞中重要的细胞器之一，可以为细胞活力提供能量 。近年有报道去极化线粒体的积累引起的阿尔茨海默病 (Alzheimer’s Disease) 与帕金森病(Parkinson’s Disease)，可能与线粒体自噬有关。线粒体自噬是一种清除机制，可以通过自噬，将氧化应激、DNA损伤因素导致功能失调的线粒体隔离包裹成自噬体(Autophagosome)，再与溶酶体 (Lysosome) 融合后降解。本试剂盒内含Mtphagy Dye (用于检测线粒体自噬) 和Lyso Dye (溶酶体染料)。Mtphagy Dye通过化学结合，固定在细胞内的线粒体上，会发出较弱的荧光。当线粒体发生自噬，损伤的线粒体会与溶酶体融合，pH会下降，变成酸性，此时Mtphagy Dye会产生较强的荧光。如想直观观察Mtphagy Dye标记的线粒体和溶酶体的结合，可联合应用试剂盒中的Lyso Dye (标记溶酶体) 进行双染。

特点：

1）只需添加小分子量荧光试剂即可轻松检测线粒体

2）可以使用荧光显微镜进行活细胞成像

3）可以与附着的溶酶体染色剂同时染色

原理

记载了本产品的检测原理和实验例的论文请看MD01论文实验例中第四篇：Live Cell Imaging of Mitochondrial Autophagy with a Novel Fluorescent Small Molecule

 

实验例

1.用羰基氰化物间氯苯腙 (CCCP，一种线粒体解偶联剂) 诱导Parkin表达的HeLa细胞线粒体自噬，并通过荧光显微镜进行检测。另外，通过与线粒体染色试剂（MitoBright Deep Red:MT08）一同染色，能够区分出已发生自噬的的线粒体（白色）和未发生自噬的线粒体（紫色）（照片：右侧）。

波长：

Mtphagy Dye:561 nm (Ex)、650 LP nm (Em)

Lyso Dye:488 nm (Ex)、502-554 nm (Em)

MitoBright Deep Red:640 nm (Ex)、656-700 nm (Em)

2.荧光显微镜观察

HeLa细胞用CCCP处理，并与线粒体检测试剂（Mtphagy Dye）和线粒体染色试剂（MitoBright LT Green）共同染色，并经过一段时间（6小时）后进行检测。

<检测条件>

设备：LSM-700 Laser scanning confocal microscope (LSCM)

(Carl Zeiss, Oberkochen, Germany)

激发波长：

MitoBright LT Green 488 nm

Mtphagy Dye      555 nm

物镜：63x

拍摄时间：6小时

拍摄间隔：15秒

3.自噬诱导和线粒体膜电位变化关系的检测

用羰基氰化物间氯苯腙(CCCP，一种线粒体解偶联剂)诱导Parkin表达的HeLa细胞线粒体自噬，并使用线粒体自噬检测试剂盒（Mitophagy Detection Kit：MD01）和线粒体膜电位检测试剂盒（JC-1 MitoMP Detection Kit：MT09）观察荧光结果。

结果证实在未经CCCP处理的细胞中几乎未检测到线粒体自噬的发生，并且线粒体膜电位正常维持。 另一方面，在添加了CCCP的细胞中，证实了线粒体膜电位的降低（JC-1的红色荧光降低）和线粒体自噬的发生（Mtphagy染料的荧光增强）。

<实验条件>

■将Parkin质粒导入HeLa细胞

使用HilyMax（货号：H357）将Parkin质粒引入HeLa细胞中（Parkin质粒/HilyMax试剂：0.1 μg/0.2 μl）

过夜培养后进行检测。

■线粒体自噬检测

向表达Parkin的HeLa细胞中添加0.1 μmol/l Mtphagy工作溶液，并在37°C下孵育30分钟。然后将细胞用HBSS洗涤，加入10 μg/ml CCCP/MEM溶液，并在37℃下孵育2小时。在荧光显微镜下观察细胞。

■线粒体膜电位检测

将10 μg/ml的CCCP/MEM溶液添加至表达Parkin的HeLa细胞中，并在37℃下孵育1.5小时。加入4 μmol/l的JC-1工作液使其终浓度达到2 μmol/l，并在37℃下孵育30分钟。孵育后，将细胞用HBSS洗涤，加入成像缓冲液，并在荧光显微镜下观察细胞。

 

<检测条件>

■线粒体自噬检测

Ex：561 nm，Em：570-700 nm

■线粒体膜电位检测

绿色Ex：488 nm，Em：500-550 nm

红色Ex：561 nm，Em：560-610 nm

荧光特性

 

常见问题Q&A

Q1: 本试剂盒和现存传统方法相比有何优势？

A1: 与PH敏感并基于Keima荧光蛋白检测方法相比，本试剂为小分子荧光试剂，因此无需表达荧光蛋白。

另外，可以通过与用于普通活细胞成像的荧光试剂用相同的操作方法对其进行染色和共同观察。

Q2: 使用DMSO配置后的储存液稳定性如何？
A2：Mtphagy Dye、Lyso Dye均在制备后需保存在-20℃情况下可以稳定保存1个月。建议按照实验用量，

提前分装保存。

Q3: 工作液稳定性如何

A3: 无法保存，建议现配现用。
Q4: 培养基中有酚红会影响检测吗？

A4：观察的时候，如果使用共聚焦激光显微镜的话，几乎不会受到酚红的影响，但是使用落射型荧光显微

镜的话，会观察到酚红色的背景。（参照以下观察数据）因此使用落射型荧光显微镜时，请在Working

solution进行染色时使用不含酚红的培养基或HBSS。

Q5: 荧光显微镜推荐的滤镜是什么？

A5:根据各种试剂推荐以下波长。
Mtphagy Dye：激发（500～560 nm）、发射（670～730 nm）

Lyso Dye：激发（350～450 nm）、发射（500～560 nm）

Q6:与其他深红色染料共同染色时的注意事项。
A6：Mtphagy Dye比一般的红色系荧光染料相比波长更长，所以和Deep Red的荧光染料一起染色的时候

需要特别注意。即Mtphagy Dye在500–560 nm处激发，可在670-730 nm处检测到荧光，这时与

MitoBright Deep Red的荧光检测波长重叠。因此，有必要在不激发深红色染料的波长下激发Mtphagy

染料，同时在不激发Mtphagy染料的波长下激发深红色染料。

[泄漏的情况]

① 制备仅添加了MitoBright Deep Red（没有添加Mtphagy Dye）的细胞。

② 通过观察MitoBright Deep Red的激发/发射波长，确认是否观察到荧光（右下图）。

③ 用Mtphagy Dye的激发/发射波长观察，确认是否观察到荧光（左下图）。

和③中，观察到来自MitoBright Deep Red的荧光（左下图）。

*如果如上所述确认荧光泄漏，请参阅以下内容。

○调整激发/发射波长

如以上确认如图所示，MitoBright Deep Red也在Ex 561 nm处激发，因此可以将Mtphagy Dye的激发

波长更改为接近激光器或滤光片的500 nm，以使MitoBright深红色不被激发。

调整荧光强度和荧光检测灵敏度

如果MitoBright Deep Red的荧光泄漏到Mtphagy染料的观察波长中，请将观察过程中的激发强度或

灵敏度降低到未观察到荧光的水平。

然后，再确认改变后的观察条件下可以检测Mtphagy Dye的荧光。

[如何检查泄漏]

使用Mtphagy Dye，Lyso dye（溶酶体染色剂），MitoBrightLT Deep Red（线粒体染色剂）

进行三重染色时进行确认

1.在3个培养皿或孔中制备细胞。

（Mtphagy Dye、Lyso Dye、MitoBright Deep Red分别在在不同的皿或孔中进行染色）

2.向每个孔中添加Mtphagy Dye和MitoBright Deep Red。 （在无血清培养基中）

3.在37°C下孵育30分钟。

4.进行自噬诱导条件下（如饥饿培养等）进行培养。

5.向上述2.中未使用的细胞添加Lyso Dye。（在无血清培养基中）

6.在37°C下孵育30分钟。

7.观察每种试剂的激发波长和荧光波长以及荧光强度。

8.检查所用试剂以外的观察波长处的荧光是否没有泄漏。

[观察条件]

