分类： 自噬

D677/DAPRed – Autophagy Detection 细胞自噬检测试剂

D677/DAPRed – Autophagy Detection 细胞自噬检测试剂,DAPRed是一种小分子荧光染料，可以用来检测自噬体及自噬溶酶体。由于其特殊的结构，在自噬体形成双层膜结构时染料可以进入其中，并在疏水环境中产生荧光。

货号：D677
细胞自噬检测试剂盒
DAPRed – Autophagy Detection
储存条件：0-5度保存，避光
运输条件：室温

特点：

操作流程简便
与LC3结果高度一致
可以动态观察细胞自噬

关联产品TOP5

NO.1. DALGreen – Autophagy Detection 细胞自噬检测
NO.2. Cell Counting Kit-8 细胞增殖毒性检测
NO.3. Caspase-3 Assay Kit-Colorimetric- 细胞凋亡检测
NO.4. Liperfluo 细胞脂质过氧化物检测
NO.5. Mitophagy Detection Kit 线粒体自噬检测

产品概述

细胞自噬是细胞内损坏的蛋白质或细胞器降解和循环利用的过程。
DAPRed是一种小分子荧光染料，可以用来检测自噬体及自噬溶酶体。由于其特殊的结构，在自噬体形成双层膜结构时染料可以进入其中，并在疏水环境中产生荧光。
DAPRed可以进入自噬体膜而发出荧光；而DALGreen可以在自噬溶酶体产生阶段发出荧光。因此DAPRed，DALGreen可以检测从自噬体的形成到自噬溶酶体的融合以及内容物分解的整个过程。

原理

当形成自噬体膜时，DAPRed可以掺入其中，并在脂溶性环境中产生荧光。

DAPRed的检测结果与细胞自噬标志物LC3的结果有很高的相关性。

试剂概要

使用前，请确认所用仪器可以检测到的荧光特性。

操作简便

操作流程只有一步-加入试剂
无需基因转染。只需向准备好的细胞加入DAPRed染料，即可方便快捷的进行荧光检测。

实验例

DAPRed和DAL Green的共染
用自噬体荧光试剂DAPRed和自噬溶酶体荧光试剂DALGreen对HeLa细胞进行共染后，通过饥饿培养诱导自噬。

·结果

在不含氨基酸的培养基中培养的HeLa细胞，DAPRed和DALGreen荧光增强。

·检测条件
DAPRed：EX. 561 nm / Em. 600-700 nm
DALGreen：EX. 488 nm / Em. 500-563 nm
比例尺 ：20 μm

·自噬诱导条件
用DAPRed和DALGreen染色后的HeLa细胞分别在增殖型培养基和不含氨基酸的培养基中培养5 h后，用共聚焦显微镜观察。

DAPRed荧光光谱

常见问题Q&A

Q1: DAPRed Working Solution的稳定性如何？

A1: 无法长期保存，需要现配现用
Q2: DAPRed DMSO Stocking Solution的稳定性如何？

A2: 配制后请于-20℃保存，一个月内可保持稳定。另外建议根据用量分装保存。
Q3: 推荐使用的滤光片？

A3: 推荐的滤光片如下：
激发波长：500-560 nm

发射波长：690-750 nm

Q4: 如何确定细胞自噬探针DAPRed的最佳浓度？

A4:由于本试剂的特性，如果试剂的浓度太高或太低都会导致诱导自噬的样品组与未诱导自噬的对照组之间的差别不明显。建议参考以下信息摸索试剂的最佳浓度：

探针的最佳浓度根据细胞的种类而不尽相同。以DAPRed为例可以考虑从最低浓度(可以以0.05μmol/l作为参考)开始分别多个梯度至摸索至最高浓度(可以以0.4 μmol/l作为参考)的步骤进行摸索。

参考例

我们公司对HeLa, HepG2, CHO细胞的最佳浓度进行了摸索。DAPRed以下列浓度进行染色，并在无氨基酸的培养基中培养以诱导自噬。下表中红色字体的浓度可明显观察到实验组与空白组的差异。

[HeLa细胞]

[HepG2细胞]

[CHO细胞]

<检测条件>放大倍率：20倍； 激发波长：Ex：561 nm；发射波长：Em：600-700 nm

Q5: 自噬有哪些途径？DAPRed可以检测到哪些状态？

A5: 众所周知，自噬根据其分子机制可以分为两种：一种是依赖于ATG5的传统自噬(LC3发生变化），另一种则是非依赖于ATG的选择性自噬（LC3形式的转化并未发生）。
当形成自噬体膜时，DAPRed可以掺入其中，并在脂溶性环境中产生荧光。因此DAPRed可以检测自噬体的状态。

*参考资料：发现新的自噬机制Shigeomi Shimizu

https://www.dojindo.co.jp/letterj/160/review/01.html

文献链接：http://dx.doi.org/10.14348/molcells.2018.2215

▶对于首次检测的细胞类型和实验条件，请参考FAQ[如何确定细胞自噬探针DAPRed的最佳浓度]。

参考文献

No.

检测样品

检测仪器   

引用(含链接)

1)

细胞
(HUVEC)

荧光显微镜

X. Chen, X. Yan, J. Liu and L. Zhang, ” Chaiqi decoction ameliorates vascular endothelial injury in metabolic syndrome by upregulating autophagy.”, Am. J. Transl. Res., 2020,12(9), 4902.

2)

细胞
(HeLa)

荧光显微镜

H. Fang , S. Geng, M. Hao, Q. Chen, M. Liu, C. Liu, Z. Tian, C. Wang, T. Takebe, J-L Guan, Y. Chen, Z. Guo, W. He and J. Diao, “Simultaneous Zn2+ tracking in multiple organelles using super-resolution morphology-correlated organelle identification in living cells “, Nat Commun, 2021, 12(1), 109. 10.1016/j.envpol.2019.07.105.

3)

细胞
(HCT116; HCT8)

荧光显微镜

H. Sun, R. Wang, Y. Liu, H. Mei and X. Liu , “USP11 induce resistance to 5-Fluorouracil in Colorectal Cancer through activating autophagy by stabilizing VCP”, J Cancer , 2021, 12(8), 2317.

4)

细胞
(MEF)

荧光显微镜

M. Yagi, T. Toshima, R. Amamoto, Y. Do, H. Hirai, D. Setoyama, D. Kang and T. Uchiumi, “Mitochondrial translation deficiency impairs NAD+-mediated lysosomal acidification”, EMBO J, 2021, doi:10.15252/embj.2020105268.

