货号：SG03
细胞衰老检测试剂盒SPiDERβGal
Cellular Senescence Detection Kit – SPiDER-βGal
储存条件：0-5度保存
运输条件：室温
特点：
活细胞和固定细胞均可染色
可用共聚焦显微镜或流式细胞仪检测
可固定后与抗体共染色
选择规格：5assays
凑单关联产品TOP5
NO.1. Cell Counting Kit-8 细胞增殖毒性检测
NO.2. Mitophagy Detection Kit 线粒体自噬
NO.3. Cell Cycle Assay Kit 细胞周期检测
NO.4. Caspase-3 Assay Kit -Colorimetric 细胞凋亡检测
NO.5. Cellstain- Hoechst 33342 solution 细胞核染色检测
试剂盒内含
5 assays
[5 assays: 35 mm dish]
SPiDER-BGal X1
Bafilomycin A1 X1
产品概述
正常细胞的DNA损伤是由细胞的不断分裂和氧化应激引起。在没有修复DNA损伤的情况下，为了抑制细胞的癌化，需要不可逆地终止DNA损伤细胞的分裂。细胞衰老是一种可以不可逆地终止DNA损伤细胞分裂的状态，它可以抑制DNA受损细胞的生长。SA-β-gal (细胞衰老β-半乳糖苷酶)在衰老细胞中过表达，被广泛作为细胞衰老的标识之一。用X-gal染色检测SA-β-gal是一种常用的方法，但此方法存在几个缺点：
1)由于细胞透膜性差，需要固定细胞。
2)由于很难区分染色细胞和未染色细胞，所以定量困难。
3)染色时间长。
本试剂盒检测SA-β-gal灵敏度高，方法简便。SPiDER-βGal是一种检测β-gal的新型试剂，具有细胞透膜性高，胞内荧光维持时间长的特点。本试剂盒不仅可以特异性地检测到活细胞中的SA-β-gal(用Bafilomycin A1抑制内源性β-galactosidase的活性)，也可以检测到固定细胞中的SA-β-gal(用McIlvaine缓冲液 (pH 6.0)。由于SPiDER-βGal和SA-β-gal反应后会产生很强且持续的荧光，因此SPiDER-βGal可被用于流式细胞仪来进行定量分析。
原理
由于该试剂盒中的β-半乳糖苷酶检测试剂SPiDER-βGal具有细胞膜通透性，因此无需特别的细胞膜通透性处理或固定细胞，即可直接检测活细胞。穿透细胞膜的SPiDER-βGal通过与SA-β-gal反应发出荧光，并会与附近的蛋白质共价结合。另外，通过在加SPiDER-βGal之前，添加试剂盒内含的Bafilomycin A1，可抑制活细胞中内源性β-半乳糖苷酶的活性，并且抑制背景的状态下检测到SA-β-gal的荧光。
荧光特性
SPiDER-βGal和β-半乳糖苷酶反应的激发和发射光谱图
<推荐波长>
Ex：500~540 nm
Em：530~570 nm
用共聚焦显微镜或流式细胞仪（请选择488 nm激发波长）
操作步骤
产品优势
特点1：适用于活细胞和固定细胞
检测固定化细胞时，不需要添加Bafilomycin A1，按照说明书记载的操作流程检测SA-βgal。
*活细胞添加Bafilomycin A1的原因：请参阅常见问题“为什么添加Bafilomycin A1？”。
特点2：可定量检测
细胞衰老与细胞周期
细胞衰老与细胞周期之间的关系
阿霉素（DOX）会作用于细胞周期的G2/M期，抑制细胞增殖，并诱导细胞衰老。将DOX加入A549细胞后，G2/M期的峰值升高 (Cell Cycle Assay Solution Blue and Deep Red)衰老指标SA-β-gal增强（细胞衰老检测试剂盒-SPiDER-βGal）以及细胞线粒体膜电位降低(JC-1 MitoMP Detection Kit)。
实验例
与其他细胞衰老标记物的共染色
本实验是使用本试剂盒对细胞衰老的常用模型多次传代的Wl38细胞 (Passage 的 SA-βgal 进行检测的实例a）。与其他的细胞衰老标记物γH2AX DNA损伤标记物）的免疫染色b），以及全细胞的核染色（DAPI）c）。SA-βgal和γH2AX两种细胞衰老标记物的实验结果相关性得到了验证。d）