Lyso Dye：Ex：350-450 nm，Em：500-560 nm

Mtphagy Dye：Ex ： 500-560 nm，Em ：670-730 nm

MitoBright Deep Red：Ex ：640 nm，Em ：656-700 nm

参考文献

序号 检测对象 使用仪器 文献
1) 细胞（HeLa） 流式细胞仪 J. Koniga,   C. Otta, M. Hugoa, T. Junga, A. L. Bulteaub, T. Grunea and A. Hohna, “Mitochondrial contribution to lipofuscin   formation”, Redox Biology, 2017, 11, 673.
2) 细胞（KB） 荧光显微镜 K. Kameyama, “Induction of mitophagy-mediated antitumor activity with   folate-appended methyl-β-cyclodextrin”, International Journal of   Nanomedicine, 2017, 12, 3433.
3) 细胞（SH-SY5Y, 初代皮质神经细胞） 荧光显微镜 E. F. Fang, T. B. Waltz, H.   Kassahun, Q. Lu, J. S. Kerr, M. Morevati, E. M. Fivenson, B. N. Wollman, K.   Marosi, M. A. Wilson, W. B. Iser, D. M. Eckley, Y. Zhang, E. Lehrmann, I. G.   Goldberg, M. S. Knudsen, M. P. Mattson, H. Nilsen, V. A. Bohr and K. G. Becker, “Tomatidine enhances lifespan and healthspan in C. elegans   through mitophagy induction via the SKN-1/Nrf2 pathway”, Scientific   Reports, 2017, 7, (46208), DOI: 10.1038/srep46208.
4) 细胞（HeLa、Parkin表达HeLa） 荧光显微镜 H. Iwashita, S. Torii, N.   Nagahora, M. Ishiyama, K. Shioji, K. Sasamoto, S. Shimizu and K. Okuma, “Live Cell Imaging of Mitochondrial Autophagy with a Novel   Fluorescent Small Molecule”, ACS Chem. Biol., 2017, 12,   (10), 2546.
5) 细胞（Cardiomyocytes） 流式细胞仪 Y. Feng, NB.   Madungwe, CV. da Cruz Junho and JC. Bopassa, “Activation of G protein-coupled oestrogen receptor 1 at   the onset of reperfusion protects the myocardium against ischemia/reperfusion   injury by reducing mitochondrial dysfunction and mitophagy.”, Br.   J. Pharmacol., 2017, 174, (23), 4329.
6) 细胞（HCT116） 荧光显微镜 K. M.   Elamin, K. Motoyama, T. Higashi, Y. Yamashita, A. Tokuda and H. Arima, “Dual targeting system by supramolecular complex of   folate-conjugated methyl-β-cyclodextrin with adamantane-grafted hyaluronic   acid for the treatment of colorectal cancer.”, Int. J. Biol.   Macromol., 2018, doi: 10.1016/j.ijbiomac.2018.02.149.
7) 细胞（Parkin-HeLa） 流式细胞仪 N. Furuya, S. Kakuta, K. Sumiyoshi, M. Ando, R. Nonaka, A. Suzuki, S. Kazuno, S. Saiki   and N. Hattori, “NDP52 interacts with   mitochondrial RNA poly(A) polymerase to promote mitophagy.”, EMBO   Rep. ., 2018, doi: 10.15252/embr.201846363.
8) 细胞（NKT） 流式细胞仪 L. Zhu, X. Xie, L.   Zhang, H. Wang, Z. Jie, X. Zhou, J. Shi, S. Zhao, B. Zhang, X. Cheng and   S. Sun, “TBK-binding protein 1 regulates   IL-15-induced autophagy and NKT cell survival”, Nature   Communications., 2018, 9, (1), doi:10.1038/s41467-018-05097-5.
9) 细胞（HeLa） 流式细胞仪 K. Araki,   K. Kawauchi, W. Sugimoto, D. Tsuda, H. Oda, R. Yoshida and K. Ohtani, “Mitochondrial protein E2F3d, a distinctive E2F3 product,   mediates hypoxia-induced mitophagy in cancer cells”, Commun   Biol., 2019, DOI: 10.1038/s42003-018-0246-9.
10) 细胞（Bovine Sertoli） 荧光显微镜 E. Adegoke, S.   Adeniran, Y. Zeng, X. Wang, H. Wang, C. Wang, H.   Zhang, P. Zheng and G. Zhang , “Pharmacological   inhibition of TLR4/NF-κB with TLR4-IN-C34 attenuated microcystin-leucine   arginine toxicity in bovine Sertoli cells.”, J Appl   Toxicol., 2019,doi: 10.1002/jat.3771.
11) 组织（小鼠） 荧光显微镜  E. F. Fang, Y.   Hou, K. Palikaras, B. A. Adriaanse, J. S. Kerr, B.   Yang, S. Lautrup, M. M. Hasan-Olive, D. Caponio, X.   Dan, P. Rocktaschel, D. L. Croteau, M. Akbari, N. H.   Greig, T. Fladby, H. Nilsen, M. Z. Cader, M. P.   Mattson, N. Tavernarakis and V. A. Bohr, “Mitophagy   inhibits amyloid-β and tau pathology and reverses cognitive deficits in   models of Alzheimer’s   disease.”, Nat. Neurosci. ., 2019,DOI:10.1038/s41593-018-0332-9.
12) 细胞（HepG2） 荧光显微镜 Iwasawa, T.   Shinomiya, N. Ota, N. Shibata, K. Nakata, I. Shiina,   and Y. Nagahara , “Novel Ridaifen-B   Structure Analog Induces Apoptosis and Autophagy Depending on Pyrrolidine   Side Chain”, Biological and Pharmaceutical   Bulletin., 2019, 42, (3), 401-410, doi: 10.1248/bpb.b18-00643.
13) 细胞（U2OS） 荧光显微镜 T. Namba, “BAP31 regulates mitochondrial function via interaction   with Tom40 within ER-mitochondria contact sites “, Sci   Adv., 2019, 5, (6), 1386.
14) 细胞（INS-1） 荧光显微镜 A.   Inamura, S. M. Hirayama, and K. Sakurai, Loss of   Mitochondrial DNA by Gemcitabine Triggers Mitophagy and Cell   Death’, Biol. Pharm. Bull.., 2019, 42, 1977.
15) 细胞（HRCEpiC, HRPTEpic） 流式细胞仪 Y. Zhao and   M. Sun, Metformin rescues Parkin protein expression   and mitophagy in high glucose-challenged human renal epithelial cells by   inhibiting NF-κB via PP2A activation., Life   Sci.., 2020, DOI:10.1016/j.lfs.2020.117382.
16) 细胞（RAES） 荧光显微镜 N. Liu, J. Wu, L. Zhang, Z. Gao,   Y. Sun, M. Yu, Y. Zhao, S. Dong, F. Lu and W. Zhang , “Hydrogen Sulphide modulating mitochondrial morphology to   promote mitophagy in endothelial cells under high‐glucose and high‐palmitate   “, J. Cell. Mol. Med., 2017, 21, (12), 3190.
17) 细胞（BAECs） 荧光显微镜 N. Kajihara, D. Kukidome, K.   Sada, H. Motoshima, N. Furukawa, T. Matsumura, T. Nishikawa and E.   Araki, “Low glucose induces mitochondrial   reactive oxygen species via fatty acid oxidation in bovine aortic endothelial   cells”, J Diabetes Investig, 2017, 8, (6), 750.
18) 细胞（HT22） 荧光显微镜 M. Jin, H. Ni and  L.   Li, “Leptin Maintained Zinc Homeostasis Against   Glutamate-Induced Excitotoxicity by Preventing Mitophagy-Mediated   Mitochondrial Activation in HT22 Hippocampal Neuronal   Cells.”, Front Neurol, 2018, 9, (9), 332.
19) 细胞（BMDMs） 流式细胞仪 D. Bhatia, K. P. Chung, K.   Nakahira, E. Patino, M. C. Rice, L. K. Torres, T. Muthukumar, A. M. Choi, O.   M. Akchurin and M. E. Choi , “Mitophagy-dependent   macrophage reprogramming protects against kidney fibrosis”, JCI   Insight, 2019, 4, (23), e132826.
20) 细胞（U2OS） 荧光显微镜 J. Zheng, D. L. Croteau, V. A.    Bohr and M. Akbari, “Diminished OPA1   expression and impaired mitochondrial morphology and homeostasis in   Aprataxin-deficient cells. “, Nucleic Acids   Res., 2019, 47, (8), 4086.
21) 细胞（HT22） 荧光显微镜 D. D. Wang, M. F. Jin, D. J. Zhao   and H. Ni, “Reduction of Mitophagy-Related   Oxidative Stress and Preservation of Mitochondria Function Using Melatonin   Therapy in an HT22 Hippocampal Neuronal Cell Model of Glutamate-Induced   Excitotoxicity”, Front Endocrinol (Lausanne), 2019, 10,   550.
22) 细胞（CD4+T-cells, HeLa） 荧光显微镜 A. Bektas, S. H. Schurman, M. G.   Freire, A. Bektas, S. H. Schurman, M. G. Freire, C. A. Dunn, A. K. Singh, F.   Macian, A. M. Cuervo, R. Sen and L. Ferrucci, “Age-associated   changes in human CD4+ T cells point to mitochondrial dysfunction consequent   to impaired autophagy.”, Aging (Albany NY)., 2019, 11,   (21), 9234-9263.
23) 细胞（ALM） 流式细胞仪 T. Nechiporuk, S.E. Kurtz, O.   Nikolova, T. Liu, C.L. Jones, A. D. Alessandro, R. C. Hill, A. Almeida, S. K.   Joshi, M. Rosenberg, C. E. Tognon, A. V. Danilov, B. J. Druker, B. H. Chang,   S. K McWeeney and J. W. Tyner, “The TP53   Apoptotic Network Is a Primary Mediator of Resistance to BCL2 Inhibition in   AML Cells.”, Cancer Discov., 2019, 9, (7), 919.
24) 细胞（PK-15） 荧光显微镜 Y. Zhang, R. Sun, X. Li  and   W. Fang, “Porcine Circovirus 2 Induction of ROS Is Responsible for Mitophagy in PK-15 Cells via Activation of Drp1 Phosphorylation”, Viruses., 2020, 12, (3), 289.
25) 细胞（HCE） 荧光显微镜 Y. Huo, W. Chen, X. Zheng, J.   Zhao, Q. Zhang, Y. Hou, Y. Cai, X. Lu and X. Jin , “The protective effect of EGF-activated ROS in human   corneal epithelial cells by inducing mitochondrial autophagy via activation   TRPM2.”, J. Cell. Physiol., 2020, DOI: 10.1002/jcp.29597.
26) 细胞（心肌细胞） 荧光显微镜 Y. Sun, F. Lu, X. Yu, B. Wang, J.   Chen, F. Lu, S. Peng, X. Sun, M. Yu, H. Chen, Y. Wang, L. Zhang, N. Liu, H.   Du, D. Zhao and W. Zhang, “Exogenous H2S   Promoted USP8 Sulfhydration to Regulate Mitophagy in the Hearts of db/db   Mice.”, Aging Dis., 2020, 11, (2), 269.
27) 细胞（HCFs） 荧光显微镜 R. Tanaka, M. Umemura, M.   Narikawa, M. Hikichi, K. Osaw, T. Fujita, U. Yokoyama, T. Ishigami, K. Tamura   and Y. Ishikawa, “Reactive fibrosis precedes   doxorubicin-induced heart failure through sterile   inflammation.”, ESC Heart Fail., 2020, 7, (2), 588.
28) 细胞（VSMCs） 荧光显微镜 C. Duan, L. Kuang, X. Xiang, J.   Zhang, Y. Zhu, Y. Wu, Q. Yan, L. Liu and T. Li, “Drp1   regulates mitochondrial dysfunction and dysregulated metabolism in ischemic   injury via Clec16a-, BAX-, and GSH- pathways “, Cell Death   Dis., 2020, 11, 251.
29) 细胞（Bovine Sertoli） 荧光显微镜 E. O. Adegoke, W. Xue, N. S.   Machebe, S. O. Adeniran, W. Hao, W. Chen, Z. Han, Z. Guixue and Z.   Peng, “Sodium Selenite inhibits mitophagy,   downregulation and mislocalization of blood-testis barrier proteins of bovine   Sertoli cell exposed to microcystin-leucine arginine (MC-LR) via TLR4/NF-kB   and mitochondrial signaling pathways blockage.”, Ecotoxicol.   Environ. Saf., 2018, 116, 165.
30) 细胞（HeLa） 荧光显微镜 D. Takahashi, J. Moriyama, T.   Nakamura, E. Miki, E. Takahashi, A. Sato, T. Akaike, K. I. Nakama and H.   Arimoto, “AUTACs: Cargo-Specific Degraders   Using Selective Autophagy. “, Mol. Cell, 2019, 76,   (5), 797.
31) 细胞（primary hepatocyte） 荧光显微镜 H. Kim, J. H. Lee and J. W.   Park, “IDH2 deficiency exacerbates   acetaminophen hepatotoxicity in mice via mitochondrial dysfunction-induced   apoptosis.”, Biochim Biophys Acta Mol Basis   Dis, 2019, 1865, (9), 2333.
32) 细胞（C3H10T1/2s） 荧光显微镜 M. S.    Rahman and Y. S.  Kim, “PINK1-PRKN   mitophagy suppression by Mangiferin promotes a brown-fat-phenotype via   PKA-p38 MAPK signalling in murine   C3H10T1/2”, Metabolism, 2020, 101, 154228.
33) 细胞（NHEKs） 荧光显微镜 S. Ikeoka   and A. Kiso  , “The Involvement of   Mitophagy in the Prevention of UV-B-Induced Damage in Human Epidermal   Keratinocytes “, J. Soc. Cosmet. Chem.   Jpn., 2020,  54(3), 252.