MD01/Mitophagy Detection Kit-线粒体自噬

MD01/Mitophagy Detection Kit-线粒体自噬,线粒体 (Mitochondria) 是细胞中重要的细胞器之一，可以为细胞活力提供能量 。近年有报道去极化线粒体的积累引起的阿尔茨海默病 (Alzheimer’s Disease) 与帕金森病(Parkinson’s Disease)，可能与线粒体自噬有关。线粒体自噬是一种清除机制，可以通过自噬，将氧化应激、DNA损伤因素导致功能失调的线粒体隔离包裹成自噬体(Autophagosome)，再与溶酶体 (Lysosome) 融合后降解。本试剂盒内含Mtphagy Dye (用于检测线粒体自噬) 和Lyso Dye (溶酶体染料)。Mtphagy Dye通过化学结合，固定在细胞内的线粒体上，会发出较弱的荧光。当线粒体发生自噬，损伤的线粒体会与溶酶体融合，pH会下降，变成酸性，此时Mtphagy Dye会产生较强的荧光。如想直观观察Mtphagy Dye标记的线粒体和溶酶体的结合，可联合应用试剂盒中的Lyso Dye (标记溶酶体) 进行双染。

货号：MD01
线粒体自噬检测试剂盒
Mitophagy Detection Kit
储存条件：0-5度保存
运输条件：室温

特点：

只需添加小分子量荧光试剂即可轻松检测线粒体
可以使用荧光显微镜进行活细胞成像
可以与附着的溶酶体染色剂同时染色

选择规格：1set

凑单关联产品TOP5

NO.1. Cell Counting Kit-8 细胞增殖毒性检测
NO.2. FerroOrange 细胞亚铁离子检测
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试剂盒内含

1 set .Mtphagy Dye
. Lyso Dye		 ×1管
×1管

产品概述

线粒体 (Mitochondria) 是细胞中重要的细胞器之一，可以为细胞活力提供能量 。近年有报道去极化线粒体的积累引起的阿尔茨海默病 (Alzheimer’s Disease) 与帕金森病(Parkinson’s Disease)，可能与线粒体自噬有关。线粒体自噬是一种清除机制，可以通过自噬，将氧化应激、DNA损伤因素导致功能失调的线粒体隔离包裹成自噬体(Autophagosome)，再与溶酶体 (Lysosome) 融合后降解。本试剂盒内含Mtphagy Dye (用于检测线粒体自噬) 和Lyso Dye (溶酶体染料)。Mtphagy Dye通过化学结合，固定在细胞内的线粒体上，会发出较弱的荧光。当线粒体发生自噬，损伤的线粒体会与溶酶体融合，pH会下降，变成酸性，此时Mtphagy Dye会产生较强的荧光。如想直观观察Mtphagy Dye标记的线粒体和溶酶体的结合，可联合应用试剂盒中的Lyso Dye (标记溶酶体) 进行双染。

特点：

1）只需添加小分子量荧光试剂即可轻松检测线粒体

2）可以使用荧光显微镜进行活细胞成像

3）可以与附着的溶酶体染色剂同时染色

原理

记载了本产品的检测原理和实验例的论文请看MD01论文实验例中第四篇：Live Cell Imaging of Mitochondrial Autophagy with a Novel Fluorescent Small Molecule

实验例

1.用羰基氰化物间氯苯腙 (CCCP，一种线粒体解偶联剂) 诱导Parkin表达的HeLa细胞线粒体自噬，并通过荧光显微镜进行检测。另外，通过与线粒体染色试剂（MitoBright Deep Red:MT08）一同染色，能够区分出已发生自噬的的线粒体（白色）和未发生自噬的线粒体（紫色）（照片：右侧）。

波长：

Mtphagy Dye:561 nm (Ex)、650 LP nm (Em)

Lyso Dye:488 nm (Ex)、502-554 nm (Em)

MitoBright Deep Red:640 nm (Ex)、656-700 nm (Em)

2.荧光显微镜观察

HeLa细胞用CCCP处理，并与线粒体检测试剂（Mtphagy Dye）和线粒体染色试剂（MitoBright LT Green）共同染色，并经过一段时间（6小时）后进行检测。

<检测条件>

设备：LSM-700 Laser scanning confocal microscope (LSCM)

(Carl Zeiss, Oberkochen, Germany)

激发波长：

MitoBright LT Green 488 nm

Mtphagy Dye      555 nm

物镜：63x

拍摄时间：6小时

拍摄间隔：15秒

3.自噬诱导和线粒体膜电位变化关系的检测

用羰基氰化物间氯苯腙(CCCP，一种线粒体解偶联剂)诱导Parkin表达的HeLa细胞线粒体自噬，并使用线粒体自噬检测试剂盒（Mitophagy Detection Kit：MD01）和线粒体膜电位检测试剂盒（JC-1 MitoMP Detection Kit：MT09）观察荧光结果。

结果证实在未经CCCP处理的细胞中几乎未检测到线粒体自噬的发生，并且线粒体膜电位正常维持。 另一方面，在添加了CCCP的细胞中，证实了线粒体膜电位的降低（JC-1的红色荧光降低）和线粒体自噬的发生（Mtphagy染料的荧光增强）。

<实验条件>

■将Parkin质粒导入HeLa细胞

使用HilyMax（货号：H357）将Parkin质粒引入HeLa细胞中（Parkin质粒/HilyMax试剂：0.1 μg/0.2 μl）

过夜培养后进行检测。

■线粒体自噬检测

向表达Parkin的HeLa细胞中添加0.1 μmol/l Mtphagy工作溶液，并在37°C下孵育30分钟。然后将细胞用HBSS洗涤，加入10 μg/ml CCCP/MEM溶液，并在37℃下孵育2小时。在荧光显微镜下观察细胞。

■线粒体膜电位检测

将10 μg/ml的CCCP/MEM溶液添加至表达Parkin的HeLa细胞中，并在37℃下孵育1.5小时。加入4 μmol/l的JC-1工作液使其终浓度达到2 μmol/l，并在37℃下孵育30分钟。孵育后，将细胞用HBSS洗涤，加入成像缓冲液，并在荧光显微镜下观察细胞。