1）将传代1次和10次的Wl 38细胞按照本试剂盒的说明书的“活细胞检测”步骤进行SA-βgal染色。
2）添加4% PFA/PBS，室温培养15 min。
3）PBS清洗细胞3次。
4）加入0.1% Triton X 100/PBS，室温培养30 min。
5）PBS清洗细胞3次。
6）添加1% BSA/PBS，室温培养1 h。
7）用1% BAS/PBS稀释过的抗γH2AX抗体（兔源）加入至细胞后，过夜培养。
8）PBS清洗细胞3次。
9）用1% BAS/PBS稀释过的抗兔二抗（Alexa Fluor 647）加入至细胞后，室温培养2 h。
10）PBS清洗细胞3次。
11）用PBS稀释至 2μg/ ml 的 DAPI 溶液 同仁货号： D523]加入到细胞中，室温培养10 min 。
12）PBS 清洗细胞3 次，用激光共聚焦显微镜观察。
固定WI-38细胞中SA- β-gal与DNA损伤标记物共染
SPiDER-βGal工作液配制
用pH 6.0的McIlvaine 缓冲液稀释SPiDER-βGal DMSO储存液2,000倍。
*固定操作和细胞膜通透性可能会导致灵敏度降低（图1），如果您需要更高的信号，可以将McIlvaine buffer稀释SPiDER-βGal DMSO储存液的倍数调整为500-1000倍（图2）。
McIlvaine buffer（pH6.0）的制备
将3.7ml 0.1 mol/l的柠檬酸溶液和6.3ml 0.2 mol/l的磷酸钠溶液混合。确认pH为6.0，如pH不是6.0，则可通过添加柠檬酸溶液或磷酸钠溶液来调价pH。使用超纯水将该缓冲液稀释5倍。
染色步骤（35 mm 培养皿）
1. 在35 mm 培养皿中接种细胞后，在37℃，5％ CO2培养箱中过夜培养。
2. 去除培养基，用2 ml PBS洗涤1次后，加入2 ml 4％的多聚甲醛(PFA)/PBS溶液，在室温固定3 min。
*避免延长培养时间，否则容易导致SA-β-gal活性降低
3. 去除上清液，用2 ml HBSS洗涤3次。
4. 加入2 ml SPiDER-βGal工作液后，在37℃培养30 min。
＊用固定细胞检测SA-β-gal时，请不要使用5％ CO2培养箱。如果使用5％ CO2培养箱，SPiDER-βGal工作液会变成酸性，与内源性β-galactosidase发生反应，背景会上升，很难区分正常细胞和衰老细胞。
5. 去除上清液，用2 ml PBS洗涤2次。
6.在细胞中加入0.1% Triton X-100/PBS，并在室温下培养30分钟。
7.用PBS洗涤细胞2次。
8.向细胞中加入1% BSA/PBS，并在室温中培养1小时。
9.向细胞中加入1% BSA/PBS稀释的抗γ-H2AX抗体（小鼠），并在4℃孵育过夜。
10.用PBS洗涤细胞3次。
11.向细胞中加入1％BSA/PBS稀释的抗小鼠二抗（Cy5），并在室温下孵育1小时。
12.用PBS洗涤细胞两次，并在荧光显微镜下观察。
SA-β-gal检测T细胞（悬浮细胞）
爱媛大学医学院Masakatsu Yamashita教授的研究小组表明，一种叫做menin的蛋白质可以控制T细胞的衰竭和衰老，并维持其正常的免疫功能。
这次通过使用的SPiDER-βGal染色结果确认，我们证实了在白细胞介素2（IL-2）的存在下，对敲除Menin蛋白的CD8阳性细胞通过刺激TCR（T细胞受体），会发生细胞衰老。
染色条件：
① SPiDER-βGal 方法
② X-gal 方法
*数据由爱媛大学医学系Masakatsu Yamashita教授提供
用共聚焦成像细胞仪进行定量用
用共聚焦成像细胞仪（横河电机株式会社CQ1 ）进行衰老细胞定量分析。
■与其他细胞衰老标记物共染色用
SPiDER-βGal 对 SA-β-gal 进行活细胞染色并进行细胞固定和膜透过处理后，对DNA损伤标志物γH2AX进行免疫荧光染色的 WI-38 细胞，通过共聚焦定量成像细胞仪进行定量和分析。
定量解析
散点图（Scatter Plot）
使用SPiDER-βGal对SA-β-gal 进行染色，其荧光强度作为 Y 轴，以 γ H2AX 的面积与每个细胞核的面积的比值作为 X 轴做成散点图的定量分析。
活细胞荧光染色的分析
