货号：CK04
细胞增殖-毒性检测试剂盒CCK-8(CCK8)
Cell Counting Kit-8
储存条件：0-5度保存
运输条件：室温
特点：
- CCK-8为本司DOJINDO最早研发
- 高分文献超10000+篇
- 试剂盒稳定性高。
- 试剂可以与酚红同时使用。
选择规格：100 tests,500 tests,1000 tests,3000 tests,10000 tests
性能简介
Cell Counting Kit-8是用于化学药物等对细胞增殖或毒性实验时进行细胞计数的试剂盒。试剂盒中使用高灵敏度的新型水溶性四唑盐WST-8甲臜染料作为显色底物，与传统的细胞计数试剂盒相比，灵敏度大幅度的提高。WST-8被细胞内的脱氢酶还原产生水溶性的甲臜染料。通过直接测量甲臜染料（450 nm）的吸光度，即可测出活细胞的数量。细胞数量与甲臜染料成正比关系。同时试剂盒为配置好的1瓶溶液，易于使用。
产品特点
1）对比[3H]法，无需放射性同位素。
2）使用水溶性四唑盐与水溶性甲臜染料，因此无需DMSO换液操作步骤。（如MTT分析等需要）
3）与其他水溶性四唑盐法（XTT，MTS）相比，灵敏度更高的同时毒性更低。
4）试剂盒为1瓶装，无需提前配置，无需准备其他试剂。
5）试剂盒稳定性高。
6）试剂可以与酚红同时使用。
原理
Cell Counting Kit-8 (CCK-8) 包含了Dojindo开发的水溶性四唑盐—WST®-8和电子载体(1-Methoxy PMS)。由于WST®-8具有高水溶性，它存在于细胞外而不渗透活细胞膜，通过1-Methoxy PMS接受乳酸脱氢酶的辅酶NADH的电子而被还原，生成水溶性WST®-8甲臜染料（最大吸收波长450nm：详见下方吸收光谱）。
产品概述
Cell Counting Kit-8 (CCK-8) 利用了Dojindo开发的水溶性四唑盐—WST®-8 (2- (2-甲氧基-4-硝苯基) -3- (4-硝苯 基) -5- (2,4-二磺基苯) -2H-四唑单钠盐)，它在电子载体1-Methoxy PMS存在的情况下能够被还原成水溶性的橙黄色甲臜。 CCK-8溶液可以直接加入到细胞样品中，无需配制。CCK-8法是用于测定细胞增殖或毒性实验中活细胞数目的 一种高灵敏度，无放射性的比色检测法。WST®-8被细胞内脱氢酶氧化还原后生成的橙黄色甲臜能够溶解在培养基中 ，生成的甲臜物的数量与活细胞数量成正比。
操作步骤
本试剂盒测定方法简单，只需一瓶试剂即可操作，无需二次配制工作液，从而提高实验者的效率。
CCK-8使用例
细胞增殖实验(左)与细胞毒性实验(右)
CCK-8与LDH
Cell Counting Kit-8 与Cytotoxicity LDH Assay Kit-WST同时检测细胞毒性
检测药物： Mitomycin C
细胞: HeLa
培养基: MEM, 10% FBS
孵育条件: 37℃, 5% CO2, 48小时
检测波长: Cell Counting Kit-8 (450 nm), Cytotoxicity LDH Assay Kit-WST® (490 nm)
使用Mitomycin C 检测检测HeLa细胞毒性。通过使用Cell Counting Kit-8和Cytotoxicity LDH Assay Kit-WST® [货号: CK12]两种方法检测。Cell Counting Kit-8以细胞活性为指标，Cytotoxicity LDH Assay Kit-WST以游离的LDH为指标，实验证实两种指标检测存在差异性。二者联用，能更全面的表征细胞毒性。
WST®-8甲臜染料
WST®-8甲臜染料吸光度与续细胞数量的关系
培养基: MEM, 10%FBS(HeLa ) , RPM1640(HL60)
孵育条件:37℃, 5%CO2, 2hr (HeLa、HL60)
检测试剂:Cell Counting Kit-8
(●) 450 nm, XTT (◆) 450 nm, MTS
(▲) 490 nm, MTT(■) 570 nm
将HeLa细胞和HL60细胞以不同的细胞数接种到96孔板中，按孵育条件处理后加入以上每种试剂测定吸光度。根据细胞数量增加吸光度。CCK-8灵敏度、线性范围优于以上其他方法。