<检测条件>

■线粒体自噬检测

Ex：561 nm，Em：570-700 nm

■线粒体膜电位检测

绿色Ex：488 nm，Em：500-550 nm

红色Ex：561 nm，Em：560-610 nm

荧光特性

参考文献

序号 检测对象 使用仪器 文献
1) 细胞（HeLa） 流式细胞仪 J. Koniga,   C. Otta, M. Hugoa, T. Junga, A. L. Bulteaub, T. Grunea and A. Hohna, “Mitochondrial contribution to lipofuscin   formation”, Redox Biology, 2017, 11, 673.
2) 细胞（KB） 荧光显微镜 K. Kameyama, “Induction of mitophagy-mediated antitumor activity with   folate-appended methyl-β-cyclodextrin”, International Journal of   Nanomedicine, 2017, 12, 3433.
3) 细胞（SH-SY5Y, 初代皮质神经细胞） 荧光显微镜 E. F. Fang, T. B. Waltz, H.   Kassahun, Q. Lu, J. S. Kerr, M. Morevati, E. M. Fivenson, B. N. Wollman, K.   Marosi, M. A. Wilson, W. B. Iser, D. M. Eckley, Y. Zhang, E. Lehrmann, I. G.   Goldberg, M. S. Knudsen, M. P. Mattson, H. Nilsen, V. A. Bohr and K. G. Becker, “Tomatidine enhances lifespan and healthspan in C. elegans   through mitophagy induction via the SKN-1/Nrf2 pathway”, Scientific   Reports, 2017, 7, (46208), DOI: 10.1038/srep46208.
4) 细胞（HeLa、Parkin表达HeLa） 荧光显微镜 H. Iwashita, S. Torii, N.   Nagahora, M. Ishiyama, K. Shioji, K. Sasamoto, S. Shimizu and K. Okuma, “Live Cell Imaging of Mitochondrial Autophagy with a Novel   Fluorescent Small Molecule”, ACS Chem. Biol., 2017, 12,   (10), 2546.
5) 细胞（Cardiomyocytes） 流式细胞仪 Y. Feng, NB.   Madungwe, CV. da Cruz Junho and JC. Bopassa, “Activation of G protein-coupled oestrogen receptor 1 at   the onset of reperfusion protects the myocardium against ischemia/reperfusion   injury by reducing mitochondrial dysfunction and mitophagy.”, Br.   J. Pharmacol., 2017, 174, (23), 4329.
6) 细胞（HCT116） 荧光显微镜 K. M.   Elamin, K. Motoyama, T. Higashi, Y. Yamashita, A. Tokuda and H. Arima, “Dual targeting system by supramolecular complex of   folate-conjugated methyl-β-cyclodextrin with adamantane-grafted hyaluronic   acid for the treatment of colorectal cancer.”, Int. J. Biol.   Macromol., 2018, doi: 10.1016/j.ijbiomac.2018.02.149.
7) 细胞（Parkin-HeLa） 流式细胞仪 N. Furuya, S. Kakuta, K. Sumiyoshi, M. Ando, R. Nonaka, A. Suzuki, S. Kazuno, S. Saiki   and N. Hattori, “NDP52 interacts with   mitochondrial RNA poly(A) polymerase to promote mitophagy.”, EMBO   Rep. ., 2018, doi: 10.15252/embr.201846363.
8) 细胞（NKT） 流式细胞仪 L. Zhu, X. Xie, L.   Zhang, H. Wang, Z. Jie, X. Zhou, J. Shi, S. Zhao, B. Zhang, X. Cheng and   S. Sun, “TBK-binding protein 1 regulates   IL-15-induced autophagy and NKT cell survival”, Nature   Communications., 2018, 9, (1), doi:10.1038/s41467-018-05097-5.
9) 细胞（HeLa） 流式细胞仪 K. Araki,   K. Kawauchi, W. Sugimoto, D. Tsuda, H. Oda, R. Yoshida and K. Ohtani, “Mitochondrial protein E2F3d, a distinctive E2F3 product,   mediates hypoxia-induced mitophagy in cancer cells”, Commun   Biol., 2019, DOI: 10.1038/s42003-018-0246-9.
10) 细胞（Bovine Sertoli） 荧光显微镜 E. Adegoke, S.   Adeniran, Y. Zeng, X. Wang, H. Wang, C. Wang, H.   Zhang, P. Zheng and G. Zhang , “Pharmacological   inhibition of TLR4/NF-κB with TLR4-IN-C34 attenuated microcystin-leucine   arginine toxicity in bovine Sertoli cells.”, J Appl   Toxicol., 2019,doi: 10.1002/jat.3771.
11) 组织（小鼠） 荧光显微镜  E. F. Fang, Y.   Hou, K. Palikaras, B. A. Adriaanse, J. S. Kerr, B.   Yang, S. Lautrup, M. M. Hasan-Olive, D. Caponio, X.   Dan, P. Rocktaschel, D. L. Croteau, M. Akbari, N. H.   Greig, T. Fladby, H. Nilsen, M. Z. Cader, M. P.   Mattson, N. Tavernarakis and V. A. Bohr, “Mitophagy   inhibits amyloid-β and tau pathology and reverses cognitive deficits in   models of Alzheimer’s   disease.”, Nat. Neurosci. ., 2019,DOI:10.1038/s41593-018-0332-9.
12) 细胞（HepG2） 荧光显微镜 Iwasawa, T.   Shinomiya, N. Ota, N. Shibata, K. Nakata, I. Shiina,   and Y. Nagahara , “Novel Ridaifen-B   Structure Analog Induces Apoptosis and Autophagy Depending on Pyrrolidine   Side Chain”, Biological and Pharmaceutical   Bulletin., 2019, 42, (3), 401-410, doi: 10.1248/bpb.b18-00643.
13) 细胞（U2OS） 荧光显微镜 T. Namba, “BAP31 regulates mitochondrial function via interaction   with Tom40 within ER-mitochondria contact sites “, Sci   Adv., 2019, 5, (6), 1386.
14) 细胞（INS-1） 荧光显微镜 A.   Inamura, S. M. Hirayama, and K. Sakurai, Loss of   Mitochondrial DNA by Gemcitabine Triggers Mitophagy and Cell   Death’, Biol. Pharm. Bull.., 2019, 42, 1977.
15) 细胞（HRCEpiC, HRPTEpic） 流式细胞仪 Y. Zhao and   M. Sun, Metformin rescues Parkin protein expression   and mitophagy in high glucose-challenged human renal epithelial cells by   inhibiting NF-κB via PP2A activation., Life   Sci.., 2020, DOI:10.1016/j.lfs.2020.117382.
16) 细胞（RAES） 荧光显微镜 N. Liu, J. Wu, L. Zhang, Z. Gao,   Y. Sun, M. Yu, Y. Zhao, S. Dong, F. Lu and W. Zhang , “Hydrogen Sulphide modulating mitochondrial morphology to   promote mitophagy in endothelial cells under high‐glucose and high‐palmitate   “, J. Cell. Mol. Med., 2017, 21, (12), 3190.
17) 细胞（BAECs） 荧光显微镜 N. Kajihara, D. Kukidome, K.   Sada, H. Motoshima, N. Furukawa, T. Matsumura, T. Nishikawa and E.   Araki, “Low glucose induces mitochondrial   reactive oxygen species via fatty acid oxidation in bovine aortic endothelial   cells”, J Diabetes Investig, 2017, 8, (6), 750.
18) 细胞（HT22） 荧光显微镜 M. Jin, H. Ni and  L.   Li, “Leptin Maintained Zinc Homeostasis Against   Glutamate-Induced Excitotoxicity by Preventing Mitophagy-Mediated   Mitochondrial Activation in HT22 Hippocampal Neuronal   Cells.”, Front Neurol, 2018, 9, (9), 332.
19) 细胞（BMDMs） 流式细胞仪 D. Bhatia, K. P. Chung, K.   Nakahira, E. Patino, M. C. Rice, L. K. Torres, T. Muthukumar, A. M. Choi, O.   M. Akchurin and M. E. Choi , “Mitophagy-dependent   macrophage reprogramming protects against kidney fibrosis”, JCI   Insight, 2019, 4, (23), e132826.
20) 细胞（U2OS） 荧光显微镜 J. Zheng, D. L. Croteau, V. A.    Bohr and M. Akbari, “Diminished OPA1   expression and impaired mitochondrial morphology and homeostasis in   Aprataxin-deficient cells. “, Nucleic Acids   Res., 2019, 47, (8), 4086.
21) 细胞（HT22） 荧光显微镜 D. D. Wang, M. F. Jin, D. J. Zhao   and H. Ni, “Reduction of Mitophagy-Related   Oxidative Stress and Preservation of Mitochondria Function Using Melatonin   Therapy in an HT22 Hippocampal Neuronal Cell Model of Glutamate-Induced   Excitotoxicity”, Front Endocrinol (Lausanne), 2019, 10,   550.
22) 细胞（CD4+T-cells, HeLa） 荧光显微镜 A. Bektas, S. H. Schurman, M. G.   Freire, A. Bektas, S. H. Schurman, M. G. Freire, C. A. Dunn, A. K. Singh, F.   Macian, A. M. Cuervo, R. Sen and L. Ferrucci, “Age-associated   changes in human CD4+ T cells point to mitochondrial dysfunction consequent   to impaired autophagy.”, Aging (Albany NY)., 2019, 11,   (21), 9234-9263.
23) 细胞（ALM） 流式细胞仪 T. Nechiporuk, S.E. Kurtz, O.   Nikolova, T. Liu, C.L. Jones, A. D. Alessandro, R. C. Hill, A. Almeida, S. K.   Joshi, M. Rosenberg, C. E. Tognon, A. V. Danilov, B. J. Druker, B. H. Chang,   S. K McWeeney and J. W. Tyner, “The TP53   Apoptotic Network Is a Primary Mediator of Resistance to BCL2 Inhibition in   AML Cells.”, Cancer Discov., 2019, 9, (7), 919.
24) 细胞（PK-15） 荧光显微镜 Y. Zhang, R. Sun, X. Li  and   W. Fang, “Porcine Circovirus 2 Induction of ROS Is Responsible for Mitophagy in PK-15 Cells via Activation of Drp1 Phosphorylation”, Viruses., 2020, 12, (3), 289.
25) 细胞（HCE） 荧光显微镜 Y. Huo, W. Chen, X. Zheng, J.   Zhao, Q. Zhang, Y. Hou, Y. Cai, X. Lu and X. Jin , “The protective effect of EGF-activated ROS in human   corneal epithelial cells by inducing mitochondrial autophagy via activation   TRPM2.”, J. Cell. Physiol., 2020, DOI: 10.1002/jcp.29597.
26) 细胞（心肌细胞） 荧光显微镜 Y. Sun, F. Lu, X. Yu, B. Wang, J.   Chen, F. Lu, S. Peng, X. Sun, M. Yu, H. Chen, Y. Wang, L. Zhang, N. Liu, H.   Du, D. Zhao and W. Zhang, “Exogenous H2S   Promoted USP8 Sulfhydration to Regulate Mitophagy in the Hearts of db/db   Mice.”, Aging Dis., 2020, 11, (2), 269.
27) 细胞（HCFs） 荧光显微镜 R. Tanaka, M. Umemura, M.   Narikawa, M. Hikichi, K. Osaw, T. Fujita, U. Yokoyama, T. Ishigami, K. Tamura   and Y. Ishikawa, “Reactive fibrosis precedes   doxorubicin-induced heart failure through sterile   inflammation.”, ESC Heart Fail., 2020, 7, (2), 588.
28) 细胞（VSMCs） 荧光显微镜 C. Duan, L. Kuang, X. Xiang, J.   Zhang, Y. Zhu, Y. Wu, Q. Yan, L. Liu and T. Li, “Drp1   regulates mitochondrial dysfunction and dysregulated metabolism in ischemic   injury via Clec16a-, BAX-, and GSH- pathways “, Cell Death   Dis., 2020, 11, 251.
29) 细胞（Bovine Sertoli） 荧光显微镜 E. O. Adegoke, W. Xue, N. S.   Machebe, S. O. Adeniran, W. Hao, W. Chen, Z. Han, Z. Guixue and Z.   Peng, “Sodium Selenite inhibits mitophagy,   downregulation and mislocalization of blood-testis barrier proteins of bovine   Sertoli cell exposed to microcystin-leucine arginine (MC-LR) via TLR4/NF-kB   and mitochondrial signaling pathways blockage.”, Ecotoxicol.   Environ. Saf., 2018, 116, 165.
30) 细胞（HeLa） 荧光显微镜 D. Takahashi, J. Moriyama, T.   Nakamura, E. Miki, E. Takahashi, A. Sato, T. Akaike, K. I. Nakama and H.   Arimoto, “AUTACs: Cargo-Specific Degraders   Using Selective Autophagy. “, Mol. Cell, 2019, 76,   (5), 797.
31) 细胞（primary hepatocyte） 荧光显微镜 H. Kim, J. H. Lee and J. W.   Park, “IDH2 deficiency exacerbates   acetaminophen hepatotoxicity in mice via mitochondrial dysfunction-induced   apoptosis.”, Biochim Biophys Acta Mol Basis   Dis, 2019, 1865, (9), 2333.
32) 细胞（C3H10T1/2s） 荧光显微镜 M. S.    Rahman and Y. S.  Kim, “PINK1-PRKN   mitophagy suppression by Mangiferin promotes a brown-fat-phenotype via   PKA-p38 MAPK signalling in murine   C3H10T1/2”, Metabolism, 2020, 101, 154228.
33) 细胞（NHEKs） 荧光显微镜 S. Ikeoka   and A. Kiso  , “The Involvement of   Mitophagy in the Prevention of UV-B-Induced Damage in Human Epidermal   Keratinocytes “, J. Soc. Cosmet. Chem.   Jpn., 2020,  54(3), 252.