X-gal法需要用目视观察总细胞数和衰老细胞的个数，并人工计算衰老细胞的阳性比率。
而使用共聚焦定量成像细胞仪时，用核染色剂（Hoechst 33342）来计数总细胞数 SPiDER-βGal对 SA-β-gal 进行染色来计算衰老细胞数，即可获得衰老细胞的阳性比率。
横河电机
CQ01 拍摄条件
使用孔板：96 孔板
物镜：10 倍
拍摄波长：405 nm Hoechst 33342 Cyan
488 nm （SPiDER-βGal Green）
视野：8视野
*SA-β-gal阳性Wl-38细胞（红色轮廓）
WI-38细胞中的SA-β-gal阳性细胞比例的差异取决于传代次数。与使用X-gal染色方法的手动计数操作相比，使用共聚焦可以快速分析数据。
SA-β-gal的荧光成像
1. 在35 mm μ-Dish（ibidi公司) 中分别接种传代数为0代和12代的Wl-38细胞 (5×10^4 个/dish、 10％ FBS、1％青霉素-链霉素的MEM培养基) 后，在37℃、5％ CO2培养箱中过夜培养。
2. 去除培养基，用2 ml HBSS洗涤1次。
3. 加入1 ml Bafilomycin A1工作液后，在37℃，5％ CO2培养箱中培养1 h。
4. 将1 ml SPiDER-βGal 工作液和1 μl浓度为1 mg/ml 的Hoechst 33342溶液混合后加入培养皿中，在37℃、5％ CO2培养箱中培养30 min。
5. 去除上清液，用2 ml HBSS洗涤2次.
6. 加入2 ml HBSS后，用共聚焦荧光显微镜观察(激发波长：488 nm，发射波长：500-600 nm)。
用流式细胞仪定量分析SA-β-gal阳性细胞
1. 在35 mm μ-Dish (ibidi公司) 中分别接种传代数为1代和12代的Wl-38细胞(1×105 个/dish，含有10％ FBS，1％青霉素-链霉素的MEM培养基)后，在37℃、5％ CO2培养箱中过夜培养。
2. 去除培养基，用2 ml HBSS洗涤1次。
3. 加入1 ml Bafilomycin A1工作液后，在37℃、5％ CO2培养箱中培养1 h。
4. 加入1 ml SPiDER-βGal工作液后，在37℃，5％ CO2培养箱中培养30 min。
5. 去除上清液，用2 ml HBSS洗涤2次。
6. 用胰蛋白酶消化细胞，将细胞用MEM培养基 (含有10%的FBS、1%的青霉素-链霉素)重悬。
7. 用流式细胞仪检测 (激发波长：488 nm，发射波长：515-545 nm)。
常见问题Q&A
Q1: 本试剂盒的大概可以检测多少次？
A1:大概的检测次数，请参考下表中不同的使用容器：
| 35mm dish | Micro Plate | Chamber Slide | |
| 使用次数 | 5 dishes | 2 plates | 7 slides |
*使用次数会随着每孔添加的染色溶液量的变化而变化。使用前请先确认每孔的必要的染色溶液量。
Q2: 为什么要添加Bafilomycin A1？
A2：很多细胞内部都存在内源性β-半乳糖苷酶 (β-galactosidase)，由于SPiDER-βGal与内源性β-半乳糖苷酶和细胞衰老的标记物SA-β-Gal都会发生反应。即使在没有衰老的细胞中，背景也较高，妨碍了SA-β-Gal的检测。
Bafilomycin A1可以抑制溶酶体中的ATPase活性，并将溶酶体中的pH从酸性变为接近中性，从而降低了内源性β-半乳糖苷酶的活性。因此，在添加SPiDER-βGal之前先用Bafilomycin A1处理细胞，使得SPiDER-βGal可以与SA-β-gal反应，并对衰老细胞进行荧光染色。
下图显示了添加和不添加Bafilomycin A1时检测SA-β-gal的差异。
由于Bafilomycin A1也被用作自噬的抑制剂。使用时，请考虑是否会对实验体系有影响，如果有影响，建议固定细胞。细胞固定时，缓冲液会控制细胞内的pH，所以不需要使用Bafilomycin A1。可以参照操作说明书中的步骤进行染色。
Q3: DMSO stock solution 可以稳定保存多久？
A3: SPiDER-βGal DMSO stock solution和Bafilomycin A1 DMSO stock solution配制后，-20℃可以稳定保存1个月。