M489/Mito-FerroGreen,Fe2+荧光法,铁死亡荧光试剂

M489/Mito-FerroGreen-铁离子荧光探针,研究证实铁是生物体内量最多的过渡金属元素。其参与多种生理活动。近几年，细胞内的游离铁离子由于具有很高的反应性，和细胞损伤、死亡有一定的关联而得到了越来越多的关注。在细胞内游离铁离子以稳定的Fe2+和 Fe3+形式存在。

货号：M489
铁死亡荧光试剂 (Fe2+荧光法)
Mito-FerroGreen
储存条件：-20度保存，避光
运输条件：室温

特点：

  1. 对二价铁离子的高度选择性和高灵敏度
  2. 适用于通用滤光片

选择规格：50μg*2

产品概述

研究证实铁是生物体内量最多的过渡金属元素。其参与多种生理活动。近几年，细胞内的游离铁离子由于具有很高的反应性，和细胞损伤、死亡有一定的关联而得到了越来越多的关注。在细胞内游离铁离子以稳定的Fe2+和 Fe3+形式存在。从细胞内的还原环境，金属转运体及Fe2+的水溶性考虑，认为揭示细胞内Fe2+的行为比Fe3+更重要。Mito-FerroGreen是一种新型荧光探针，用于检测线粒体 (铁硫簇和血红素蛋白的合成场所) 内亚铁离子Fe2+。

该产品已在岐阜药科大学药物化学实验室的 永澤秀子 和 平山祐 博士的指导下开发。

测定原理

产品特点

铁离子检测试剂的选择

可以根据自己的实验方法和实验仪器选择检测试剂

FerroOrange Mito-FerroGreen
细胞内分布 细胞内 线粒体
荧光特性 λex : 543 nm、λem : 580 nm λex : 505 nm、λem : 535 nm
检测仪器 荧光显微镜 荧光显微镜 （FITC、GFP）
（滤镜）
检测对象 活细胞 活细胞
染色次数 24 μg可染色35 mm dish 17块板 50 μg可染色35 mm dish 5块板
（终浓度 1 μmol/l時） （终浓度 5 μmol/l時）

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活性氧检测试剂盒（ROS Assay Kit）

MT05/Si-DMA for Mitochondrial Singlet Oxygen Imaging试剂

MT05/Si-DMA for Mitochondrial Singlet Oxygen Imaging试剂,单线态氧(Singlet Oxygen,1O2)是一种具有强氧化性的活性氧（ROS），是造成皮肤斑点及皱纹的重要因素。在化妆品等研究中，去除单线态氧是重要的研究目的。在癌症研究领域，单线态氧在光动力疗法（PDT：一种采用光敏药物和激光活化治疗肿瘤的新兴抗癌疗法）中起到关键作用。因此检测活细胞内的单线态氧对于了解PDT的抗癌机理至关重要。但是现有的荧光探针由于不能穿透细胞膜，所以无法用于活细胞检测。

货号：MT05
线粒体内单线态氧荧光探针试剂
Si-DMA for Mitochondrial Singlet Oxygen Imaging
储存条件：-20度保存，避光
运输条件：室温

分子式：C35H37ClN2Si
分子量：549.22

特点：

  1. 能够对活细胞进行荧光成像
  2. 对单线态氧的高选择性

选择规格：2μg

产品概述

       单线态氧(Singlet Oxygen,1O2)是一种具有强氧化性的活性氧（ROS），是造成皮肤斑点及皱纹的重要因素。在化妆品等研究中，去除单线态氧是重要的研究目的。在癌症研究领域，单线态氧在光动力疗法（PDT：一种采用光敏药物和激光活化治疗肿瘤的新兴抗癌疗法）中起到关键作用。因此检测活细胞内的单线态氧对于了解PDT的抗癌机理至关重要。但是现有的荧光探针由于不能穿透细胞膜，所以无法用于活细胞检测。

Majima等人合成了一种由含硅罗丹明和蒽环构成的新型远红外荧光探针Si-DMA，分别作为发色团和单线态氧反应位点。当存在单线态氧时会在Si-DMA的蒽环部位生成内过氧化物，Si-DMA的荧光强度会增强1)。在7种不同活性氧中，Si-DMA能够特异性地检测单线态氧（图3）。另外在用5-氨基乙酰丙酸（5-ALA，一种血红素前体）处理细胞后，Si-DMA可以实时观察到线粒体中原卟啉IX产生单线态氧的变化情况（图4）。

原理

图1. Si-DMA的细胞染色原理

荧光特性

图2. Si-DMA与单线态氧反应后的激发和发射光谱

反应特异性

图3. Si-DMA对各种ROS的选择性

实验例

实验例1  荧光显微镜观察用5-氨基乙酰丙酸 (5-ALA) 处理后的HeLa细胞中的单线态氧

1. 接种200 μl HeLa细胞 (2.4×105 cells/ml) 在μ-slide 8孔板 (ibidi) ，培养基为DMEM (10%FBS，1%青霉素-链霉素)，