D675/DALGreen – Autophagy Detection 细胞自噬检测试剂

D675/DALGreen – Autophagy Detection 细胞自噬检测试剂,细胞自噬是细胞内损坏的蛋白质或细胞器降解和循环利用的过程。DALGreen是一种可以进入细胞膜检测细胞自噬的小分子脂溶性荧光染料，具有在酸性环境中产生荧光的特性，可以检测到自噬体与溶酶体融合形成的自噬溶酶体。

货号：D675
DALGreen – 细胞自噬荧光探针
DALGreen – Autophagy Detection
储存条件：-20度保存，避光
运输条件：室温

特点：

操作流程简便
与LC3结果一致性高
可以动态观察细胞自噬

选择规格：20 nmol

关联产品TOP5

NO.1. DAPRed – Autophagy Detection 细胞自噬检测
NO.2. Cell Counting Kit-8 细胞增殖毒性检测
NO.3. Mitophagy Detection Kit 线粒体自噬检测
NO.4. ROS Assay Kit 活性氧检测
NO.5. Annexin V, FITC Apoptosis Detection Kit 细胞凋亡检测

产品概述

细胞自噬是细胞内损坏的蛋白质或细胞器降解和循环利用的过程。

DALGreen是一种可以进入细胞膜检测细胞自噬的小分子脂溶性荧光染料，具有在酸性环境中产生荧光的特性，可以检测到自噬体与溶酶体融合形成的自噬溶酶体。

原理

 

 

与DAPGreen和DAPRed一样，在自噬体形成的时候染料掺入细胞膜。然后当自噬体与溶酶体融合产生酸性环境时，DALGreen的荧光增强。

试剂概要

DALGreen不仅可以用荧光显微镜检测，还可以使用流式细胞仪进行检测。DAPGreen可以用荧光酶标仪进行检测，

您可以根据自己的实验条件，使用不同的仪器进行检测。

操作特点

操作流程只有一步-加入试剂

无需基因转染。只需向准备好的细胞加入DALGreen染料，即可方便快捷的进行荧光检测。

实验例

与LC3共染

对已经表达tagRFP-LC3的MEF细胞进行DALGreen共染实验。结果显示，DALGreen的染色部位与自噬体和自噬溶酶体的标记物LC3的位置高度一致。(比例尺：10 μm)

实验的详细情况请参考如下论文：
H. Iwashita,”Small fluorescent molecules for monitoring autophagic flux”, FEBS Letters., 2018, 592, (4), 559–567.

