Microbial Viability Assay Kit-WST试剂盒货号：M439

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NO.1.    Cell Counting Kit-8    细胞增殖毒性检测

NO.2.    Calcein-AM/PI Double Staining Kit    活死细胞双染检测

NO.3.    Cell Viability Assay Kit    细胞增殖/毒性检测

NO.4.    NAD/NADH Assay Kit-WST    NAD/NADH检测

NO.5.    Biofilm Formation Assay    生物被膜形成量/抑制能力检测

    使用水溶性四唑盐WST-8作为显色物质的微生物比色法检测试剂盒。微生物通过能量代谢活动在细胞内生成NAD(P)H，WST-8在电子载体的作用下被NAD(P)H还原成水溶性的甲臜产物(橙色)。甲臜产物的生成量与微生物的能量代谢活性成正比例关系。因此，可以通过橙色的显色程度确认微生物的存活率和活性。

本产品由同仁化学研究所与日本福冈县工业技术中心生物食品研究所共同开发。

    传统的微生物活力检测一般采用克隆形成实验(Colony Formation Assay)或通过增殖造成的混浊等目视评价方法。这些方法需要的时间很长而且操作繁杂需要一定的熟练度才可以成功检测。而使用本试剂盒检测大肠杆菌时，相对于传统寒天培地法长达22小时的检测时间，本试剂盒仅需要8小时即可检测。(1 CFU/ml)

操作上更加简单快捷，培养后只需要加入试剂即可。检测时，在96孔板内准备好微生物悬浊液后加入试剂，在培养箱内通过微生物代谢活性开始显色。

大肠杆菌的增殖检测例

<检测步骤>

1.将大肠杆菌(NBRC3972)在TSBYE培养基中进行预培养。 2.用Mueller-Hinton(以下略称为MHB)配制成108 CFU/ml的大肠杆菌悬浊液，再用MHB制成10倍稀释系列悬浊液。 3.使用多通道移液器将不同菌体密度的大肠杆菌加入至96孔板中(每孔190 μl)。 4.使用多通道移液器向各孔中加入10 μl显色试剂。 5.为了防止蒸发和污染，用透明密封贴(PCR用等)贴在孔板上，置于酶标仪(VersaMax, 日本Molecular Devices)中。 6.用动力学测定模式(Kinetics)每隔15 min检测一次460 nm处吸光度直至24 h。(37℃)

<检测结果和定量性的确认>

下图是随时间变化的大肠杆菌检测的结果。96孔板的最左列是高密度(约108 CFU/ml)，

越往右密度越低，大约每隔1 h各列依次开始显色。

下图是图表化的大肠杆菌检测的结果。以“达到可以目视的吸光度值0.5所需要的时间(h)”为y轴，以各菌体密度(CFU/ml)为x轴作图。如下面的直线关系式，确认检测大肠杆菌的定量性。

y= -0.43Ln(x)+8.01

当x =1时，即1CFU/ml时，y =8.01。因此得知，1个微生物的检测大约需要8 h。也就是说，经过大约8 h培养后，吸光度如果没变化的话可以判定大肠杆菌阴性。

用容易分辨的“颜色”代替难以分辨的“浑浊度变化”

麦氏(McFarland)比浊法是通过菌液中的浑浊度来判断活菌数浓度的方法。而本试剂盒是通过颜色的变化检测活菌数的浓度。因肉眼的极限，使用比浊法无法判断的低浓度细菌活性，可以用灵敏度更高的本试剂盒进行检测。

下面是使用微生物定量法检测水溶性维他命之一的维他命B6的检测例。与传统的比浊法相比，可以在更短时间内更灵敏的进行定量。

维他命B6的微生物定量例

<检测步骤>

1.向96孔板的各孔中加入90 μl维他命定量用培养基。 2.向96孔板的各孔中加入90 μl标准溶液或样品溶液。 3.将10 μl配置好的各种需要维他命的菌种液和10 μl检测试剂加入孔中，30℃或37℃下培养一段时间。 4.将孔板置于酶标仪，使用终点(End Point)模式检测460 nm处吸光度。加入传统法的检测试剂，检测610 nm处的吸光度(浑浊度)。

使用微生物：Saccharomyces cerevisiae ATCC9080

使用培养基：维他命B6定量用基础培养基

培养温度：30℃

标准物质：吡哆醇盐酸盐

<检测结果和定量性的确认>

下图是本方法(WST法)和传统法的直线性的比较结果。本方法在培养24 h时，0.02~1 ng/ml的浓度范围内呈直线性。而传统法在培养24 h时，灵敏度仍达不到检测标准，需要将培养时间延长至48 h才能与本方法进行比较。

药物耐受性的实验例

<检测步骤>

1.将金黄葡萄菌(SA)和耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(MRSA)分别播种至96孔板中。然后添加各浓度的抗生素。 2.在37℃下培养6 h，添加试剂后再培养2 h进行显色反应。

<检测结果和定量性的确认>

SA：Staphylococcus aureus

MRSA：Methicilin-resistant Staphylococcus aureus

与传统抗菌性能实验(Spot-on-lawn法)的对比

抗菌性能检测的应用例

同时使用传统的Spot-on-lawn法(以下简称Spot法)和WST法进行抗菌性能对比实验。Spot法需要用目视的方法确认阻止圆的有无，而且检测所需的时间也更长。WST法的检测结果与传统法的结果相关性一致，而且可以在更短的时间内完成检测。下面是Spot法和WST法的抗菌性能检测实例。

用4种检定菌和待测样本共5种乳酸菌的培养上清液作为检测样本，筛选出具有产生抗菌能力的乳酸菌。

其中乳链菌肽(Nisin)生产菌之一的Lactobacillus lactis NBRC12007作为阳性对照，Lactobacillus lactis NBRC100933作为阴性对照。

为了分离出上清液中的抗菌物质，将乳酸菌培养上清液(pH 6.5-6.8)过滤并灭菌，然后用MHB培养基制备稀释系列，37℃培养6 h。

添加检测试剂之后， 37℃培养2 h。结果显示传统法与WST法相关性一致。

检测针对4种检定菌的24个供体的时候，Spot法需要12枚dish(每个dish8个检测点)，检测时间需要20 h以上。而使用WST法检测时只需要1块96孔板，8 h左右即可完成检测。

微生物通过能量代谢活动在细胞内生成NAD(P)H，WST-8在电子载体的作用下被NAD(P)H还原成水溶性的甲臜产物(橙色)。甲臜产物的生成量与微生物的能量代谢活性成正比例关系。因此，可以通过橙色的显色程度确认微生物的存活率和活性。