试剂稳定性比较
Cell Counting Kit-8可冷藏保存1年以上，避免试剂浪费！
试剂毒性评价
试剂本身对细胞毒性的比较
HeLa细胞在96孔板中孵育(5000个/孔)。在CO2培养箱中开始显色反应，每隔3、6、24小时在显微镜下观察细胞形态。Cell Counting Kit-8在24小时后细胞形态没有改变。在使用药物进行细胞毒性试验时，应选择测量试剂本身对细胞毒性影响更小的试剂。
3D培养检测
3D培养检测细胞毒性指南，
详见OECD Guidelines for the Testing of Chemicals, Section 4 Test No. 492
常见问题Q&A
Q1：96孔板操作实例外，24孔板，12孔板如何检测？
A1：与培养基1:10的比例加入。
Q2：如何测定空白孔？
A2：空白读值的来源有两部分，还原性物质与细胞本身活性。请确认以下细节。
·还原性物质：可在正式实验之前，在培养基中加入CCK-8和待测药物。如果变色，证明药物有还原性。正式实验检测时，请在加入CCK-8前更换培养基。
·细胞活性变化：CCK-8检测细胞活性，因此细胞活性变化，即使细胞数量不变，空白也会变化。因此需要确认细胞活性是否存在变化。
Q3：如何终止反应？
A3：有一下几种方法（96孔板）：
1、 在显色反应后，将培养板放置4℃冰箱内。
2、 每孔加10 μl 0.1 M HCL溶液。
3、 每孔加10 μl 1%（w/v）的SDS（十二烷基硫酸钠）溶液。
注意：反应停止后，应在24小时之内测定。
4、使用本公司Stop Solution for CCK-8(货号:CK13).
Q4：我可以使用450 nm以外的滤光片吗？
A4：可使用430-490nm的滤光片，450nm滤光片最优。WST-8甲臜染料吸收光谱：
Q5：CCK-8运输与保存条件？
A5：试剂在4℃下可稳定保存24个月。如需长期存放可保存-20℃，但不要反复冻融。如更换其他容器，请先进行稳定性实验，确认试剂稳定性。
Q6：一个孔中应接种多少个细胞？
A6：当使用标准96孔板时，贴壁细胞的最小接种量至少为1,000 个/孔 (100 μl 培养基)。检测白细胞时的灵敏度相对较低，因此推荐接种量不低于2,500 个/孔 (100 μl 培养基)。如果要使用24孔板或6孔板实验，请先计算每孔相应的接种量，并按照每孔培养基总体积的10%加入CCK-8溶液。
Q7：能否用384孔板进行试验？
A7：可以。向各孔中加入培养基体积10%的CCK-8溶液，如果加入的CCK-8体积太少，可以先将CCK-8溶液稀释1倍，然后加入培养基体积20%的量
Q8：能否用24孔板进行试验？
A8：可以。向各孔中加入培养基体积10%的CCK-8溶液。
Q9：酚红会影响检测吗？
A9：不会。培养基中酚红的吸光度可以在计算时，通过扣除空白孔中本底的吸光度而消去，因此不会对检测造成影响。
Q10：CCK-8与胸苷结合检测之间是否有相关性？
A10：有。然而，请注意由于CCK-8使用的检测原理与胸苷检测的不同，因此结果可能不同。
Q11：CCK-8能否检测细菌细胞？
A11：可以检测E.coli，但不能检测酵母细胞。向100 μl E.coli培养液中加入10 μl CCK-8溶液，并培养1-4个小时或过夜。但是更推荐使用我公司货号M439的：细菌活性检测试剂盒。
Q12：如何减少由于CCK-8试剂在枪头上或孔壁上的残留所带来的误差？
A12：可以在加样前用培养基稀释CCK-8试剂并混匀后加样。
Q13：CCK-8是什么颜色？
A13：应该是粉红色。若颜色不一样，有可能会影响测定。
Q14：CCK-8能否对活细胞进行染色？
A14：不能。因为CCK-8的主要成分是一种水溶性的四唑盐 (WST®-8)，并通过电子载体1-Methoxy PMS将活细胞中的电子交换到培养基中的WST®-8上。由于生成的甲臜也是高度水溶性的，因此CCK-8不能对细胞进行染色。
Q15：CCK-8检测溶液对细胞是否有毒？