在37℃ 5% CO2培养箱中过夜培养。

2. 用200 μl Hanks’ HEPES 缓冲液洗涤细胞2次。

3. 在μ-slide 8孔板中加入200 μl 含5-ALA的Hanks’ HEPES 缓冲液 (150 μg/ml)，在37℃ 5% CO2培养箱中培养4 h。

4. 用Hanks’ HEPES 缓冲液洗涤细胞2次。

5. 加入200 μl Si-DMA工作液(40 nmol/l)， 在37℃ 5% CO2培养箱中培养45 min。

6. 用200 μl Hanks’ HEPES缓冲液洗涤细胞2次。

7. 加入200 μl Hanks’ HEPES缓冲液，并用荧光显微镜进行观察。

Si-DMA检测5-ALA处理的HeLa细胞线粒体中的单线态氧的荧光成像

5-ALA处理过的HeLa细胞经过2.5 min照射后，Si-DMA的荧光增强，因此Si-DMA可以用于实时监测线粒体中原卟啉IX产生的单线态氧。

滤镜 (波长/带通型滤光片)

荧光成像：600±25 nm (Ex), 685±25 nm (Em)

实验例2  线粒体中的单线态氧检测 

用终浓度为50 μmol/l的过氧化氢和终浓度为50 μmol/l的次氯酸刺激或不刺激HeLa细胞，用Si-DMA检测到细胞中产生的单线态氧。和线粒体染料（MitoBright Green: MT06)共染，特异性地在线粒体中检测到了单线态氧。

波长（激发波长/发射波长）

Si-DMA: 600±25 nm/685±25 nm

MitoBright Green: 488 nm/501-563 nm

实验例3  观察用H2O2处理Primary Hepatocytes细胞后产生的单线态氧

Si-DMA检测用H2O2刺激Primary Hepatocytes细胞后产生的单线态氧荧光成像

实验条件：

用10 mM H2O2刺激Primary Hepatocytes 20 min。

细胞数量：1×104/dish

容器：Nest 15 mm共聚焦培养皿801002

染色条件：在37℃ 5% CO2培养箱中染色45 min

Si-DMA工作液浓度：100 nmol/l

检测仪器：激光共聚焦显微镜

仪器品牌：Leica,Cambridge, UK

仪器型号：BMI-6000

Ex:600 nm，Em: 685 nm

(以上数据由东方肝胆外科医院信号转导实验室友情提供)

常见问题Q&A

Q1、本试剂盒与现有方法相比有什么优势？
A1：本试剂盒的优点是“能够对活细胞进行荧光成像”和“对单线态氧的高选择性”。在操作说明中有详细的实验数据。
Q2、DMSO Stock Solution的稳定性怎么样？
A2：DMSO Stock Solution配制后在-20℃及避光条件下可以保存大约1个月，建议根据每次的用量进行分装保存。
Q3、配制Working Solution可以用Hanks’ HEPES以外的缓冲液吗？
A3：还可以用HBSS缓冲液。
Q4、Working Solution的稳定性怎么样？
A4：Working Solution不稳定，请在配制当天使用。

参考文献

NO         检测对象      检测仪器                                       论文名
1 HeLa;   RAW264.7细胞     荧光显微镜  “Far-Red Fluorescence Probe for Monitoring Singlet Oxygen during Photodyanamic Therapy“, J.Am.Chem.Soc., 2014,136 (33),11707.
2 CT26、TK6细胞     流式细胞仪  “Physical plasma elicits immunogenic cancer cell death and mitochondrial singlet oxygen“, TRPMS., 2017, 99, DOI:10.1109/TRPMS.2017.2766027.
3 HeLa、HEK293细胞     荧光显微镜  “Green monomeric photosensitizing fluorescent protein for photo-inducible protein inactivation and cell ablation “,BMC Biol., 2018, 16, 50.
4 RIN-m5f细胞     荧光显微镜  “Sonodynamic therapy inhibits palmitateinduced beta cell dysfunction via PINK1/ Parkin-dependent mitophagy“, Cell Death Dis., 2019, 10, 457.
5 HepG2、NIH3T3细胞     荧光显微镜

    流式细胞仪

        酶标仪

  “Quantitative kinetics of intracellular singlet oxygen generation using a fluorescence probe“, Sci.Rep., 2020, 10, 10616.

MT12/MitoBright LT Deep Red试剂

MT12/MitoBright LT Deep Red试剂,细胞内有各种各样的细胞器，承担着各种各样必须的生命活动。其中线粒体不仅是通过氧化磷酸化反应生成ATP 的场所，它还与癌症、细胞衰老、阿尔兹海默症、帕金森综合症等神经退行性疾病紧密相关，因此它是细胞内最重要的细胞器之一。

货号：MT12
线粒体长效荧光探针-深红色
MitoBright LT Deep Red
储存条件：-20度保存，避光
运输条件：室温

特点：

  1. 荧光持续时间长
  2. 可在含血清培养基中染色
  3. 荧光显微镜、流式细胞仪均可检测

选择规格：20 μl,400 μl

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NO.5. Liperfluo 细胞脂质过氧化物检测

产品概述

细胞内有各种各样的细胞器，承担着各种各样必须的生命活动。其中线粒体不仅是通过氧化磷酸化反应生成ATP 的场所，它还与癌症、细胞衰老、阿尔兹海默症、帕金森综合症等神经退行性疾病紧密相关，因此它是细胞内最重要的细胞器之一。

在对线粒体的形态和动态进行观察以及定量检测时，通常使用小分子荧光探针标记和荧光蛋白的基因转染两种方法。荧光蛋白的基因转染存在转染效率不稳定等情况，因此操作简便的小分子荧光探针的使用更为广泛。现在市面上销售的小分子荧光探针中，多为含有氯甲基的探针，该探针存在观察时间短，染色时不能使用含血清的培养基，染色后荧光背景高等问题。MitoBright LT 荧光探针克服了这些问题，可在线粒体内稳定存在一天以上，条件合适的情况下可达到一周。而且与含有氯甲基的探针相比，染色后的荧光强度更高。本品直接采用DMSO 溶液包装，可快速方便的进行线粒体染色。荧光颜色有Green, Red, Deep Red 等多种选择，可满足多重染色等各种各样的实验要求。

产品特点

1.可长时间在细胞内存在

用HBSS 清洗 HeLa 细胞后，分别用 MitoBright LT 和其他公司的试剂进行染色，更换含血清的培养基，培养 4 天后观察线粒体染色情况。其他公司的染色试剂在 4 天后荧光强度大幅降低，而 MitoBrightLT 依然维持着高荧光强度，并且在染色 7 日后依然可以观察到荧光。

＜检测条件＞

MitoBright LT Green 、（T 公司）Green：Ex：488 nm/Em:500–560 nm

MitoBright LT Red 、（T 公司）Red：Ex 561：nm/Em:560–620 nm

MitoBright LT Deep Red 、（T 公司）Deep Red：Ex：640 nm/Em:650–700 nm

2.可以使用含血清培养基

用MitoBright LT 和其他公司试剂，分别用含有血清和不含血清的培养基染色。其他公司试剂在含有血清的培养基染色时，荧光明显减弱，而 MitoBright LT 在含有血清的培养基条件下，荧光没有减弱，可明显观察到线粒体的染色情况。

3.线粒体的分裂和融合

用100 nmol/l MitoBrightLT Red将HeLa细胞染色后，换入无血清培养基30分钟后观察线粒体形态。

＜检测仪器＞

共聚焦显微镜，放大倍率：63倍

＜检测条件＞

Ex:561 nm/Em:560–620 nm

实验例

用流式细胞仪检测

1. 用RPMI 培养基(10% fetal bovine serum, 1% penicillin-streptomycin)配制Jurkat 细胞悬液(3.2×105cell/mL)播种于5 cm 培养皿，37℃，5% CO2 培养箱内培养一晚。