与Lamp-1共染

对已经表达Lamp1-tagRFP的MEF细胞进行DALGreen共染实验。结果显示，DALGreen的染色部位与溶酶体膜蛋白标记物Lamp 1的位置高度一致。(比例尺：10 μm)

实验的详细情况请参考如下论文：
H. Iwashita,”Small fluorescent molecules for monitoring autophagic flux”, FEBS Letters., 2018, 592, (4), 559–567.

ULK1/2敲除细胞的评价

将野生型MEF细胞与已经敲除自噬体膜形成有关的ULK1/2的细胞株一起用雷帕霉素(Rapamycin)和氯喹(Chloroquine)刺激后进行对比实验。结果显示，在野生型细胞中明显观察到荧光增强，而敲除了ULK1/2的细胞中基本观察不到荧光的增强。

实验的详细情况请参考如下论文：
H. Iwashita,”Small fluorescent molecules for monitoring autophagic flux”, FEBS Letters., 2018, 592, (4), 559–567.

细胞延时成像

用DALGreen染色HeLa细胞后，按照下列条件从培养30分钟开始直至培养6小时一直对细胞染色状态进行观察。

・Nutrient Condition: 增殖型培养基
・Autophagic Condition: 不含氨基酸的培养基

<检测条件>
仪器：激光共聚焦高内涵细胞分筛系统(恒河电机株式会社: CQ1)
荧光滤光片：Ex.405 nm / Em.525/50 nm，倍率：20X

DALGreen与其它试剂的长时间染色实验的比较，可进行单一样品随时间变化的长期观察实验。
・由于DALGreen在自噬诱导/抑制剂之前加，所以可以实时观察自噬的进程。另外在不知道自噬诱导/抑制剂的作用时间情况下，与其它试剂相比，用DALGreen更加方便快捷。
每个时间组均需要单独制备样品

・MDC(Monodansylcadaverine)等其它试剂必须要在诱导后加，
需要摸索诱导/抑制剂的作用时间，因此需要准备多组实验，操作复杂，耗费更多的时间和实验材料。

与LC3的对比

HeLa细胞:①对照组，②饥饿诱导（诱导细胞自噬）组

DALGreen的荧光成像图和细胞自噬因子LC3-Ⅱ表达量结果的对比

结果
DALGreen：饥饿诱导组比Control组荧光增强；LC3-Ⅱ：饥饿诱导组比Control组LC3-Ⅱ表达量增加；
结果表明两者有良好的相关性。

自噬诱导条件
① Control：用培养基培养6小时
② 饥饿诱导：用不含氨基酸培养基培养6小时

DALGreen的显色条件
细胞：HeLa细胞
检测波长：Ex. 488 nm/Em. 500-563 nm
比例尺：20 μm

与MDC的对比

结果

DALGreen和MDC结果：饥饿诱导组均比Control组荧光增强；结果表明两者有良好的相关性。

波长

因为MDC的最大激发波长在紫外区，所以不能用488 nm激发。DALGreen可以采用488 nm激发。

操作

DALGreen：加染料⇒饥饿诱导

MDC ：饥饿诱导⇒加染料

由于DALGreen是在饥饿诱导前加入，因此可以动态观察到细胞自噬的过程。

常见问题Q&A

Q1: DALGreen Working Solution的稳定性如何？

A1: 无法长期保存，需要现配现用

Q2: DMSO Stocking Solution 的稳定性如何？

A2:配制后请于-20℃保存，一个月内可保持稳定。另外建议根据用量分装保存。

Q3:如何摸索DALGreen的最佳浓度？

A3 :由于本试剂的特性，如果试剂的浓度太高或太低都会导致诱导自噬的样品组与未诱导自噬的对照组之间的差别不明显。建议参考以下信息摸索试剂的最佳浓度：

DALGreen的最佳浓度根据细胞的种类而不尽相同。

可以考虑从最低浓度(可以0.1 μmol/l作为参考)开始分别多个梯度至最高浓度(可以4 μmol/l作为参考)的步骤进行摸索。

参考例

我们公司对HeLa, HepG2, CHO细胞的最佳浓度进行了摸索。DALGreen以下列浓度进行染色，并在无氨基酸的培养基中培养以诱导自噬。下表中红色字体的浓度可明显观察到实验组与空白组的差异。

A4:溶酶体染因此当溶酶体染色试剂和DALGreen共染时，溶酶体染色试剂发出的荧光与自噬小体的部分DALGreen的荧光发生重叠。
色试剂会定位于细胞内的溶酶体里。而DALGreen是在进入自噬小体后，当自噬小体与溶酶体结合后，荧光变强。Q4: 这个产品和溶酶体染色试剂有什么区别吗？

本实验的数据，请参考下面论文的Supporting Information (Fig.S5)。

H. Iwashita, “Small fluorescent molecules for monitoring autophagic flux”, FEBS Letters., 2018, 592, (4), 559–567.

论文的原文链接在本产品的网站页面上。

网站链接(日语)：

http://dominoweb.dojindo.co.jp/goodsr7.nsf/View_Display/D675?OpenDocument

Q5:推荐使用的滤光片？

A5:激发波长：350~450 nm;
发射波长：500~560 nm;
另外利用激光共聚焦显微镜的488 nm激发波长也可以检测，
请参考我们公司网站产品页面的实验例。

Q6:是否有与自噬相关的蛋白质敲除和评估的实例？

A6:与自噬小体成膜有关的ULK1和ULK2敲除的细胞与野生型细胞饥饿诱导，用DALGreen染色后评价的实例是有的。

实验结果显示，与ULK1/ULK2敲除的细胞相比，野生型细胞中的DALGreen荧光信号增大。这次实验的具体数据请参照下面这篇论文的Supporting Information (Fig. S5)

另外，自噬的标记物LC3-RFP与DALGreen的共染色结果显示，大多数的染色Puncta(斑点，位点)都高度一致。本实验的数据，请参考下面论文的Fig.1。

H. Iwashita, “Small fluorescent molecules for monitoring autophagic flux”, FEBS Letters., 2018, 592, (4), 559–567.

论文的原文链接在本产品的网站页面上。

网站链接(日语)：

http://dominoweb.dojindo.co.jp/goodsr7.nsf/View_Display/D675?OpenDocument

Q7:自噬有哪些途径？DALGreen可以检测到哪些状态？

A7:众所周知，自噬根据其分子机制可以分为两种：一种是依赖于ATG5的传统自噬(LC3发生变化），另一种则是非依赖于ATG的选择性自噬（LC3形式的转化并未发生）。