A15：CCK-8溶液自身因为高浓度的1-Methoxy PMS的存在而具有一点毒性。但是，加到培养基中的CCK-8是没有毒性的，因为被稀释了10倍。因此，长时间的培养，如过夜或者培养数天是可以的。同一个细胞培养液在CCK-8检测后还可以用于其他细胞增殖检测，如结晶紫检测，中性红检测或者DNA荧光检测等。由于每种细胞对于CCK-8的耐受力都不同，因此在需要进行长时间培养时，先检测一下细胞在加入CCK-8培养后的活力。
Q16：在做加药实验时，药物对测定是否有影响？如何解决？
A16：有时会有影响。如果药物具有还原性，会和CCK-8发生显色反应，增加吸光度。解决办法：首先要确认药物是否有吸收，在含有药物的培养基中加入CCK-8，测定450 nm的吸光度，如果它的吸光度比不含药物的培养基 (加CCK-8)的吸光度高，则证明药物有影响，可在加CCK-8之前更换培养基，去掉药物的影响。
Q17：每次测定的数值不一样，是什么原因？如何解决？
A17：可能会有以下几个原因： 1. 当在培养箱内培养时，培养板最外一圈的孔最容易干燥挥发，由于体积不准确而增加误差。 一般情况下，最外一圈的孔只加培养基，不作为测定孔用。 2. 有可能会因为CCK8沾在壁上而产生误差，建议在加入CCK-8后，轻轻敲击培养板以帮助混匀。 3. 每孔的细胞数量过多或过少。请预先在1,000-100,000个/孔范围内摸索条件。
Q18：如何设定空白对照？
A18：在不含细胞的培养基中加入CCK-8，培养一定的时间，测定450 nm的吸光度即为空白对照。在做加药实验(细胞毒性实验)时，还应考虑药物的吸收，可在不含细胞，加入药物的培养基中加入CCK-8，培养一定的时间，测定450 nm的吸光度作为空白对照。
Q19：哪些物质会影响CCK-8的测定？
A19：当有还原性物质存在时会影响CCK-8的测定，例如含有维生素C的Glucose等 (一般培养基中的量不多，酚红或血清不影响测定)。在有酚红存在的情况下，会增加空白吸收，但不影响测定，扣除空白吸收即可。
Q20：在实验中吸光度值太高，如果不能减少细胞数量，如何解决？
A20：可以缩短加入CCK-8后的培养时间。例如：可以把加入CCK-8试剂后的培养时间由2小时缩短为1小时。
Q21：设定参比波长的目的是什么？必须设定吗？
A21：不一定要设定。CCK-8试剂在参比波长没有吸光度。设定参比波长的目的是为了取出由于样品混浊所带来的吸收。
Q22：说明书上仅写了96孔板的测定方法，如果使用24孔板货12孔板，应该加多少量的CCK-8试剂？
A22：一般情况下建议加入CCK-8试剂的量是培养基体积的1/10。
Q23：必须预培养细胞吗？
A23：不一定。如果要向保持细胞的最好状态，建议预培养细胞。如果不做细胞预培养，细胞内的脱氢酶可能会不稳定。也有人不做细胞预培养，但在做标准曲线和检测时需要统一检测条件。
Q24：如果加入的药物中含有金属，是否会有影响？
A24：金属对CCK-8显色有影响。当终浓度为1 Mm的氯化亚铅、氯化铁、硫酸铜会抑制5%、15%、90%的显色反应，使灵敏度降级。如果终浓度是10 Mm的话，将会100%抑制。
Q25：预培养后，更换培养基需要细胞计数吗？
A25：一般情况下用胰蛋白酶处理对数增长期的细胞，用血球计数盘计数，制备成一定浓度的细胞悬液即可。如果想要精密计数细胞的话，可以预培养后取培养基用血球计数盘进行计数。
Q26：CCK-8对于不同的细胞，灵敏度是否一样？
A26：不一样，悬浮细胞与贴壁细胞相比较难染色。对于贴壁细胞，一般加入CCK-8培养1-4小时吸光度已经很高，但对于悬浮细胞则可能吸光度较低，可以通过延长CCK-8的加入时间或增加细胞数量来解决。
Q27：悬浮细胞和贴壁细胞在数量上有何区别？
A27：悬浮细胞由于显色比较困难，一般需要增加细胞数量和延长培养时间。贴壁细胞显色比较容易，若细胞数量过大，有时吸光度会超过酶标仪的读数。
Q28：应该每次做标准曲线吗？
A28：建议每次做。虽然细胞是一样的，但是细胞的状态不一定一样，对于状态不一样的细胞，建议每次做标准曲线。如果试剂的批号不一样，灵敏度可能会有轻微的差异，对于不同的批号建议分别做标准曲线。
Q29：有时在药物作用情况下，细胞已经死亡，但是脱氢酶的活性还在，是否能计算细胞数量？
A29：不能。由于CCK-8是通过和细胞内的脱氢酶进行反应间接反映活细胞数量
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