Q4: Working solution可以稳定保存多久？
A4: SPiDER-βGal working solution和Bafilomycin A1 working solution无法长期保存，请现配现用。
Q5: 做细胞衰老的荧光观察时有哪些注意事项？
A5: 随着细胞的衰老，被称为脂褐素(Lipofuscin)的不溶性物质会在细胞中积聚。 脂褐素自身会产生荧光，进而增加荧光背景。 在这种情况下，我们建议您准备不含SPiDER-βGal的样品，以准确评估衰老细胞中的SA-β-gal活性。
流式细胞仪检测
・测定“衰老细胞”和“正常细胞”的平均荧光强度（MFI）
①添加了SPiDER-βGal的细胞
②未添加SPiDER-βGal的细胞 (背景)
・“①的平均荧光强度”减去“②的平均荧光强度”
用扣除背景后的SA-β-gal的荧光来表征SA-β-gal的活性。
a：SA-β-gal活性（衰老细胞）：＝①的平均荧光强度 – ②的平均荧光强度
b：SA-β-gal活性（正常细胞）：＝①的平均荧光强度 – ②的平均荧光强度
・通过比较上述a和b的值来评价SA-β-gal的活性。
另外，通过a减去b的差值可以确定细胞衰老所引起的SA-β-gal活性的变化。
荧光显微镜检测
・首先，使用未添加SPiDER-βGal的衰老细胞进行荧光观察。
・调整灵敏度（Gain等），直至来生自脂褐素的荧光（背景）不影响荧光图像为止。
・在相同的成像条件下，再对添加了SPiDER-βGal的细胞或正常细胞进行荧光观察。
Q6: 细胞固定后还可以对SA-β-gal进行染色吗？
A6: 可以。如果固定细胞，则不需要用Bafilomycin A1预处理细胞，但是需要制备pH调节至6的Mcllvain Buffer。详细的操作请参考操作说明书。
Q7: 请问是否有细胞固定后进行流式细胞仪操作的具体步骤？
A7: 可以。但是请注意细胞固定可能会影响SA-β-gal（请参考下面的*2）
以下的实验例供作参考。
WI-38细胞固定后，进行SA-β-gal检测和γ-H2AX (DNA损伤标志物)的免疫染色。
<实验操作>
(1) 将WI-38细胞播种至35 mm dish，37℃，5% CO2培养箱中过夜培养。
(2) 去除上清，加入2 ml 4% Paraformaldehyde/PBS溶液，室温培养3 min*1。
(3) 用2 ml PBS清洗细胞3次。
(4) 添加2 ml SPiDER-βGal working solution *2, 37℃培养30 min*3。
(5) 用2 ml PBS清洗细胞2次。
(6) 加入2 ml 0.1% Tritox X-100/PBS, 室温培养30 min。
(7) 用2 ml PBS清洗细胞2次。
(8) 加入 2ml 1% BSA/PBS溶液，室温培养1 h。
(9) 用1% BSA/PBS溶液稀释过的抗γ-H2AX IgG(小鼠来源)，加入至细胞后室温培养1 h (10) 用2 ml PBS清洗细胞3次。
(11) 用1% BSA/PBS溶液稀释过的抗小鼠IgG(Cy5标记)，加入至细胞后室温培养1 h。
(12)去除上清，用2 ml PBS清洗细胞2次后进行荧光显微镜观察。
*1 细胞固定时间越长，对SA-β-gal活性的影响越高。
*2 细胞固定操作有可能会降低SA-β-gal的活性。如果检测SA-β-gal时，荧光强度较弱，请尝试将SPiDER-βGal DMSO stock solution 稀释500-1000倍使用。通常SPiDER-βGal DMSO stock solution 建议用Mcllvaine buffer (pH 6.0)稀释2,000倍使用。
*3 培养时不使用5% CO2培养箱。细胞固定后使用5% CO2培养箱的话，缓冲液会变为酸性，从而使得内在性β-galactosidase的活性上升，导致背景升高，无法辨别衰老细胞和年轻细胞的内的SA-β-gal活性的差值。
<实验数据>
图1. 免疫染色前后SPiDER-βGal染色的荧光强度变化
通过比较免疫染色前后的SPiDER-βGal的荧光强度，可以发现固定后的免疫染色过程中SPiDER-βGal的荧光强度降低了。