DALGreen在形成自噬体膜时掺入其中，当形成自噬溶酶体时，环境变成酸性，DALGreen荧光增强。因此，DALGreen可以检测自噬溶酶体的状态。

*参考资料：发现新的自噬机制Shigeomi Shimizu

https://www.dojindo.co.jp/letterj/160/review/01.html

文献链接：http://dx.doi.org/10.14348/molcells.2018.2215

▶对于首次检测的细胞类型和实验条件，请参考FAQ[如何确定细胞自噬探针DALGreen的最佳浓度]。

Q8:在进行延时成像时有什么要注意的地方吗？

A8:为了确定最佳实验条件，请先进行预实验。

由于试剂的特性，刚刚染色后有荧光值升高的趋势，因此请参照以下步骤进行预实验和延时成像。

1. 预实验

– 使用对照细胞(不诱导自噬的细胞)。

– 根据说明书的步骤用Working Soluiton染色后，用培养基洗涤2次。

– 加入正常培养基后，观察荧光随时间的变化。

– 如下图所示，染色后的细胞在荧光强度阶段性降低之后，确认荧光强度变化趋于稳定的时间段（图中的T）。

※条件可能因细胞种类而异。

(参考)

HeLa细胞的话，染色后约60分钟后，荧光确定会趋于稳定(DALGreen)。

2. 延时染色成像

– 细胞用Working Solution染色后，在培养基中37℃培养。

※培养时间为预实验中摸索出的染色时间。

※染色后不要立刻进行自噬诱导。

-培养后进行自噬诱导并开始延时染色成像。

(参考)

用DALGreen对HeLa细胞进行染色，在正常的培养基中培养60分钟(预实验中摸索的时间)后，进行自噬诱导。

参考文献

No.

检测样品

检测仪器

引用(含链接)

1)

细胞
(HeLa, MEF)

荧光显微镜

H. Iwashita, H. T. Sakurai, N. Nagahora, M. Ishiyama, K. Shioji, K. Sasamoto, K. Okuma, S. Shimizu, and Y. Ueno, “Small fluorescent molecules for monitoring autophagic flux.”, FEBS Letters., 2018, 592, (4), 559–567.

2)

细胞
(HeLa)

荧光显微镜

T. Sakata, A. Saito and H. Sugimoto, “In situ measurement of autophagy under nutrient starvation based on interfacial pH sensing.”, Scientific Reports., 2018, 8, 8282. 

3)

细胞
(HS-MM)

荧光显微镜

Y. Egawa, C. Saigo, Y. Kito, T. Moriki and T. Takeuchi , “Therapeutic potential of CPI-613 for targeting tumorous mitochondrial energy metabolism and inhibiting autophagy in clear cell sarcoma.”, PLoS One., 2018, 13, (6), e0198940.

4)

细胞
(HaCaT)

荧光显微镜

S. Abe, S. Hirose, M. Nishitani, I. Yoshida, M. Tsukayama, A. Tsuji and K. Yuasa , “Citrus peel polymethoxyflavones, sudachitin and nobiletin, induce distinct cellular responses in human keratinocyte HaCaT cells.“, Biosci. Biotechnol. Biochem. ., 2018, 82, (12), 1347.

5)

细胞
(KGN)

荧光显微镜

W. Yuping, M. Congshun, Z. Huihui, Z. Yuxia, C. Zhenguo and W. Liping, “Alleviation of endoplasmic reticulum stress protects against cisplatin-induced ovarian damage.”, Reprod. Biol. Endocrinol., 2018,doi: 10.1186/s12958-018-0404-4.

6)

细胞
(BmN)

荧光显微镜

S. Xue, F. Mao, D. Hu, H. Yan, J. Lei, E. Obeng, Y. Zhou, Y. Quan, and W. Yu, “Acetylation of BmAtg8 inhibits starvation-induced autophagy initiation.”, Mol. Cell Biochem., 2019,doi: 10.1007/s11010-019-03513-y.

7)

细胞
(HeLa)

荧光显微镜

F. Hongbao,Y. Shankun, C. Qixin, L. Chunyan, C. Yuqi, G. Shanshan, B. Yang, T. Zhiqi, L. Z. Amanda, T. Takanori, C.Yuncong, G. Zijian, H. Weijiang and D. Jiajie , “De Novo-Designed Near-Infrared Nanoaggregates for Super-Resolution Monitoring of Lysosomes in Cells, in Whole Organoids, and in Vivo.”, ACS Nano, 2019, 13, (12), 1446.

8)

细胞
(RT-7)

流式细胞仪

E. Sasabe, A. Tomomura, N. Kitamura and T. Yamamoto, “Metal nanoparticles-induced activation of NLRP3 inflammasome in human oral keratinocytes is a possible mechanism of oral lichenoid lesions.”, Toxicol In Vitro., 2020, 62, 104663.

9)

细胞
(骨髓细胞)

荧光显微镜

J. Xia, Y. He, B. Meng, S. Chen, J. Zhang, X. Wu, Y. Zhu, Y. Shen, X. Feng, Y. Guan, C. Kuang, J. Guo, Q. Lei, Y. Wu, G. An, G. Li, L. Qiu, F. Zhan and W. Zhou, “NEK2 induces autophagy-mediated bortezomib resistance by stabilizing Beclin-1 in multiple myeloma.”, Mol Oncol, 2020, DOI: 10.1002/1878-0261.12641.

10)

细胞
(Human L2)

荧光显微镜

Q. Xu, W. Shi, P. Lv, W. Meng, G. Mao, C. Gong, Y. Chen, Y. Wei, X. He, J. Zhao, H. Han, M. Sun and K. Xiao, “Critical role of caveolin-1 in aflatoxin B1-induced hepatotoxicity via the regulation of oxidation and autophagy.”, Cell Death Dis., 2020, 11(1), 6.

11)

细胞
(心肌细胞)

荧光显微镜

L Cui, LP Zhao, JY Ye, L Yang, Y Huang, X.P. Jiang, Q. Zhang, JZ. Jia, DX. Zhang and Y. Huang, “The Lysosomal Membrane Protein Lamp2 Alleviates Lysosomal Cell Death by Promoting Autophagic Flux in Ischemic Cardiomyocytes.“, Front Cell Dev Biol, 2020,DOI:10.3389/fcell.2020.00031.

12)

细胞
(IPEC-J2)

荧光显微镜

Y Yang, J Huang, J Li, H Yang and Y. Yin, “The Effects of Butyric Acid on the Differentiation, Proliferation, Apoptosis, and Autophagy of IPEC-J2 Cells..”, Curr. Mol. Med., 2020, 20(4), 307.

13)

细胞 (成纤维细胞、肾脏上皮细胞)

荧光显微镜

M. M. Ivanova, J. Dao, N. Kasaci, B. Adewale, J. Fikry and O. G. Alpan  , “Rapid Clathrin-Mediated Uptake of Recombinant α-Gal-A to Lysosome Activates Autophagy”, Biomolecules , 2020,  10(6), 837.

14)

细胞 (NHEKs)

荧光显微镜

S. Ikeoka and A. Kiso  , “The Involvement of Mitophagy in the Prevention of UV-B-Induced Damage in Human Epidermal Keratinocytes “, J. Soc. Cosmet. Chem. Jpn., 2020,  54(3), 252.

