特点:
● 固定后仍可检测
● 荧光滞留性强
● 灵敏度高
产品概述
线粒体利用氧气合成ATP,从而产生细胞所需的能量,是重要的细胞器之一。线粒体活性低下和机能障碍与癌症、老化、阿尔茨海默病、帕金森病等神经变性疾病密切相关。因此,线粒体膜电位(MMP)作为线粒体相关疾病的一个有希望的靶点已被广泛研究。
产品特点
解决传统试剂的三个问题
观察线粒体膜电位时,使用JC-1、TMRE、TMRM,但由于PFA不可固定、容易淬灭,数据的再现性等问题。MT-1 MitoMP Detection Kit是克服了这些问题的线粒体膜电位的检测试剂。
并且,通过本试剂盒中包含的Imaging Buffer,可以在抑制了荧光背景和对细胞的损伤的状态下进行观察。
①固定后也可检测
由于微小的细胞状态的变化,也会造成线粒体膜电位发生变化,所以取得数据的重现性需要特别注意。通用的线粒体膜电位检测试剂(JC-1、TMRE)如果对细胞进行固定处理的话会失去荧光,所以需要使用活细胞进行迅速的测定。MT-1即使进行染色后进行PFA固定操作,也能保持荧光,因此可以进行高重复性的实验。
②可监控
没有进行药物刺激的细胞通过各种试剂染色,确认了荧光强度的变化。结果,JC-1和TMRE在染色后约10分钟左右荧光强度下降,MT-1仍保持了一定的荧光强度
③高灵敏度
线粒体膜电位的细微变化在JC-1中有难以检测的情况,在这种情况下,使用四甲基罗丹明乙酯(TMRE)监测MMP。MT-1可提供与TMRE同等的检测灵敏度。
与各种试剂的比较
实验例
1.通过去极化的实验例
通过线粒体去极化剂的cyanide-p-trifluoromethoxyphenylhydrazone (FCCP)处理HeLa细胞,用该试剂观察膜电位的变化。
结果,确认了FCCP处理的细胞线粒体膜电位下降的情况。
2.凋亡诱导细胞线粒体膜电位的变化
预先在MT-1中染色的HL60细胞中添加Etoposide,诱导凋亡后,与Annexin V、FITC Conjugate一同染色,并通过流式细胞仪检测。
结果发现Annexin V-FITC产生的荧光强度变化(绿色荧光强度的增加)确认了凋亡的发生,以及从MT-1产生的荧光强度变化(红色荧光强度的降低)发现了线粒体膜电位的变化。
常见问题Q&A
Q1:使用荧光显微镜检测时需要注意什么? |
A1:请尽量减少激发光照射时间并提高检测灵敏度。
细胞长期暴露于激发光内可能导致细胞损伤和荧光染料降解,请优化检测时间。 |
Q2:MT-1检测后可以固定吗? |
A2:应使用4%多聚甲醛(PFA)固定,且不能与(Triton X-100、NP-40等)一起使用,因为这可能导致染泄漏。 |
Q3:固定后可以对细胞染色吗? |
A3:由于MT-1在线粒体中的积累取决于线粒体膜电位,因此固定后不适用于染色。 |
Q4:是否需要做阳性对照? |
A4:作为阳性对照,可在技术手册中找到使用FCCP(羰基氰化物-对三氟甲氧基苯腙)的实验例。 |
Q5:优化染色条件时,应使用何种浓度的MT-1染料 |
A5:MT-1染料的浓度建议稀释1000倍。但在优化染色条件时,请参考以下内容。 <荧光强度弱> 请优化以下浓度:稀释500-1000倍。 <观察到非特异性吸附> 请优化以下浓度:稀释1000至2000倍。 |
Q6:我可以使用缓冲液来制备MT-1工作溶液吗? |
A6:可以使用Hanks的HEPES和HBSS。也可以使用MEM、RPMI和含10%FBS的MEM制备。 |
Q7:添加MT-1工作液后,可以不清洗直接上机检测吗? |
A7:染色后,无需清洗即可观察样品。但我们不建议在不清洗的情况下长期观察它们,因为它们可能具有细胞毒性。
我们建议去除上清液并用培养基替换。 |
Q8:MT-1染色后,是否可以用PBS代替HBSS来清洗? |
A8:我们建议使用HBSS来减少细胞损伤。如果您没有HBSS,我们建议使用培养基来代替清洗。 |