2. 去除培养基，加入MitoBright LT Working Solution (0.1 μmol/L, 5 mL)， 37℃培养30 分钟。

3. 去除溶液，用 5mL 的PRPMI 培养基清洗细胞2 次。

4. 添加RPMI 培养基，持续培养细胞，每隔2 天用流式细胞仪检测。

在胶原蛋白涂覆玻璃板上观察线粒体荧光成像

胶原蛋白涂覆玻璃板通常用于线粒体形态的高倍放大观察。

现有的线粒体染色试剂存在吸附胶原蛋白和升高背景的问题，但是MitoBright LT系列可以在不受背景影响的情况下清楚地对线粒体进行染色。

<染色条件>

将HeLa细胞接种在胶原蛋白涂覆玻璃板上，培养24小时，提取上清液并用HBSS洗涤。

加入100nmol / L的MitoBright LT Green工作溶液，培养30分钟后，提取上清液并用HBSS洗涤后用荧光显微镜观察。

<检测条件>

Ex488 nm，Em 500-560 nm

<结果>

现有的线粒体染色剂存在吸附胶原蛋白和升高背景的问题，但是MitoBright  LT系列可以清晰地对线粒体染色，而不受背景影响。

通过超分辨率激光显微镜（STED）观察线粒体内部构造

线粒体疾病致突变的Cybrid细胞用MitoBright-LT-Deep Red染色，用超分辨激光显微镜(STED)观察，证实线粒体嵴结构异常。

＜实验条件＞

色素：MitoBrightLT Deep Red（100nmol/l）

仪器：Leica超分辨率激光显微镜TCS SP8 STED 3X

Ex. 640 nm / Em. 650-700 nm

STED激光：775nm

<实验步骤>

1将细胞接种在玻璃培养皿中，培养2天（37℃，5% CO2）。

2去除培养基后，加入使用L-15培养基（含10%FBS）制备的MitoBrightLT Deep Red（100nmol/l）工作液。

3孵育45分钟（37度，5% CO2）。

4去除上清液，用HBSS清洗两次。

5加入L-15培养基（含10%FBS），通过超分辨率激光显微镜（Leica TCS SP8 STED）进行观察。

以上数据由东京都老年学研究所衰老控制研究小组的大澤郁朗博士和藤田泰典博士友情提供。

产品文献

研究所开发的线粒体长效染色荧光探针MitoBright LT系列在世界范围内广受科研人员的好评。在上市后的很短时间内，就出现了多篇使用MitoBright LT系列探针的论文，下面收集整理了部分的论文，其中红色字体标记的是使用本产品标记线粒体后，长时间(最长至5天)观察线粒体动态的报道，供感兴趣的科研人员参考。

产品名

检测样品

染色后的
观察时间

检测仪器

发表期刊(含原文链接)

影响因子

MitoBright   LT Green

细胞 (U251)

立即

荧光显微镜

Pharmaceuticals

4.286

MitoBright   LT Green

酵母 (Lipomyces starkeyi)

立即

荧光显微镜

Genes to Cells

1.655

MitoBright   LT Green

细胞 (HeLa)

立即

荧光酶标仪

Biomaterials

10.317

MitoBright   LT Green

细胞 (Naive CD4+ T cells)

立即

荧光显微镜

Cell Reports

9.423

MitoBright   LT Green

细胞 (CT26)

立即

流式细胞仪

Journal of Radiation Research

2.841

MitoBright   LT Green

细胞 (C2C12)

5 天

荧光显微镜

Polymers

4.329

MitoBright   LT Green

细胞 (BMM)

36 小时 or

3 天 

荧光显微镜/
流式细胞仪

JCI Insights

8.315

MitoBright   LT Green

细胞 (mouse erythrocytes)

立即

荧光显微镜

Front.   Cell. Infect. Microbiol.

5.293

MitoBright   LT Red

细胞 (SH-SY5Y)

立即

荧光显微镜

Free Radical Biol.   Med.

7.376

MitoBright   LT Red

细胞 (MRC-5)

立即

荧光显微镜

The   FEBS Journal

5.542

MitoBright   LT Red

细胞 (A11   cells/ P29 cells)

3 天

荧光显微镜

BMC Mol. Cell Biol.

5.293

MitoBright   LT Deep Red

细胞 (HT-1080;   MCF-10A; MCF-7; HCT-116 )

立即

荧光显微镜

Small

13.281

MitoBright   LT Deep Red

细胞 (HT-1080;   MCF-10A; MCF-7 )

8 小时

荧光显微镜

Advanced Therapeutics

–

MitoBright   LT Deep Red

细胞 (4T1)

24 小时

 荧光显微镜

Advanced Functional Materials

18.808

MitoBright   LT Deep Red

细胞 (SW982)

立即

荧光显微镜

Gene

3.368

 

荧光特性

MitoBright LT 染料的荧光特性

常见问题Q&A

Q1：MitoBright LT需要用DMSO溶液配制，反复冻结融化也不会影响试剂质量吗？
A1：我们已经确认可以使用冻融30次的溶液进行染色。
Q2：MitoBright LT和MitoBright的区别。
A2：MitoBright LT是MitoBright具有更强细胞内滞留性性能的产品。另外MitoBright LT是溶于DMSO的产品，可以立即使用，而无需准备染色溶液。

Q3：用MitoBright LT系列染色后再去极化是否会影响染色效果？
A3：我们确认了去极化和细胞种类对于染色效果的影响，MitoBright LT的每种染料都有不同程度的影响。作为参考，本公司将HeLa细胞用不同的MitoBrightLT试剂进行染色，在以下条件下进行去极化处理，观察荧光染色的变化。
<染色条件>
HeLa细胞用MitoBright LT（100 μmol/l，孵育30分钟）染色，并用HBSS洗涤。
用FCCP（100 μmol/l，孵育60分钟）处理，用HBSS洗涤2次，然后观察荧光。

<检测条件>

MitoBright LT Green :Ex 488 nm/Em 500–560 nm

MitoBright LT Red :Ex 561 nm/Em 560–620 nm

MitoBright LT Deep Red :Ex 640 nm/Em 650–700 nm

规格性状

性状：本品是黄色液体

吸光度：0.600～0.800(490 nm附近）

MT11/MitoBright LT Red试剂

MT11/MitoBright LT Red试剂,细胞内有各种各样的细胞器，承担着各种各样必须的生命活动。其中线粒体不仅是通过氧化磷酸化反应生成ATP 的场所，它还与癌症、细胞衰老、阿尔兹海默症、帕金森综合症等神经退行性疾病紧密相关，因此它是细胞内最重要的细胞器之一。

货号：MT11
线粒体长效荧光探针-红色
MitoBright LT Red
储存条件：-20度保存，避光
运输条件：室温

特点：

  1. 荧光持续时间长
  2. 可在含血清培养基中染色
  3. 荧光显微镜、流式细胞仪均可检测

选择规格：20 μl,400 μl

产品概述

细胞内有各种各样的细胞器，承担着各种各样必须的生命活动。其中线粒体不仅是通过氧化磷酸化反应生成ATP 的场所，它还与癌症、细胞衰老、阿尔兹海默症、帕金森综合症等神经退行性疾病紧密相关，因此它是细胞内最重要的细胞器之一。

在对线粒体的形态和动态进行观察以及定量检测时，通常使用小分子荧光探针标记和荧光蛋白的基因转染两种方法。荧光蛋白的基因转染存在转染效率不稳定等情况，因此操作简便的小分子荧光探针的使用更为广泛。现在市面上销售的小分子荧光探针中，多为含有氯甲基的探针，该探针存在观察时间短，染色时不能使用含血清的培养基，染色后荧光背景高等问题。MitoBright LT 荧光探针克服了这些问题，可在线粒体内稳定存在一天以上，条件合适的情况下可达到一周。而且与含有氯甲基的探针相比，染色后的荧光强度更高。本品直接采用DMSO 溶液包装，可快速方便的进行线粒体染色。荧光颜色有Green, Red, Deep Red 等多种选择，可满足多重染色等各种各样的实验要求。

产品特点

1.可长时间在细胞内存在

用HBSS 清洗 HeLa 细胞后，分别用 MitoBright LT 和其他公司的试剂进行染色，更换含血清的培养

基，培养4天后观察线粒体染色情况。其他公司的染色试剂在4天后荧光强度大幅降低，而MitoBright

LT 依然维持着高荧光强度，并且在染色7日后依然可以观察到荧光。

＜检测条件＞

MitoBright LT Green 、（T 公司）Green：Ex：488 nm/Em：500–560 nm

MitoBright LT Red 、（T 公司）Red：Ex：561 nm/Em：560–620 nm

MitoBright LT Deep Red 、（T 公司）Deep Red：Ex：640 nm/Em：650–700 nm

2.可以使用含血清培养基

用MitoBright LT 和其他公司试剂，分别用含有血清和不含血清的培养基染色。其他公司试剂在含有血清的培养基染色时，荧光明显减弱，而 MitoBright LT 在含有血清的培养基条件下，荧光没有减弱，可明显观察到线粒体的染色情况。

3.荧光显微镜观察

HeLa细胞用CCCP处理，并与线粒体检测试剂（Mtphagy Dye）和线粒体染色试剂（MitoBright LT Green）共同染色，并经过一段时间（6小时）后进行检测。

检测条件>

设备：LSM-700 Laser scanning confocal microscope (LSCM)

(Carl Zeiss, Oberkochen, Germany)

激发波长：

MitoBright LT Green 488 nm

Mtphagy Dye      555 nm

物镜：63x

拍摄时间：6小时

拍摄间隔：15秒

实验例

用流式细胞仪检测

1. 用RPMI 培养基(10% fetal bovine serum, 1% penicillin-streptomycin)配制Jurkat 细胞悬液(3.2×105cell/ml)播种于5 cm 培养皿，37℃，5% CO2培养箱内培养一晚。