15)

细胞
(HeLa)

荧光显微镜(超分辨率)

Q. Chen, M. Hao, L. Wang, L. Li, Y. Chen, X. Shao, Z. Tian, R. A. Pfuetzner, Q. Zhong, A. T. Brunger, J. Guan and J. Diao,“Prefused lysosomes cluster on autophagosomes regulated by VAMP8″, 2021, doi:10.1038/s41419-021-04243-0.

D676/DAPGreen – Autophagy Detection 细胞自噬检测试剂

货号：D676
DAPGreen – 细胞自噬荧光探针
DAPGreen – Autophagy Detection
储存条件：-20度保存，避光
运输条件：室温

特点：

操作流程简便
与LC3结果高度一致
可以动态观察细胞自噬

选择规格：5nmol

关联产品TOP5
NO.1. Cell Counting Kit-8 细胞增殖毒性检测
NO.2. Mitophagy Detection Kit 线粒体自噬检测
NO.3. Calcein-AM/PI Double Staining Kit 活死细胞双染
NO.4. Liperfluo 细胞脂质过氧化物检测
NO.5. Annexin V, FITC Apoptosis Detection Kit 细胞凋亡检测

产品概述

DAPGreen是一种小分子荧光染料，可以用来检测自噬体及自噬溶酶体。由于其特殊的结构，在自噬体形成双
层膜结构时染料可以进入其中，并在疏水环境中产生荧光。DAPGreen具有很好的细胞透膜性，通过荧光显微
镜可进行活细胞荧光成像，也可使用流式细胞仪进行定量检测。

原理

当形成自噬体膜时，DAPGreen可以掺入其中，并在脂溶性环境中产生荧光。

DAPGreen的检测结果与细胞自噬标志物LC3的结果有很高的相关性。

试剂概要

DAPGreen不仅可以用荧光显微镜检测，还可以使用流式细胞仪进行检测。

同时也实现了用荧光酶标仪进行检测，您可以根据自己的实验条件，使用不同的仪器进行检测。

*DAPGreen和DALGreen不能共染

操作简便

操作流程只有一步-加入试剂

只需向准备好的细胞加入DAPGreen染料，即可方便快捷的进行荧光检测。

实验例

与LC3高度相关           
与自噬标准物LC3的细胞共染实验结果的比较。

检测条件：DAPGreen：Ex. 488 nm / Em. 500-563 nm

比例尺：10 μm
将DAPGreen加入已表达tagRFP-LC3的Hela细胞中，用雷帕霉素（Rapamycin）诱导自噬4 h后，用共聚焦显微镜观察DAPGreen和RFP的荧光成像。结果DAPGreen与tagRFP-LC3的染色部位高度一致。

与Lamp-1共染

对已经表达Lamp1-tagRFP的MEF细胞进行DAPGreen共染实验。结果显示，DAPGreen的染色部位与溶酶体膜蛋白标记物Lamp 1的位置高度一致。(比例尺：10 μm)

实验的详细情况请参考如下论文：
“Small fluorescent molecules for monitoring autophagic flux”, FEBS Letters., 2018, 592, (4), 559–567.

流式细胞仪的定量分析

自噬诱导后，通过流式细胞仪检测DAPGreen的荧光。

检测条件：
检测波长：Ex. 488 nm / Em. 500-560 nm

DAPGreen染色HeLa细胞后，在不含氨基酸的培养基中培养0、3和6 h，用流式细胞仪检测。结果，在饥饿诱导3 h后可以检测到更强的荧光信号。

荧光酶标仪的定量检测

用荧光酶标仪检测自噬诱导后DAPGreen的荧光。

检测条件

检测波长：Ex. 450 nm / Em. 535 nm

DAPGreen染色HeLa细胞后，在不含氨基酸的培养基中分别培养0、2、4、6 h，用荧光酶标仪检测。结果饥饿诱导2 h检测荧光，饥饿诱导组的荧光强度大约是对照组的3.5倍。

有关检测操作的详细信息，请参考FAQ“使用荧光酶标仪进行定量分析的检测条件是什么？”。

应用例：荧光显微镜的数值化

96孔板中接种HeLa细胞，并用DAPGreen染色后，分别更换含有血清和不含血清的培养基后继续培养。培养后分别通过视野内的平均荧光强度进行计算。结果发现，不含血清的培养基培养的细胞中DAPGreen的荧光强度更高。

<检测条件>

Ex：488 nm, Em: 500-550 nm

物镜： CFI Plan Apochromat VC 20x

拍摄模式： Resonant Scanner

XY分辨率：512×512

<使用装置>

荧光显微镜：Nikon 激光共聚焦显微镜A1R

分析软件：NIS-Elements

＜实验步骤＞

1. 将HeLa细胞播种于96孔板中并培养。

2. 去除培养基，用无血清培养基清洗1次。

3. 添加配置好的DAPGreen working solution ，37℃ 培养30 min。

4. 去除培养基，用无血清培养基清洗2次。

5. 诱导自噬的孔中加入无血清培养基，正常孔中加入正常培养基。37℃培养6小时(之后用4%PFA固定)。

6. 荧光显微镜观察。

按上述条件拍摄后，再用100倍物镜放大后拍摄，对细胞内的DAPGreen的荧光信号进行统计。结果显示，含有血清的培养基培养的细胞中平均每个细胞有1.5个信号，而不含血清的培养基培养的细胞中平均每个细胞有27个信号。

<检测条件>

Ex : 488 nm, Em : 500-550 nm

物镜： CFI Plan Apochromat TIRF 100xC Oil

拍摄模式： Galvano Scanner

XY分辨率：512×512

<使用装置>

荧光显微镜：Nikon 激光共聚焦显微镜A1R

分析软件：NIS-Elements

*本数据由DAPGreen的使用客户友情提供。

DAPGreen荧光光谱

激发滤光片：425-475 nm
荧光滤光片：500-560 nm

常见问题Q&A

Q1: DAP Green working solution的稳定性如何？

A1：无法长期保存，需要现配现用

Q2: DMSO stocking solution 的稳定性如何？

A2：配制后请于-20℃保存，一个月内可保持稳定。另外建议根据用量分装保存。

Q3: 推荐使用的滤光片？

A3：激发波长：425-475 nm

发射波长：500-560 nm

利用激光共聚焦显微镜的488 nm激发波长也可以检测，请参考我们公司网站产品页面的实验例。

Q4: 在进行延时成像时有什么要注意的地方吗？

4：为了确定最佳实验条件，请先进行预实验。

由于试剂的特性，刚刚染色后有荧光值升高的趋势，因此请参照以下步骤进行预实验和延时成像。

1. 预实验

使用对照细胞(不诱导自噬的细胞)。

根据说明书的步骤用 Working Soluiton染色后，用培养基洗涤2次。

加入正常培养基后，观察荧光随时间的变化。

如下图所示，染色后的细胞在荧光强度阶段性降低之后，确认荧光强度变化趋于稳定的时间段（图中的T）。

※条件可能因细胞种类而异。

(参考)

HeLa细胞染色约60分钟后，荧光会趋于稳定(DAPGreen)。

2. 延时染色成像

– 细胞用Working Solution染色后，在培养基中37℃培养。

※培养时间为预实验中摸索出的染色时间。验中摸索出的染色时间。

※染色后不要立刻进行自噬诱导。

-培养后进行自噬诱导并开始延时染色成像。

(参考)