图2. 不同稀释倍率的SPiDER-βGal染色结果 (免疫染色后)
红色：SPiDER-βGal 蓝色：γ-H2AX <曝光时间: 1.5 s>
通过将SPiDER-βGal工作溶液的稀释比从2000倍更改为666倍，可以确认通过免疫染色（固定化）降低的SPiDER-βGal荧光强度与免疫染色前的强度相当。
Q8: 染色操作后发现荧光很弱，无法观察，请问是否有改善的方法？
A8: 请确认如下三个注意事项。
①使用的滤光片是否与染色试剂匹配。
<推荐的滤光片>
· 荧光显微镜：激发(500-540 nm)，荧光(530-570 nm)
· 流式细胞仪：激发(488 nm), 荧光(500-540 nm)
②各working solution是否为现配现用。
③延长染色时间
添加SPiDER-βGal working solution后，培养30 min后无法观察到荧光的话，考虑延长至45-60 min再进行荧光观察。
Q9: 确认含有SA-β-Gal的细胞染色后，是否可以进行细胞固定？
A9: 可以。建议使用4%的多聚甲醛进行细胞固定。
Q10: 培养基中的血清和酚红是否会影响检测？
A10: 培养基中的血清和酚红对SA-β-gal的检测没有影响。
Q11：衰老细胞和正常细胞没有差异时，应该怎么确认？
A11： STEP1：优化显微镜的观察条件。
STEP2：如果优化观察条件仍无法解决，请对染色条件进行优化。
STEP1＜优化显微镜的观察条件＞
如果衰老细胞和对照组细胞之间的荧光强度没有差异，请按照以下步骤进行调整。
1. 观察对照组细胞，通过降低激发光强度，Gain值或缩短曝光时间等条件将仪器调节至可以观察到微弱荧光的状态。
(共聚焦显微镜：调整Gain值、激发光强度 落射型显微镜：调整曝光时间)
2. 慢慢增强激发光强度，延长曝光时间，观察衰老细胞的荧光变化，寻找到衰老细胞和对照组细胞之间的最大荧光差异的条件。
·如果两者荧光没有差异，请参考STEP2。
※请使用玻璃底的培养皿容器观察。
STEP2<染色条件的优化>
根据不同的细胞种类，可能需要调整SPiDER-βGal的染色时间和工作液浓度。
以下为最佳条件的参考数据。
染色时间：10-60 min
染色浓度：说明书中1/2-2倍的浓度
分别加入不同浓度的工作液，并调整不同的染色时间，寻找到衰老细胞和对照组细胞之间的最大荧光差异的条件。
*如果观察的细胞数少的话，有可能灵敏度不够。必要时，需要调整细胞数量
Q12.如何准备药物阳性对照组
A12：参考如下案例
衰老诱导（阿霉素处理的WI-38细胞）
1.将第3代的WI-38细胞（1×10^6细胞/皿，MEM，10％胎牛血清，1％青霉素-链霉素）接种在10 cm培养皿中，并在5％CO2中于37℃培养箱中培养过夜。
2.除去培养基，并用10 ml PBS洗涤细胞一次。
3.用无血清MEM制备0.2μmol/ L的阿霉素。 如果没有无血清的培养基，可以使用含血清的培养基。
4.向培养皿中加入阿霉素（10 mL），并在5％CO2培养箱中于37℃培养3天。
5.除去上清液，并用10 ml PBS洗涤细胞一次。
6.向培养皿中加入MEM（10％胎牛血清，1％青霉素-链霉素），并在5％CO2恒温箱中于37℃培养3天。
7.除去培养基，并用10 ml PBS洗涤细胞一次。
8.胰酶消化细胞，分别用阿霉素和不用阿霉素处理。
固定细胞成像
1.在8孔ibidi中准备细胞进行测定，并在5％CO2恒温箱中于37℃过夜培养细胞。
2.除去培养基。 用PBS洗涤细胞一次。 向细胞中加入4％多聚甲醛（PFA）/ PBS溶液，并在室温下孵育3分钟。
3.除去上清液。 用PBS洗涤细胞两次。
4.混合SPiDER-βGal工作溶液（2 mL）和1mg / mL Hoehst 33342（2μl）。 将混合溶液（200μl）加入孔中，并在37℃孵育30分钟。
*我们建议不要在固定细胞实验中使用5％CO2培养箱。如果在5％CO2培养箱中进行培养，则缓冲液的pH值可能会呈酸性。 酸性pH导致内源性β-半乳糖苷酶活性的背景升高，因此很难区分正常细胞和衰老细胞。
5.除去上清液。 用PBS洗涤细胞两次。
6.在荧光显微镜下观察细胞。