2. 去除培养基，加入MitoBright LT Working Solution (0.1 μmol/L,5 ml)， 37℃培养30 分钟。

3. 去除溶液，用 5mL 的PRPMI 培养基清洗细胞2次。

4. 添加RPMI培养基，持续培养细胞，每隔2天用流式细胞仪检测。

在胶原蛋白涂覆玻璃板上观察线粒体荧光成像

胶原蛋白涂覆玻璃板通常用于线粒体形态的高倍放大观察。

现有的线粒体染色试剂存在吸附胶原蛋白和升高背景的问题，但是MitoBright LT系列可以在不受背景影响的情况下清楚地对线粒体进行染色。

<染色条件>

将HeLa细胞接种在胶原蛋白涂覆玻璃板上，培养24小时，提取上清液并用HBSS洗涤。

加入100nmol / L的MitoBright LT Green工作溶液，培养30分钟后，提取上清液并用HBSS洗涤后用荧光显微镜观察。

<检测条件>

Ex：488 nm，Em：500-560 nm

<结果>

现有的线粒体染色剂存在吸附胶原蛋白和升高背景的问题，但是MitoBright  LT系列可以清晰地对线粒体染色，而不受背景影响。

通过超分辨率激光显微镜（STED）观察线粒体内部构造

线粒体疾病致突变的Cybrid细胞用MitoBright-LT-Deep Red染色，用超分辨激光显微镜(STED)观察，证实线粒体嵴结构异常。

＜实验条件＞

色素：MitoBrightLT Deep Red（100 nmol/l）

仪器：Leica超分辨率激光显微镜TCS SP8 STED 3X

Ex：640 nm / Em： 650-700 nm

STED激光：775nm

<实验步骤>

1将细胞接种在玻璃培养皿中，培养2天（37℃，5% CO2）。

2去除培养基后，加入使用L-15培养基（含10%FBS）制备的MitoBrightLT Deep Red（100 nmol/l）工作液。

3孵育45分钟（37度，5% CO2）。

4去除上清液，用HBSS清洗两次。

5加入L-15培养基（含10%FBS），通过超分辨率激光显微镜（Leica TCS SP8 STED）进行观察。

以上数据由东京都老年学研究所衰老控制研究小组的大澤郁朗博士和藤田泰典博士友情提供。

产品文献

研究所开发的线粒体长效染色荧光探针MitoBright LT系列在世界范围内广受科研人员的好评。在上市后的很短时间内，就出现了多篇使用MitoBright LT系列探针的论文，下面收集整理了部分的论文，其中红色字体标记的是使用本产品标记线粒体后，长时间(最长至5天)观察线粒体动态的报道，供感兴趣的科研人员参考。

产品名

检测样品

染色后的
观察时间

检测仪器

发表期刊(含原文链接)

影响因子

MitoBright   LT Green

细胞 (U251)

立即

荧光显微镜

Pharmaceuticals

4.286

MitoBright   LT Green

酵母 (Lipomyces starkeyi)

立即

荧光显微镜

Genes to Cells

1.655

MitoBright   LT Green

细胞 (HeLa)

立即

荧光酶标仪

Biomaterials

10.317

MitoBright   LT Green

细胞 (Naive CD4+ T cells)

立即

荧光显微镜

Cell Reports

9.423

MitoBright   LT Green

细胞 (CT26)

立即

流式细胞仪

Journal of Radiation Research

2.841

MitoBright   LT Green

细胞 (C2C12)

5 天

荧光显微镜

Polymers

4.329

MitoBright   LT Green

细胞 (BMM)

36 小时 or

3 天 

荧光显微镜/
流式细胞仪

JCI Insights

8.315

MitoBright   LT Green

细胞 (mouse erythrocytes)

立即

荧光显微镜

Front.   Cell. Infect. Microbiol.

5.293

MitoBright   LT Red

细胞 (SH-SY5Y)

立即

荧光显微镜

Free Radical Biol.   Med.

7.376

MitoBright   LT Red

细胞 (MRC-5)

立即

荧光显微镜

The   FEBS Journal

5.542

MitoBright   LT Red

细胞 (A11   cells/ P29 cells)

3 天

荧光显微镜

BMC Mol. Cell Biol.

5.293

MitoBright   LT Deep Red

细胞 (HT-1080;   MCF-10A; MCF-7; HCT-116 )

立即

荧光显微镜

Small

13.281

MitoBright   LT Deep Red

细胞 (HT-1080;   MCF-10A; MCF-7 )

8 小时

荧光显微镜

Advanced Therapeutics

–

MitoBright   LT Deep Red

细胞 (4T1)

24 小时

 荧光显微镜

Advanced Functional Materials

18.808

MitoBright   LT Deep Red

细胞 (SW982)

立即

荧光显微镜

Gene

3.368

 

荧光特性

MitoBright LT 染料的荧光特性

常见问题Q&A

Q1：MitoBright LT需要用DMSO溶液配制，反复冻结融化也不会影响试剂质量吗？
A1：我们已经确认可以使用冻融30次的溶液进行染色。
Q2：MitoBright LT和MitoBright的区别。
A2：MitoBright LT是MitoBright具有更强细胞内滞留性性能的产品。另外MitoBright LT是溶于DMSO的产品，可以立即使用，而无需准备染色溶液。

Q3：用MitoBright LT系列染色后再去极化是否会影响染色效果？

A3：我们确认了去极化和细胞种类对于染色效果的影响，MitoBright LT的每种染料都有不同程度的影响。作为参考，本公司将HeLa细胞用不同的MitoBrightLT试剂进行染色，在以下条件下进行去极化处理，观察荧光染色的变化。

<染色条件>

HeLa细胞用MitoBright LT（100 μmol/l，孵育30分钟）染色，并用HBSS洗涤。

用FCCP（100 μmol/l，孵育60分钟）处理，用HBSS洗涤2次，然后观察荧光。

<检测条件>

MitoBright LT Green         :Ex 488 nm/Em 500–560 nm

MitoBright LT Red            :Ex 561 nm/Em 560–620 nm

MitoBright LT Deep Red     :Ex 640 nm/Em 650–700 nm

规格性状

性状：本品是黄色液体

吸光度：0.600～0.800(490 nm附近）

MT10/MitoBright LT Green试剂

MT10/MitoBright LT Green试剂,细胞内有各种各样的细胞器，承担着各种各样必须的生命活动。其中线粒体不仅是通过氧化磷酸化反应生成ATP的场所，它还与癌症、细胞衰老、阿尔兹海默症、帕金森综合症等神经退行性疾病紧密相关，因此它是细胞内最重要的细胞器之一。

货号：MT10
线粒体长效荧光探针-绿色
MitoBright LT Green
储存条件：-20度保存
运输条件：室温

特点：

荧光持续时间长
可在含血清培养基中染色
荧光显微镜、流式细胞仪均可检测

选择规格：20 μl,400 μl

关联产品TOP5

NO.1. Mitophagy Detection Kit 线粒体自噬检测
NO.2. FerroOrange 细胞亚铁离子检测
NO.3. DALGreen – Autophagy Detection 细胞自噬检测
NO.4. Liperfluo 细胞脂质过氧化物检测
NO.5. Lactate Assay Kit-WST 乳酸检测

产品概述

细胞内有各种各样的细胞器，承担着各种各样必须的生命活动。其中线粒体不仅是通过氧化磷酸化反应生成ATP的场所，它还与癌症、细胞衰老、阿尔兹海默症、帕金森综合症等神经退行性疾病紧密相关，因此它是细胞内最重要的细胞器之一。

在对线粒体的形态和动态进行观察以及定量检测时，通常使用小分子荧光探针标记和荧光蛋白的基因转染两种方法。荧光蛋白的基因转染存在转染效率不稳定等情况，因此操作简便的小分子荧光探针的使用更为广泛。现在市面上销售的小分子荧光探针中，多为含有氯甲基的探针，该探针存在观察时间短，染色时不能使用含血清的培养基，染色后荧光背景高等问题。MitoBright LT荧光探针克服了这些问题，可在线粒体内稳定存在一天以上，条件合适的情况下可达到一周。而且与含有氯甲基的探针相比，染色后的荧光强度更高。本品直接采用DMSO溶液包装，可快速方便的进行线粒体染色。荧光颜色有Green, Red, Deep Red等多种选择，可满足多重染色等各种各样的实验要求。

产品特点

1.可长时间在细胞内存在

用HBSS清洗HeLa细胞后，分别用MitoBright LT和其他公司的试剂进行染色，更换含血清的培养基，培养4天后观察线粒体染色情况。其他公司的染色试剂在4天后荧光强度大幅降低，而MitoBright LT依然维持着高荧光强度，并且在染色7日后依然可以观察到荧光。

＜检测条件＞

MitoBright LT Green 、（T公司）Green：Ex 488 nm/Em 500–560 nm

MitoBright LT Red 、（T公司）Red：Ex 561 nm/Em 560–620 nm

MitoBright LT Deep Red 、（T公司）Deep Red：Ex 640 nm/Em 650–700 nm

2.可以使用含血清培养基

用MitoBright LT和其他公司试剂，分别用含有血清和不含血清的培养基染色。其他公司试剂在含有血清的培养基染色时，荧光明显减弱，而MitoBright LT在含有血清的培养基条件下，荧光没有减弱，可明显观察到线粒体的染色情况。

实验例

实时荧光观察

HeLa细胞用CCCP处理，并与线粒体检测试剂（Mtphagy Dye）和线粒体染色试剂（MitoBright LT Green）共同染色，并经过一段时间（6小时）后进行检测。