用DAPGreen对HeLa细胞进行染色，在正常的培养基中培养60分钟(预实验中摸索的时间)后，进行自噬诱导。

Q5: 如何确定细胞自噬探针DAPGreen的最佳浓度？

A5: 由于本试剂的特性，如果试剂的浓度太高或太低都会导致诱导自噬的样品组与未诱导自噬的对照组之间的差别不明显。建议参考以下信息摸索试剂的最佳浓度：

探针的最佳浓度根据细胞的种类而不尽相同。以DAPGreen为例可以考虑从最低浓度(可以以0.05 μmol/l作为参考)开始分别多个梯度至摸索至最高浓度(可以以0.4 μmol/l作为参考)的步骤进行摸索。

参考例：

我们公司对HeLa, HepG2, CHO细胞的最佳浓度进行了摸索。DAPGreen以下列浓度进行染色，并在无氨基酸的培养基中培养以诱导自噬。下表中红色字体的浓度可明显观察到实验组与空白组的差异。

[HeLa细胞]

[HepG2细胞]

[CHO细胞]

Q6: 使用荧光酶标仪进行定量分析的检测条件是什么？

A6:以下是使用HeLa细胞进行检测的实验例。

将DAPGreen染色的HeLa细胞在不含氨基酸的培养基中分别培养0、2、4、6 h，用荧光酶标仪检测。

<操作>

1）将细胞接种在透明底的黑板上（HeLa细胞，1.6×104 cells/孔，100 µl/孔）

2）在37°C，5％ CO2培养箱过夜培养

3）去除上清液后，在培养基中加入100 µl配制好的Working Solution(DAPGreen：0.1 µmo/l）。

4）在37°C，5％ CO2培养箱培养30 min

5）用100 µl培养基清洗细胞2次

6）加入100 µl饥饿培养基（Waco，Code：048-33575）

7）在37°C下培养各时间点

8）用荧光酶标仪（TECAN，Infinite Pro M200）检测（Ex/Em = 450 nm/530 nm）

（0 h对照组用HBSS代替检测）

<检测条件>波长：Ex. 450 nm/Em. 535 nm

饥饿诱导2 h检测荧光，确认到饥饿诱导组的荧光强度大约是对照组的2.5倍。

Q7: 自噬有哪些途径？DAPGreen可以检测到哪些状态？

A7:众所周知，自噬根据其分子机制可以分为两种：一种是依赖于ATG5的传统自噬(LC3发生变化），另一种则是非依赖于ATG的选择性自噬（LC3形式的转化并未发生）。

当形成自噬体膜时，DAPGreen可以掺入其中，并在脂溶性环境中产生荧光。因此DAPGreen可以检测自噬体的状态。

*参考资料：发现新的自噬机制Shigeomi Shimizu

https://www.dojindo.co.jp/letterj/160/review/01.html

文献链接：http://dx.doi.org/10.14348/molcells.2018.2215

▶对于首次检测的细胞类型和实验条件，请参考FAQ[如何确定细胞自噬探针DAPGreen的最佳浓度]。

参考文献

No.

检测样品

检测仪器

引用(含链接)

1)

细胞
(HeLa, MEF)

荧光显微镜

H. Iwashita, H. T. Sakurai, N. Nagahora, M. Ishiyama, K. Shioji, K. Sasamoto, K. Okuma, S. Shimizu, and Y. Ueno, “Small fluorescent molecules for monitoring autophagic flux.”, FEBS Letters., 2018, 592, (4), 559–567.

2)

细胞
(HepG2; Huh-7)

荧光显微镜;流式细胞仪

 L. Hu, T. Zhang, D. Liu, G. Guan, J. Huang, P. Proksch, X. Chen and W. Lin, “Notoamide-type alkaloid induced apoptosis and autophagy via a P38/JNK signaling pathway in hepatocellular carcinoma cells”, RSC Adv., 2019, 9, 19855.

3)

细胞
(HepG2)

荧光显微镜

Q. Chu, S. Zhang, M. Chen, W. Han, R. Jia, W. Chen and X. Zheng, “Cherry Anthocyanins Regulate NAFLD by Promoting Autophagy Pathway”, Oxid Med Cell Longev., 2019,DOI:10.1155/2019/4825949.

4)

细胞
(HLMVEC)

 荧光显微镜

Q. Chu, S. Zhang, M. Chen, W. Han, R. Jia, W. Chen and X. Zheng, “Cherry Anthocyanins Regulate NAFLD by Promoting Autophagy Pathway”, Oxid Med Cell Longev., 2019,DOI:10.1155/2019/4825949.

5)

细胞
(HeLa)

荧光显微镜

F. Hongbao,Y. Shankun, C. Qixin, L. Chunyan, C. Yuqi, G. Shanshan, B. Yang, T. Zhiqi, L. Z. Amanda, T. Takanori, C.Yuncong, G. Zijian, H. Weijiang and D. Jiajie , “De Novo-Designed Near-Infrared Nanoaggregates for Super-Resolution Monitoring of Lysosomes in Cells, in Whole Organoids, and in Vivo.”, ACS Nano, 2019, 13, (12), 1446.

6)

细胞
(HeLa; A375)

 流式细胞仪

B. Yang, L. Ding, Y. Chen and J. Shi, “Augmenting Tumor-Starvation Therapy by Cancer Cell Autophagy Inhibition”, Adv. Sci., 2020,DOI:10.1002/advs.201902847.

7)

细胞
(PC12)

荧光显微镜(超分辨率)

Y. Tan, L. Yin, Z. Sun, S. Shao, W. Chen, X. Man,Y. Du and Y. Chen, “Astragalus polysaccharide exerts anti-Parkinson via activating the PI3K/AKT/mTOR pathway to increase cellular autophagy level in vitro.”, Int. J. Biol. Macromol., 2020, DOI:10.1016/j.ijbiomac.2020.02.282.

8)

细胞
(Wild type Hepa 1-6)

荧光显微镜

(用ImageJ软件数值化)

J. Kim, W.Y.Chee, N. Yabuta, K. Kajiwara, S. Nada and M. Okada, “Atg5-mediated autophagy controls apoptosis/anoikis via p53/Rb pathway in naked mole-rat fibroblasts”, Biochem. Biophys. Res. Commun., 2020, 22, DOI:10.1016/j.bbrc.2020.05.083.

9)

细胞
(小鼠皮肤成纤维细胞)

流式细胞仪

J. Kim, W.Y.Chee, N. Yabuta, K. Kajiwara, S. Nada and M. Okada, “Atg5-mediated autophagy controls apoptosis/anoikis via p53/Rb pathway in naked mole-rat fibroblasts”, Biochem. Biophys. Res. Commun., 2020, 22, DOI:10.1016/j.bbrc.2020.05.083.

10)

细胞
(HeLa)

荧光显微镜(超分辨率)

Q. Chen, M. Hao, L. Wang, L. Li, Y. Chen, X. Shao, Z. Tian, R. A. Pfuetzner, Q. Zhong, A. T. Brunger, J. Guan and J. Diao, “Prefused lysosomes cluster on autophagosomes regulated by VAMP8″,2021, doi:10.1038/s41419-021-04243-0.