产品资料 – DNA修饰酶与克隆技术 – DNA 修复蛋白

切割错配核酸内切酶 I

#M0678S 4,000 units

产品特点

NEB代理 , DNA修饰酶与克隆技术 , DNA 修复蛋白

• DNA 核酸内切酶

• 催化切割一些 DNA 错配（T:T，G:G 和 G:T）

• 在两条链上错配碱基 5’端的第三个磷酸二酯键处切割，切割后产生 5 bp 粘性末端，含 3′-OH 和 5′- 磷酸

• 对于 T 错配切割效果最好；无法识别所有类型的 DNA 错配

产品描述

切割错配核酸内切酶 I 是一种依赖 Mg²⁺ 的 DNA 核酸内切酶，可特异切割错配碱基对（T:T、G:G 和 T:G 错配）。切割错配核酸内切酶 I 在两条链上错配碱基 5’端的第三个磷酸二酯键处切割，切割后产生 5 bp 粘性末端。切割错配核酸内切酶 I 优先切割的 DNA 错配为:T:T、G:G 和 T:G，也可轻松切割 T:I、G:I 和 G:U 错配。此外，实验证明：切割错配核酸内切酶 I 在 T:C 类型的 DNA 错配中可在含 T 的链上形成切刻。该酶还能切割 DNA:RNA 杂交链上的 T:G 和 T:U 错配，但其切割效率低于 DNA:DNA 错配。

图 1.切割错配核酸内切酶 I 能够切割双链 DNA 上的 T:T、G:T 和 G:G 错配

（A）构建四个在同一位点包含特定突变质粒（p1-p4），使用差异磷酸化引物（正向或反向）扩增生成 8 个双链 PCR 片段，长度约 672 bp （ds1-ds8）。经 Monarch PCR & DNA 纯化试剂盒（NEB #T1030）纯化后，使用 5 units Lambda 核酸外切酶，经37℃孵育 60 分钟，以特异性降解双链片段中的磷酸化链（2.2 µg），从而产生一系列单链（正链/负链），同一位点碱基为 A/T/C/G。随后使用 Monarch PCR & DNA 纯化试剂盒（NEB #T1030）对这些单链片段（ss1-ss8）进行纯化。

（B）将纯化后的含有 A/T/C/G 的单链片段进行混合，可形成精准配对的 DNA（绿色 √ 框）或含单碱基错配的双链片段（黄色 × 框）。为了生含错配碱基的双链，在下述条件下，选择特定的正/反义链进行混合：在 1X NEBuffer 2.1 中重新退火，加热至 95℃，再冷却至室温。上述实验可产生 8 种 DNA 错配（A:A、A:C、A:G、C:C、C:T、G:G、G:T、T:T）。（C）如下方法检测该酶切割 dsDNA 中特定错配的能力：在 200 ng 含错配的 dsDNA 中加入 80 units 切割错配核酸内切酶 I，37℃孵育 30 分钟。后将产物进行琼脂糖（1.2%）凝胶电泳并用溴化乙锭染色观察。

图 2.切割错配核酸内切酶 I 能够切割双链 DNA 上的 T:T、G:T 和 G:G 错配

使用前端带有 FAM 荧光标记（蓝色示踪染料），末端带有 ROX 荧光标记（红色示踪染料）的双链 DNA 片段与80 units 切割错配核酸内切酶 I（+M0678）在 NEBuffer r2.1 中，37℃孵育 30 分钟，用于测定切割错配核酸内切酶 I 切割 dsDNA 中特定错配的能力。样品经毛细管电泳分析显示：酶解样品（+M0678 样品）与未经酶处理的样品（-M0678）相比，T:T、G:T 和 G:G 错配的底物峰发生偏移。此外，在 30 分钟内即可看到 T:C 错配中的含 T 链（蓝色链）出现一些轻微切割。该酶在 T:C 错配底物上的切刻活性随着时间的推移而增加（最多 18 小时，本数据未显示）。