<检测条件>

设备：LSM-700 Laser scanning confocal microscope (LSCM)

(Carl Zeiss, Oberkochen, Germany)

激发波长：

MitoBright LT Green 488 nm

Mtphagy Dye      555 nm

物镜：63x

拍摄时间：6小时

拍摄间隔：15秒

用流式细胞仪检测

1. 用RPMI培养基(10% Fetal Bovine Serum, 1% Penicillin-Streptomycin)配制Jurkat细胞悬液(3.2×105cell/ml)接种于5 cm培养皿中，在37℃，5% CO2培养箱内过夜培养。

2. 去除培养基，加入MitoBright LT Working Solution (0.1 μmol/l, 5 ml)， 在37℃培养30分钟。

3. 去除溶液，用 5 ml的PRPMI培养基清洗细胞2 次。

4. 更换RPMI培养基，持续培养细胞，每隔2 天用流式细胞仪检测。

在胶原蛋白涂覆玻璃板上观察线粒体荧光成像

胶原蛋白涂覆玻璃板通常用于线粒体形态的高倍放大观察。

现有的线粒体染色试剂存在吸附胶原蛋白和升高背景的问题，但是MitoBright LT系列可以在不受背景影响的情况下清楚地对线粒体进行染色。

<染色条件>

将HeLa细胞接种在胶原蛋白涂覆玻璃板上，培养24小时，提取上清液并用HBSS洗涤。

加入100 nmol/l的MitoBright LT Green工作溶液，培养30分钟后，提取上清液并用HBSS洗涤后用荧光显微镜观察。

<检测条件>

Ex 488 nm，Em 500-560 nm

<结果>

现有的线粒体染色剂存在吸附胶原蛋白和升高背景的问题，但是MitoBright  LT系列可以清晰地对线粒体染色，而不受背景影响。

通过超分辨率激光显微镜（STED）观察线粒体内部构造

线粒体疾病致突变的Cybrid细胞用MitoBright-LT-Deep Red染色，用超分辨激光显微镜(STED)观察，证实线粒体嵴结构异常。

＜实验条件＞

色素：MitoBrightLT Deep Red（100 nmol/l）

仪器：Leica超分辨率激光显微镜TCS SP8 STED 3X

Ex. 640 nm / Em. 650-700 nm

STED激光：775nm

<实验步骤>

1将细胞接种在玻璃培养皿中，培养2天（37℃，5% CO2）。

2去除培养基后，加入使用L-15培养基（含10%FBS）制备的MitoBrightLT Deep Red（100 nmol/l）工作液。

3孵育45分钟（37度，5% CO2）。

4去除上清液，用HBSS清洗两次。

5加入L-15培养基（含10%FBS），通过超分辨率激光显微镜（Leica TCS SP8 STED）进行观察。

以上数据由东京都老年学研究所衰老控制研究小组的大澤郁朗博士和藤田泰典博士友情提供。

产品文献

开发的线粒体长效染色荧光探针MitoBright LT系列在世界范围内广受科研人员的好评。在上市后的很短时间内，就出现了多篇使用MitoBright LT系列探针的论文，下面收集整理了部分的论文，其中红色字体标记的是使用本产品标记线粒体后，长时间(最长至5天)观察线粒体动态的报道，供感兴趣的科研人员参考。

产品名

检测样品

染色后的
观察时间

检测仪器

发表期刊(含原文链接)

影响因子

MitoBright   LT Green

细胞 (U251)

立即

荧光显微镜

Pharmaceuticals

4.286

MitoBright   LT Green

酵母 (Lipomyces starkeyi)

立即

荧光显微镜

Genes to Cells

1.655

MitoBright   LT Green

细胞 (HeLa)

立即

荧光酶标仪

Biomaterials

10.317

MitoBright   LT Green

细胞 (Naive CD4+ T cells)

立即

荧光显微镜

Cell Reports

9.423

MitoBright   LT Green

细胞 (CT26)

立即

流式细胞仪

Journal of Radiation Research

2.841

MitoBright   LT Green

细胞 (C2C12)

5 天

荧光显微镜

Polymers

4.329

MitoBright   LT Green

细胞 (BMM)

36 小时 or

3 天 

荧光显微镜/
流式细胞仪

JCI Insights

8.315

MitoBright   LT Green

细胞 (mouse erythrocytes)

立即

荧光显微镜

Front.   Cell. Infect. Microbiol.

5.293

MitoBright   LT Red

细胞 (SH-SY5Y)

立即

荧光显微镜

Free Radical Biol.   Med.

7.376

MitoBright   LT Red

细胞 (MRC-5)

立即

荧光显微镜

The   FEBS Journal

5.542

MitoBright   LT Red

细胞 (A11   cells/ P29 cells)

3 天

荧光显微镜

BMC Mol. Cell Biol.

5.293

MitoBright   LT Deep Red

细胞 (HT-1080;   MCF-10A; MCF-7; HCT-116 )

立即

荧光显微镜

Small

13.281

MitoBright   LT Deep Red

细胞 (HT-1080;   MCF-10A; MCF-7 )

8 小时

荧光显微镜

Advanced Therapeutics

–

MitoBright   LT Deep Red

细胞 (4T1)

24 小时

 荧光显微镜

Advanced Functional Materials

18.808

MitoBright   LT Deep Red

细胞 (SW982)

立即

荧光显微镜

Gene

3.368

荧光特性

MitoBright LT 染料的荧光特性

常见问题Q&A

Q1：MitoBright LT需要用DMSO溶液配制，反复冻结融化也不会影响试剂质量吗？
A1：我们已经确认可以使用冻融30次的溶液进行染色。
Q2：MitoBright LT和MitoBright的区别。
A2：MitoBright LT是MitoBright具有更强细胞内滞留性性能的产品。另外MitoBright LT是溶于DMSO的产品，可以立即使用，而无需准备染色溶液。

Q3：用MitoBright LT系列染色后再去极化是否会影响染色效果？

A3：我们确认了去极化和细胞种类对于染色效果的影响，MitoBright LT的每种染料都有不同程度的影响。作为参考，本公司将HeLa细胞用不同的MitoBrightLT试剂进行染色，在以下条件下进行去极化处理，观察荧光染色的变化。
<染色条件>

HeLa细胞用MitoBright LT（100 μmol/l，孵育30分钟）染色，并用HBSS洗涤。

用FCCP（100 μmol/l，孵育60分钟）处理，用HBSS洗涤2次，然后观察荧光。

<检测条件>

MitoBright LT Green         :Ex 488 nm/Em 500–560 nm

MitoBright LT Red            :Ex 561 nm/Em 560–620 nm

MitoBright LT Deep Red     :Ex 640 nm/Em 650–700 nm

规格性状

性状：本品是黄色液体

吸光度：0.600～0.800(490 nm附近）

MT09/JC-1 MitoMP Detection Kit-线粒体膜电位检测试剂盒

MT09/JC-1 MitoMP Detection Kit-线粒体膜电位检测试剂盒,细胞中的线粒体作为有氧呼吸产生ATP的主要场所，是体内重要的细胞器之一，常被用于早期细胞毒性、氧化应激、细胞凋亡等研究中1)。线粒体活性的降低与机能失调，已被证实与癌症、衰老、神经退行性疾病 (如阿尔兹海默症、帕金森病等) 等密切相关2)3)。

货号：MT09
线粒体膜电位检测试剂盒
JC-1 MitoMP Detection Kit
储存条件：0-5度保存
运输条件：室温

特点：

灵敏度高
易上手
多种仪器均可检测

选择规格：1set

关联产品TOP5

NO.1. Cell Counting Kit-8 细胞增殖毒性检测
NO.2. ROS Assay Kit 活性氧检测
NO.3. FerroOrange 细胞亚铁离子检测
NO.4. GSSG/GSH Quantification Kit II 氧化型/还原型谷胱甘肽
NO.5. Mitophagy Detection Kit 线粒体自噬检测

试剂盒内含

1 set
JC-1 Dye 100 nmolx1
lmaging Buffer (10x) 11 mlx1

产品概述

细胞中的线粒体作为有氧呼吸产生ATP的主要场所，是体内重要的细胞器之一，常被用于早期细胞毒性、氧化应激、细胞凋亡等研究中1)。线粒体活性的降低与机能失调，已被证实与癌症、衰老、神经退行性疾病 (如阿尔兹海默症、帕金森病等) 等密切相关2)3)。

JC-1是一种被广泛使用的小分子线粒体膜电位探针，依赖于线粒体膜电位在线粒体中聚集，染料伴随聚集过程，荧光从绿色 (530 nm) 变为红色 (590 nm)。当线粒体发生去极化，红/绿荧光强度比值降低。以往的研究者反映，JC-1不易溶于水并有大量沉淀产生。但与其他公司的产品不同，同仁化学研究所研制的JC-1试剂解决了这一问题，避免了沉淀的产生。同时使用试剂盒中配制的成像缓冲液 (Imaging Buffer)，可大幅降低荧光背景并在检测过程中保护细胞不受损伤。

当JC-1工作液的浓度为2 μmol/l, 每次用量为100 μl时，可以检测500次。

产品特点

1.为什么要检测线粒体膜电位

线粒体不仅是细胞内产生能量的场所，它还与癌症、衰老、阿尔兹海默症、帕金森等神经变异性疾病密切相关。因此，针对线粒体状态的研究非常重要，其中线粒体膜电位的变化经常被作为重要的指标之一检测。

当线粒体正常、膜电位差保持不变时，JC-1会聚集并发出红色荧光，而当膜电位降低时，JC-1会作为单体存在并发出绿色荧光。红色和绿色荧光强度的变化可以作为检测线粒体状态的指标。

2.初次使用也很容易上手

3.去极化的检测实例

使用去极化剂carbonylcyanide-p-trifluoromethoxyphenylhydrazone（FCCP）对HeLa细胞进行处理，用本试

剂盒进行检测。可以发现与未加药物的细胞相比，加药组细胞的红色荧光明显减少。

实验条件

JC-1浓度： 2 μmol/l in MEM, 染色时间30 min

FCCP浓度：100 μmol/l， FCCP处理时间1 h

检测条件

Green : Ex 488 nm/ Em 500-550 nm;

Red : Ex 561 nm/ Em 560-610 nm;

标尺: 20 μm

操作步骤

 

实验例

1.诱导凋亡的实验例

1.1 荧光显微镜

通过荧光颜色的改变判断由凋亡导致的线粒体膜电位的变化。

 

检测条件

Green: Ex 488 nm / Em 500-550 nm

Red : Ex 561 nm / Em 560-610 nm

标尺: 80 μm

1.2 流式细胞仪

定量分析单个细胞的膜电位变化

检测条件

Green: Ex 488 nm / Em 515-545 nm

Red : Ex 488 nm / Em 564-604 nm

1.3 酶标仪

确认孔板中吸光度来判断线粒体膜电位的变化

检测条件

Green: Ex 485 nm / Em 525-545 nm

Red : Ex 535 nm / Em 585-605 nm

2.诱导自噬的实验例

使用表达Parkin的HeLa细胞，分别使用线粒体自噬试剂盒（Mitophagy Detection Kit：MD01）和线粒体膜电位检测试剂盒（JC-1 MitoMP Detection Kit： MT09）来观察添加和不添加CCCP（羰基氰化物间氯苯）的线粒体状态的变化。

结果证明在未经CCCP处理的细胞中几乎未检测到线粒体自噬的发生，并且线粒体膜电位正常维持。 而在添加了CCCP的细胞中，证实了线粒体膜电位的降低（JC-1的红色荧光的降低）和线粒体的自噬（Mtphagy染料的荧光的增强）。

<检测条件>

线粒体自噬检测

Ex：561 nm，Em：570-700 nm

线粒体膜电位检测

绿色Ex：488 nm，Em：500-550 nm

红色Ex：561 nm，Em：560-610 nm

实验条件

1.将Parkin质粒导入HeLa细胞

使用HilyMax（货号：H357）将Parkin质粒引入HeLa细胞中（Parkin质粒/HilyMax试剂：0.1 μg/0.2 μl）

然后过夜培养，收集细胞进行以下检测。

2.自噬检测

向表达Parkin的HeLa细胞中添加0.1 μmol/l Mtphagy工作溶液，并在37°C下孵育30分钟。然后将细胞用HBSS洗涤，加入10 μg/ml CCCP/MEM溶液，并在37℃下孵育2小时。荧光显微镜下观察处理后的细胞。

3.线粒体膜电位检测

将10 μg/ml的CCCP/MEM溶液添加至表达Parkin的HeLa细胞中，并在37℃下孵育1.5小时。加入4 μmol/l的JC-1工作溶液使终浓度至2 μmol/l，并将细胞溶液在37℃下孵育30分钟。孵育后将细胞用HBSS洗涤，加入成像缓冲液，在荧光显微镜下观察细胞。

3.线粒体膜电位与细胞周期关联性

将已知能在细胞周期的G2/M期起作用以终止细胞增殖并诱导细胞衰老的阿霉素（DOX）加入A549细胞后，

使用细胞周期检测试剂盒蓝色（产品代码：C549）/深红色（产品代码：C548）后检测。

结果证实了A549细胞的细胞周期确实发生了变化，同时用细胞衰老检测试剂盒–SPiDER-βGal（产品代码：SG03）证实了细胞产生衰老，实验证实了线粒体膜电位会发生变化。

参考文献

文献No. 检测对象 检测仪器 引用
1) 细胞（U2OS, HeLa） 荧光显微镜 T.     Namba, “BAP31 regulates mitochondrial function via   interaction with   Tom40 within ER-mitochondria contact sites   “, Sci   Adv., 2019, 5, (6), 1386.
2) 细胞（Neuron） 荧光显微镜 I.   Kawahata, L. Luc   Bousset, R. Melki and K.   Fukunaga , “Fatty   Acid-Binding Protein 3 is Critical   for α-Synuclein Uptake and MPP+-Induced   Mitochondrial Dysfunction in   Cultured Dopaminergic Neurons “, Int J   Mol   Sci., 2019, 20, 5358.
3) 细胞（3T3L1, C2C12） 流式细胞仪 M.   Kurano, K. Tsukamoto, T.   Shimizu, H. Kassai, K. Nakao, A. Aiba, M.   Hara and   Yatomi , “Protection Against Insulin   Resistance by   Apolipoprotein M/Sphingosine     1-Phosphate “, Diabetes, 2020, DOI:     10.2337/db19-0811.
4) 细胞 流式细胞仪 T.   Nechiporuk, S.E. Kurtz, O.   Nikolova, T. Liu, C.L. Jones, A. D.   Alessandro, R. C. Hill, A. Almeida, S. K.   Joshi, M. Rosenberg, C. E.   Tognon, A. V. Danilov, B. J. Druker, B. H. Chang,   S. K McWeeney and J.   W. Tyner , “The TP53 Apoptotic Network Is   a Primary   Mediator of Resistance to BCL2 Inhibition in AML     Cells.”, Cancer Discov, 2019, 9,
5) 细胞 荧光显微镜 G.   Yang, M.   Fan, J. Zhu, C. Ling, L. Wu, X. Zhang, M. Zhang, J. Li, Q.   Yao, Z. Gu and X.   Cai, “A multifunctional anti-inflammatory   drug that can   specifically target activated   macrophages  massively deplete   intracellular H2O2 and   produce large amounts CO for a highly efficient   treatment of     osreoarthritis”  , Biomaterials, 2020,  doi:10.1016/j.biomaterials.2020.120155.
6) 细胞（ARPE-19) 荧光显微镜 J.   H. Quan, F. F. Gao, H.   A. Ismail, J. M.  Yuk, G. H. Cha, J. Q.   Chu and Y. H.   Lee,  “Silver Nanoparticle-Induced   Apoptosis in ARPE-19 Cells   Is Inhibited by Toxoplasma gondii   Pre-Infection Through Suppression of   NOX4-Dependent ROS   Generation”, Int J   Nanomedicine , 2020, 15,   3695–3716.

常见问题Q&A

Q1: 本试剂盒可以检测多少次？

A1:大概的使用次数请参考下表：

检测装置 容器 使用次数 液量
流式细胞仪 – 100次 0.5 ml/次
荧光显微镜
荧光酶标仪		 35 mm dish 25次 2 ml/孔
8孔Chamber Slide 30次 200 μl/孔
96孔板 5次 100 μl/孔

Q2：在JC-1染色后，可以使用PBS代替HBSS洗涤吗？

A2：我们建议使用HBSS来减少对细胞的损伤。如果您手边没有HBSS的话，建议使用培养基洗净。

Q3：可以使用含血清的培养基吗？

A3：在清洗细胞和Working Solution中可以使用含血清的培养基。在观察荧光时建议使用Imaging Buffer。如果一定要使用含血清的培养基的话，建议不要加酚红。

Q4：染色后细胞固定或者固定后进行染色可以实现吗？

A4：细胞固定操作会使得线粒体去极化，所以染色前后均不能进行细胞固定。

Q5：处理后的样品与对照组相比较，红和绿两种荧光值都增加（或减少）了，结果该如何解释？

A5：请先比较实验组和对照组的荧光比值，两者相比，荧光比越低，线粒体膜电位越低。

用荧光之比进行结果分析的理由。

JC-1由于膜电位依存性地在细胞中积蓄，根据细胞的状态，每个细胞的JC-1的浓度有可能不同。

由于对照组和实验组处理样品的细胞状态不同，JC-1的累积浓度不同。)

另外，在线粒体膜电位较高的状态下，JC-1会聚集在一起，使荧光从绿色转移到红色。

该聚集体的量取决于膜电位的程度，因此可以用红/绿之比来比较样品之间的线粒体膜电位。

＜参考文献＞

1) Cossarizza, A. et al., Biochem Biophys Res Commun., 1993, 197(1), 40.

2) Perelman, A. et al., Cell Death and Disease, 2012, 3, e430

3) Smiley, S. T. et al., Proc. Nail. Acad. Sci., 1991, 88, 3671.